Name: Análisis de disfunción contráctil cardíaca y transitorios de Ca2+ en miocitos de roedores (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Aprende a medir la función contráctil y los transitorios de calcio en miocitos de rata mediante detección de longitud de sarcómero. Este protocolo permite estudiar la insuficiencia cardíaca y evaluar respuestas a agentes terapéuticos.

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Este trabajo cuenta con el apoyo de la subvención R01 HL144777 (MVW) de los Institutos Nacionales de Salud (NIH).

<ol><li>Reihle, C., Bauersachs, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+animal+models+of+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Small animal models of heart failure.</a> Cardiovascular Research. 115 (13), 1838-1849 (2019).</li>
<li>Peter, A. K., Bjerke, M. A., Leinwand, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+the+cardiac+myocyte+in+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Biology of the cardiac myocyte in heart disease.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (14), 2149-2160 (2016).</li>
<li>Rossman, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+frequency-dependent+responses+represent+the+pathophysiologic+signature+of+contractile+failure+in+human+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Abnormal frequency-dependent responses represent the pathophysiologic signature of contractile failure in human myocardium.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 36 (1), 33-42 (2004).</li>
<li>McDonald, K. S., Hanft, L. M., Robinett, J. C., Guglin, M., Campbell, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+myofilament+contractile+function+in+human+donor+and+failing+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Regulation of myofilament contractile function in human donor and failing hearts.</a> Frontiers in Physiology. 11, 468(2020).</li>
<li>Ravichandran, V. S., Patel, H. J., Pagani, F. D., Westfall, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+contractile+dysfunction+and+protein+kinase+C-mediated+myofilament+phosphorylation+in+disease+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac contractile dysfunction and protein kinase C-mediated myofilament phosphorylation in disease and aging.</a> The Journal of General Physiology. 151 (9), 1070-1080 (2019).</li>
<li>Chaudhary, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+myocardial+Ca2%2B+cycling+after+left+ventricular+assist+device+support+in+failing+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Altered myocardial Ca2+ cycling after left ventricular assist device support in failing human heart.</a> Journal of the American College of Cardiology. 44 (4), 837-845 (2004).</li>
<li>Walker, C. A., Spinale, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+and+function+of+the+cardiac+myocyte%3A+A+review+of+fundamental+concepts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">The structure and function of the cardiac myocyte: A review of fundamental concepts.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 118 (2), 375-382 (1999).</li>
<li>Lang, S. E., Westfall, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into cardiac myocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1299, 177-190 (2015).</li>
<li>Davis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+heart+performance+by+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Designing heart performance by gene transfer.</a> Physiological Reviews. 88 (4), 1567-1651 (2008).</li>
<li>Sweitzer, N. K., Moss, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+loaded+shortening+velocity+in+single+cardiac+myocytes+permeabilized+with+a-hemolysin%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Determinants of loaded shortening velocity in single cardiac myocytes permeabilized with a-hemolysin.</a> Circulation Research. 73 (6), 1150-1162 (1993).</li>
<li>Yasuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unloaded+shortening+increases+peak+of+Ca2%2B+transients+but+accelerates+their+decay+in+rat+single+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Unloaded shortening increases peak of Ca2+ transients but accelerates their decay in rat single cardiac myocytes.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (2), 470-475 (2003).</li>
<li>Racca, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+properties+of+developing+human+fetal+cardiac+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Contractile properties of developing human fetal cardiac muscle.</a> The Journal of Physiology. 594 (2), 437-452 (2016).</li>
<li>Kim, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+protein+expression+and+basal+lamina+remodeling+in+human+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clinical+Applications%22%5BJournal%5D)">Differential protein expression and basal lamina remodeling in human heart failure.</a> Proteomics Clinical Applications. 10 (5), 585-596 (2016).</li>
<li>Eckerle, L. G., Felix, S. B., Herda, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+antibody+effects+on+cellular+function+of+isolated+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measurement of antibody effects on cellular function of isolated cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e4237(2013).</li>
<li>Robbins, H., Koch, S. E., Tranter, M., Rubinstein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+and+future+of+probenecid%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The history and future of probenecid.</a> Cardiovascular Toxicology. 12 (1), 1-9 (2012).</li>
<li>Sakthivel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+analysis+of+cardiac+troponin+I+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro analysis of cardiac troponin I phosphorylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 703-714 (2005).</li>
<li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B-ATPase+during+progression+of+left+ventricular+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Downregulation of sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase during progression of left ventricular hypertrophy.</a> The American Journal of Physiology. 272 (5), 2416-2424 (1997).</li>
<li>Sonnenblick, E. H., Spiro, D., Spotnitz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ultrastructure+basis+of+Starling%27s+law+of+the+heart%3A+the+role+of+the+sarcomere+is+determining+ventricular+size+and+stroke+volume%5BTitle%5D)+AND+%22American+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">The ultrastructure basis of Starling's law of the heart: the role of the sarcomere is determining ventricular size and stroke volume.</a> American Heart Journal. 68 (3), 336-346 (1964).</li>
<li>Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blebbistatin+extends+culture+life+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+and+allows+efficient+and+stable+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 294 (4), 1667-1674 (2008).</li>
<li>Zak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+myofibrillar+proteins+in+the+normal+and+hypertrophic+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Metabolism of myofibrillar proteins in the normal and hypertrophic heart.</a> Basic Research in Cardiology. 72 (2-3), 235-240 (1977).</li>
<li>Palmer, B. M., Thayer, A. M., Snyder, S. M., Moore, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shortening+and+%5BCa2%2B%5D+dynamics+of+left+ventricular+myocytes+isolated+from+exercise-trained+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Shortening and [Ca2+] dynamics of left ventricular myocytes isolated from exercise-trained rats.</a> Journal of Applied Physiology. 85 (6), 2159-2168 (1998).</li>
</ol>

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos u otros conflictos de intereses.

El protocolo de estimulación crónica descrito en el paso 1 extiende el tiempo útil para estudiar miocitos aislados y evaluar el impacto de tratamientos más largos. En nuestro laboratorio, se obtuvieron resultados consistentes hasta 4 días después del aislamiento al medir la función contráctil utilizando la longitud del sarcómero en miocitos de ritmo crónico. Sin embargo, la función contráctil de los miocitos se deteriora rápidamente cuando se usan medios mayores de 1 semana para marcar el ritmo de los miocitos.
<p cl...

El análisis de la función de la bomba cardíaca a menudo requiere una variedad de enfoques para obtener una visión adecuada, especialmente para modelos animales de insuficiencia cardíaca (IC). La ecocardiografía o las mediciones hemodinámicas proporcionan información sobre la disfunción cardíaca in vivo 1, mientras que los enfoques in vitro a menudo se emplean para identificar si la disfunción surge de cambios en el miofilamento y / o el transitorio Ca2+ responsable de acoplar la excitación, o el potencial de acción, con la función contráctil (por ejemplo, acoplamiento excitación-contracción [E-C]). Los enfoques in vitro también brindan la oportunidad de detectar la respuesta funcional a las neurohormonas, las alteraciones genéticas inducidas por vectores, así como los posibles agentes terapéuticos2 antes de seguir estrategias de tratamiento in vivo costosas y / o laboriosas.
Existen varios enfoques para investigar la función contráctil in vitro, incluyendo mediciones de fuerza en trabéculasintactas 3 o miocitos permeabilizados4, así como acortamiento descargado y transitorios de Ca2+ en miocitos intactos en presencia y ausencia de HF 5,6. Cada uno de estos abordajes se centra en la función contráctil de los miocitos cardíacos, que es directamente responsable de la función de la bomba cardíaca 2,7. Sin embargo, el análisis de la contracción y el acoplamiento E-C se realiza con mayor frecuencia midiendo el acortamiento de la longitud muscular y los transitorios de Ca 2+ en miocitos adultos aislados tolerantes a Ca2+. El laboratorio utiliza un protocolo detallado publicado para aislar miocitos de corazones de ratas para este paso8.
Tanto el transitorio Ca2+ como los miofilamentos contribuyen al acortamiento y re-alargamiento en los miocitos intactos y pueden contribuir a la disfunción contráctil 2,7. Por lo tanto, este enfoque se recomienda cuando el análisis funcional in vitro requiere un miocito intacto que contenga la maquinaria ciclista Ca2+ más los miofilamentos. Por ejemplo, los miocitos aislados intactos son deseables para estudiar la función contráctil después de modificar la función cíclica del miofilamento o Ca2+ a través de la transferencia de genes9. Además, se sugiere un enfoque de miocitos intactos para analizar el impacto funcional de las neurohormonas cuando se estudia el impacto de las vías de señalización del segundo mensajero aguas abajo y / o la respuesta a los agentes terapéuticos2. Una medición alternativa de la fuerza dependiente de la carga en miocitos individuales se realiza con mayor frecuencia después de la permeabilización de la membrana (o despellejamiento) a bajas temperaturas (≤15 ° C) para eliminar la contribución transitoria de Ca2+ y centrarse en la función del miofilamento10. La medición de la fuerza dependiente de la carga más los transitorios de Ca2+ en miocitos intactos es rara debido en gran parte al desafío complejo y técnico del enfoque11, especialmente cuando se necesita un mayor rendimiento, como para medir las respuestas a la señalización de neurohormonas o como pantalla para agentes terapéuticos. El análisis de las trabéculas cardíacas supera estos desafíos técnicos, pero también puede estar influenciado por no miocitos, fibrosis y/o remodelación de la matriz extracelular2. Cada uno de los enfoques descritos anteriormente requiere una preparación que contenga miocitos adultos porque los miocitos neonatales y los miocitos derivados de células madre pluripotentes inducibles (iPSC) aún no expresan el complemento completo de proteínas de miofilamentos adultos y generalmente carecen del nivel de organización de miofilamentos presente en elmiocito 2 en forma de bastón adulto. Hasta la fecha, la evidencia en iPSCs indica que la transición completa a isoformas adultas excede más de 134 días en cultivo12.
Dado el enfoque de esta colección en la IC, los protocolos incluyen enfoques y análisis para diferenciar la función contráctil en miocitos intactos fallidos versus no defectuosos. Se proporcionan ejemplos representativos de miocitos de rata estudiados 18-20 semanas después de una coartación suprarrenal, descrita anteriormente 5,13. Luego se hacen comparaciones con miocitos de ratas tratadas con simulacro.
El protocolo y la plataforma de imágenes descritos aquí se utilizan para analizar y monitorear los cambios en el acortamiento y los transitorios de Ca2+ en los miocitos cardíacos en forma de bastón durante el desarrollo de IC. Para este análisis, 2 x 104 Ca 2+-tolerantes, miocitos en forma de bastoncillos se colocan en cubreobjetos de vidrio recubiertos de laminina (CS) de22 mm2 y se cultivan durante la noche, como se describió anteriormente8. Los componentes ensamblados para esta plataforma de imágenes, junto con los medios y búferes utilizados para una imagen óptima, se proporcionan en la Tabla de materiales. Aquí también se proporciona una guía para el análisis de datos utilizando un software y los resultados representativos. El protocolo general se divide en subsecciones separadas, con las tres primeras secciones centradas en miocitos de rata aislados y análisis de datos, seguidas de experimentos transitorios celulares de Ca2+ y análisis de datos en miocitos.

<table><tbody><tr><td><fuerte>MEDIA</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma (Roche)</td><td>3117057001</td><td>Concentración final = 0,2% (p/v)</td></tr><tr><td>Glutatión</td><td>Sigma</td><td>G-6529</td><td>Concentración final = 10 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H-7006</td><td>Concentración final = 15 mM</td></tr><tr><td>M199</td><td>Sigma</td><td>M-2520</td><td>1 botella rinde 1 L; pH 7.45</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S-8875</td><td>Concentración final = 4 mM</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Fisher 15140122</td><td></td><td>Concentración final = 100 U/mL de penicilina, 100 &mu; g/mL de estreptomicina</td></tr><tr><td><reactivos fuertes>REACTIVOS ESPECÍFICOS PARA Ca2+ IMAGENG</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2AM</td><td>Invitrogen (Sondas Moleculares)</td><td>F1221</td><td>50 &mu; g/vial; &nbsp; Preparar solución madre de 1 mM de Fura-2AM + 0,5 M de probenicid en DMSO; &nbsp; La concentración final de Fura2-AM en los medios es&nbsp; 5 y mu; M</td></tr><tr><td>Probenicid</td><td>Invitrogen (Fisher)</td><td>P36400</td><td>Añadir 7,2 mg de probenicid (0,5 M) a 1 mM de caldo de Fura-2AM; La concentración final en el medio es de 2,5 mM</td></tr><tr><td><fuerte>MATERIALES PARA LA ESTIMULACIÓN DE MIOCITOS DE RATA</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>#1 22&nbsp; mm2 cubreobjetos de vidrio</td><td>Corning</td><td>2845-22</td><td></td></tr><tr><td>Cables de 3 x 36 pulgadas con conectores banana</td><td>Pomona Electronics</td><td>B-36-2</td><td>Figura suplementaria 1, panel C</td></tr><tr><td>Incubadora oC&nbsp; con 95% O2:5% CO2&nbsp;</td><td>Formulario</td><td>3110</td><td>Suplementario Figura 1, panel E. Varios modelos son apropiados</td></tr> Clase <tr><td>II A/B3 Cabina de bioseguridad con lámpara UV</td><td>Forma</td><td>1286</td><td>Varios modelos son apropiados</td></tr><tr><td>Pinzas - Dumont #5 5/45</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Esterilizador de perlas</td><td>calientes Fine Science Tools</td><td>1800-45</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido de bajo aumento</td><td>Leica</td><td>DM-IL&nbsp;</td><td>Coloque este microscopio adyacente a la incubadora para monitorear la contracción de los miocitos estimulados al comienzo de la estimulación y después de los cambios de medio. Objetivos 4X y 10X recomendados</td></tr><tr><td>Cámara de estimulación</td><td>Personalizado</td><td></td><td>Suplementario Figura 1, panel A. El sistema Ionoptix C-pace es una alternativa disponible en el mercado o consulte 22</td></tr><tr><td>Stimulator</td><td>Ionoptix</td><td>Myopacer</td><td>Supplemental Figure 1, panel D.</td></tr><tr><td><MATERIALES FUERTES>PARA LA FUNCIÓN CONTRÁCTIL y/o Ca2+ ANÁLISIS </ID></td> fuerte en la <td></td><td></td><td>Figura 2 y complementaria Alternativas/Opciones recomendadas Componentes</td></tr><tr><td>adicionales para el análisis de imágenes de Ca2+</td><td>Ionoptix</td><td>Componentes esenciales del sistema: -- Sistema de conteo de fotones&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; --&nbsp; Fuente de alimentación de xenón con fuente de luz de doble excitación&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; --&nbsp; Interfaz de fluorescencia</td><td>&nbsp;- El sistema de conteo de fotones contiene un tubo fotomultiplicador (PMT) y un espejo dicroico y se instala junto a la cámara CCD&nbsp; (panel A #4).&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - La fuente de alimentación para la fuente de luz de bombilla de xenón (consulte el panel A #5 y el panel C, a la izquierda) está integrada con una interfaz de excitación dual (excitación de 340/380 nm y emisión de 510 nm) que se muestra en el panel A #6. &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - La interfaz de fluorescencia entre la computadora y &nbsp; La fuente de luz se muestra en el panel B, # 12.</td></tr><tr><td>Cámara CCD con adquisición de imágenes&nbsp; hardware y software (240 fotogramas/s)</td><td>Ionoptix&nbsp;</td><td>Myocam con controlador CCD&nbsp;</td><td>Myocam y el controlador CCD se muestran en la Fig. 2 suplementaria, panel A #4&nbsp; y panel A #5 y panel C #5 (derecha), respectivamente.&nbsp; El controlador está integrado con un sistema informático PC (panel B #14).&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp; Estimulador de cámara</td><td>Ionoptix&nbsp;</td><td>Panel B</td><td>, #13; Alternativa:&nbsp; Césped modelo S48</td></tr><tr><td>Cámara de perfusión montada en cubreobjetos</td><td>Cámara personalizada para cubreobjetos de 22 mm2 con adaptador de silicona y 2-4 tornillos Phillips de cabeza plana #0&nbsp; (flecha, panel F)</td><td></td><td>Panel A #10 y panel F; &nbsp; &nbsp; La temperatura de la cámara se calibra a 37oC utilizando una sonda TH-10Km y el controlador de temperatura TC2BIP (ver controlador de temperatura).&nbsp; Alternativas comerciales:&nbsp; Ionoptix FHD o célula C-stim&nbsp; Cámaras; Sistema de estimulación de cultivo Cell MicroControls</td></tr><tr><td>Computadora y software dedicados para la recopilación de datos y el análisis de la función/transitorios de Ca2+</td><td>PC Ionoptix</td><td>con placa de PC Ionwizard y software</td><td>Panel B, # 14; La función contráctil se mide utilizando los módulos de adquisición SarcLen (longitud del sarcómero) o SoftEdge (longitud del miocito) del software IonWizard. El software Ionwizard también incluye software de adquisición PMT para radiométricos&nbsp; Imágenes 2+ en mioyctos cargados con Fura-2AM. - Se recomienda un gabinete de montaje en rack electrónico de 4 postes y estantes para alojar el somputer y el estimulador celular. La interfaz de fluorescencia para la obtención de imágenes de Ca2+ también se encuentra en este gabinete (ver más abajo).</td></tr><tr><td>Pinzas - Dumont #5 TI</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-40</td><td>Panel F</td></tr><tr><td>Soporte de tubo aislado para medios</td><td>Custom</td><td></td><td>Panel A #9; Este soporte se ensambla fácilmente con espuma de poliestireno y un paquete de gel precalentado para mantener los medios calientes</td></tr><tr><td>Microscopio de campo claro invertido</td><td>Nikon</td><td>TE-2000S</td><td>Instale una torreta giratoria para epifluorescencia (Panel A # 2) para imágenes de Ca2+. También se recomienda un filtro de condensador de color rojo intenso (590 nm) para minimizar el blanqueo de fluorescencia durante las imágenes de Ca2+.</td></tr><tr><td>Mesa Aisladora</td><td>TMC Control de Vibración</td><td>30 x 36 pulgadas</td><td>Panel A, #1; Deseable:&nbsp; estanterías elevadas, blindaje de Faraday&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Oculares de microscopio y objetivo</td><td>Nikon</td><td>10X CFI oculares 40X agua CFI Plan Fluor</td><td>objetivo Panel A #3; 40X objetivo:&nbsp; n.a. 0.08; w.d. 2 mm.&nbsp; Un calentador de objetivo Cell MicroControls HLS-1 está montado alrededor del objetivo (consulte el controlador de temperatura a continuación). &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; NOTA:&nbsp; Los dispensadores de inmersión en agua también están ahora disponibles para objetivos a base de agua. &nbsp;</td></tr><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>Gilson</td><td>Minipuls 3</td><td>Panel A #8 y panel E</td></tr><tr><td>barco de pesaje pequeño</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>08-732-112</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de temperatura</td><td>Cell MicroControls</td><td>TC2BIP</td><td>Panel A #7; Panel D. Este controlador de temperatura calienta la cámara de cubreobjetos a 37oC. &nbsp; &nbsp; Se recomienda un precalentador y un calentador de objetivos para esta plataforma. Un precalentador HPRE2 de Cell MicroControls y&nbsp; El calentador de objetivo HLS-1 está controlado&nbsp; por el controlador de temperatura TC2BIP para nuestros estudios.</td></tr><tr><td>Luz LED debajo del gabinete con sensor de movimiento&nbsp;</td><td>Luz LED Sylvania</td><td>#72423</td><td>Recomendada para la recopilación de datos durante la toma de imágenes transitorias de Ca2+ bajo una luz ambiental mínima. &nbsp; Alternativa:&nbsp; Un clip en la linterna / luz de libro con cuello flexible: hay varios proveedores disponibles.</td></tr><tr><td>Línea de vacío con matraz Ehrlenmeyer en línea y filtro protector</td><td></td><td>Fisher Tygon tubing - E363; &nbsp; matraz de polipropileno Ehrlenmeyer - 10-182-50B; Filtro de vacío - 09-703-90</td><td>Panel A #11</td></tr></tbody></table>

análisis de disfunción contráctil cardíaca y transitorios de ca2+ en miocitos de roedores

Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes

La disfunción contráctil y los transitorios de Ca2+ a menudo se analizan a nivel celular como parte de una evaluación integral de la lesión y / o remodelación inducida por el corazón. Un enfoque para evaluar estas alteraciones funcionales utiliza el acortamiento descargado y los análisis transitorios de Ca2+ en miocitos cardíacos adultos primarios. Para este enfoque, los miocitos adultos se aíslan mediante digestión de colagenasa, se hacen tolerantes al Ca2+ y luego se adhieren a cubreobjetos recubiertos de laminina, seguidos de estimulación eléctrica en medios sin suero. El protocolo general utiliza miocitos cardíacos de rata adulta, pero se puede ajustar fácilmente para miocitos primarios de otras especies. Las alteraciones funcionales en los miocitos de los corazones lesionados se pueden comparar con los miocitos simulados y/o con los tratamientos terapéuticos in vitro . La metodología incluye los elementos esenciales necesarios para la estimulación de los miocitos, junto con la cámara celular y los componentes de la plataforma. El protocolo detallado para este enfoque incorpora los pasos para medir el acortamiento descargado mediante la detección de longitud del sarcómero y los transitorios celulares de Ca2+ medidos con el indicador ratiométrico Fura-2 AM, así como para el análisis de datos sin procesar.

Los estudios de función contráctil se realizan en miocitos de rata comenzando el día después del aislamiento (día 2) hasta 4 días después del aislamiento. Aunque los miocitos pueden registrarse el día después del aislamiento (es decir, el día 2), a menudo se requieren tiempos de cultivo más largos después de la transferencia de genes o tratamientos para modificar la función contráctil8. Para los miocitos cultivados durante más de 18 h después del aislamiento, el protocolo de estimulación descrito ...

Se presenta un conjunto de protocolos que describen la medición de la función contráctil a través de la detección de la longitud del sarcómero junto con la medición transitoria de calcio (Ca2+) en miocitos aislados de rata. También se incluye la aplicación de este enfoque para estudios en modelos animales de insuficiencia cardíaca.

Análisis de disfunción contráctil cardíaca y transitorios de Ca2+ en miocitos de roedores

Contractile dysfunction and Ca2+ transients are often analyzed at the cellular level as part of a comprehensive assessment of cardiac-induced injury ...

Este enfoque detecta cambios en la función contráctil durante el desarrollo de la insuficiencia cardíaca. La respuesta funcional en los miocitos a las neurohormonas y los posibles agentes terapéuticos también se puede examinar. El posicionamiento del miocito puede requerir práctica, pero es esencial para obtener imágenes consistentes de la longitud del sarcómero.Demostrando el procedimiento está Margaret Westfall, profesora asociada e investigadora principal del laboratorio. Antes de comenzar el experimento, precaliente un paquete de gel y un medio en una incubadora a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Encienda los componentes de la plataforma de función contráctil como se menciona en el manuscrito y ensamble el tubo en la bomba peristáltica.Luego, transfiera el paquete de gel precalentado al soporte del tubo y encienda el vacío en la alimentación al estimulador celular. Coloque un tubo de 50 mililitros con medios en el soporte del tubo aislado para comenzar la perfusión a 0,5 mililitros por minuto a través del tubo peristáltico de la bomba. A continuación, agregue dos mililitros de medios precalentados a un bote de pesaje pequeño y transfiera un cubreobjetos que contenga miocitos de la cámara de estimulación al bote de pesaje.Devuelva la cámara de estimulación a la incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Retire el cubreobjetos del recipiente de pesaje y limpie suavemente la parte inferior antes de transferirlo a una cámara de cobertura recién engrasada y agregar una gota de medio al cubreobjetos. Coloque un soporte de electrodo de platino sobre el cubreobjetos, luego coloque un nuevo soporte sobre la parte superior con pinzas y coloque un soporte superior sobre el sándwich de cubreobjetos.Instale dos o cuatro tornillos de cabeza de pancarta número cero para terminar de ensamblar la cámara. En la bomba peristáltica, cuando el medio esté presente en todo el tubo, conecte el tubo al precalentador y el precalentador a la cámara de deslizamiento de la cubierta. Luego, comience la perfusión a 0.5 mililitros por minuto y coloque una toallita de pañuelo debajo de la cámara para asegurarse de que no haya fugas.Después de colocar la cámara deslizante de la cubierta en el adaptador de etapa del microscopio, encienda el sistema de calentamiento y equilibre el conjunto durante cinco a 10 minutos para lograr una temperatura constante del medio de 37 grados centígrados en el centro de la cámara. Observe los medios perfundidos que se recogen en el extremo opuesto de la cámara con tubos conectados a un sistema de vacío. Durante el tiempo de equilibrio, visualice los miocitos con el objetivo de inmersión en agua 40x en el microscopio.Para activar el estimulador de ritmo, ajuste el voltaje a 35 a 40 voltios y ajuste la frecuencia de estimulación a 0.2 hertz para optimizar la función contráctil y la supervivencia de los miocitos. Para recopilar rastros de acortamiento de sarcómero, abra el software en la computadora y seleccione OK, Archivo y nuevas pestañas. Prepare una plantilla de pantalla seleccionando rastros, edite los límites de usuario y la longitud del sarcómero.Grabe las trazas de longitud del sarcómero con el archivo y las nuevas pestañas, identifique un miocito que se contraiga y coloque el miocito a lo largo del eje longitudinal de la cámara para que el patrón de estriación sea vertical. Use el mouse de la computadora para colocar la región de interés o el cuadro de ROI sobre el miocito. Seleccione recopilar y comience a registrar la función contráctil.Registre el acortamiento durante 60 segundos de cada miocito a bajas frecuencias de estimulación de 0,5 hercios. Registre el acortamiento del sarcómero de cinco a 10 celdas por cubreobjetos. Para medir el acortamiento en un rango de frecuencias, coloque los miocitos en cada frecuencia para obtener un acortamiento en estado estacionario antes de la grabación.Duplique la tasa de perfusión y comience a registrar de 15 a 20 segundos después de la estimulación a una nueva frecuencia en el rango de 0.2 a dos hercios y registre no más de dos miocitos por cubreobjetos para acortar en el rango dado de frecuencias de estimulación. Registre al menos siete contracciones por celda para obtener datos promediados de señal confiables. Seleccione el archivo, elija un seguimiento grabado y, a continuación, seleccione abrir.Seleccione la pestaña uno de la traza base y luego establezca el panel amarillo en la parte superior de la traza para obtener la longitud sarc. Prepare una plantilla de análisis con opciones de análisis transitorio monótono de operaciones y marca de evento TTL en la casilla de definición de T Zero en las opciones necesarias del menú. Guarde estas opciones de análisis seleccionando plantillas y guarde la plantilla de análisis con un identificador.Cargue la plantilla de análisis antes de analizar cada seguimiento. Para analizar los datos, seleccione marcas, puerta, agregue transitorio y luego convierta desde marca de evento y rango de análisis. Establezca el rango de tiempo de menos 0.01 a 1.20 segundos para miocitos con un ritmo de 0.2 hertzios.Seleccione un rango de tiempo más corto para los miocitos estimulados a frecuencias más altas. Seleccione operaciones y eventos promedio para producir una grabación promediada de señal debajo de la traza base original. A continuación, seleccione la pestaña uno de la traza promediada de señal y luego vaya a marcas en el menú superior seguido de agregar transitorio, elija operaciones y análisis de transitorios monótonos para mostrar los valores promediados de señal para los parámetros de sarcómero de referencia en el panel de visualización promediado de señal.Seleccione exportar análisis transitorio monótono y corriente del portapapeles y transferir análisis de sarcómero transitorio a una hoja de cálculo para el análisis compuesto de múltiples miocitos. Para copiar la traza promediada de la señal, seleccione exportar, traza actual, luego las pestañas portapapeles y opciones en orden y establezca los decimales en cinco. Elija el delimitador de pestañas y haga clic en Aceptar.Ajuste el ritmo de las trazas promediadas de la señal para cada grabación de miocitos en una segunda hoja de cálculo. El estudio mostró que la sobrecarga de presión o PO, redujo la función contráctil de los miocitos en comparación con el grupo simulado. Sin embargo, cuatro días después de la transferencia génica de troponina cardíaca IT 144D o cTnIT144D, la capacidad contráctil en los miocitos PO regresó a niveles simulados, lo que indica que la función de los miocitos podría restaurarse.En los estudios iniciales, la transferencia génica de cTnIT144D mejoró el acortamiento máximo y los niveles elevados de calcio diastólico en comparación con CTnI. A menudo se necesitan ajustes finos en el posicionamiento del miocito cardíaco para obtener trazas claras de acortamiento. Este protocolo también se puede realizar en miocitos cardíacos cargados con colorantes fluorescentes sensibles al calcio como Fura-2 AM para detectar transitorios de calcio además de acortamiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Aquí se describe el aislamiento de cardiomyoctyes adultas de ratón utilizando un sistema de perfusión Langendorff. Las células resultantes son de Ca2 +-tolerante, eléctricamente en reposo y pueden ser cultivadas y transfectadas con adeno-o lentivirus para manipular la expresión génica. Su funcionalidad también puede ser analizado usando el sistema de MMSYS y técnicas de patch clamp.

Aislamiento, cultivo y caracterización funcional de ratón adulto Cardiomyoctyes

Se pueden aislar del corazón cardiomiocitos individuales de ratones de tipo salvaje y mutantes para estudiar su contractilidad y transitorios de calcio. Esto permite caracterizar la contribución de la disfunción celular a la disfunción cardíaca por cualquier causa.

Aislamiento y fisiológica Análisis de Ratón cardiomiocitos

Músculo papilar ventricular izquierdo murino se puede utilizar para investigar la contractilidad cardíaca in vitro. En este artículo se describe en detalle el aislamiento y los protocolos experimentales para estudiar las características contráctiles cardiacas.

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En este artículo se describe el protocolo detallado y equipos necesarios para el mapeo óptico dual de potencial transmembrana (V m) y libre retículo intra-sarcoplásmico (SR) Ca 2+ en el corazón de conejo perfundidos Langendorff. Este método permite la observación directa y la cuantificación de V m y SR Ca 2+ dinámica en el corazón intacto.

Mapeo óptico de Intra-retículo sarcoplásmico Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Y potencial transmembrana en el corazón de conejo perfundidos Langendorff

Este artículo describe un protocolo que evalúa los cambios en la sensibilidad del miofilamento Ca2+ durante la contracción en miocitos cardíacos aislados del corazón de rata. Junto con la electrofisiología cardíaca, los niveles de Ca2+ del citosol sistólico/diastólico y la contracción/relajación, esta medición es imprescindible para respaldar los mecanismos que median el acoplamiento de excitación-contracción cardíaca en corazones sanos y enfermos.

Evaluación de los miofilamentos Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensibilidad cardíaca subyacente excitación-contracción de acoplamiento

Presentamos la metodología para el aislamiento de miocitos murinos y cómo obtener trazas de voltaje o calcio simultáneamente con rastros de acortamiento de sarcomere utilizando fotometría de fluorescencia con mediciones simultáneas de geometría celular digital.

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Este protocolo tiene como objetivo describir paso a paso la técnica de extracción y evaluación de la función cardíaca utilizando cardiomiocitos despellejados. Esta metodología permite la medición y la agudomodulación de la función de miofilamento utilizando pequeñas biopsias congeladas que se pueden recoger de diferentes lugares cardíacos, desde ratones hasta hombres.

Evaluación In Vitro de la Función Cardíaca usando Cardiomiocitos Pielados

Presentamos un protocolo para evaluar los efectos electromecánicos de la activación de GtACR1 en cardiomiocitos de conejo. Proporcionamos información detallada sobre el aislamiento celular, el cultivo y la transducción adenoviral, y sobre experimentos funcionales con las técnicas de abrazadera de parche y fibra de carbono.

Evaluación electromecánica de la actividad de cardiomiocitos moduladas optogenéticamente

Los modelos de ratón permiten estudiar los mecanismos clave de la arritmogénesis. Para este propósito, los cardiomiocitos de alta calidad son necesarios para realizar mediciones de parche y pinza. Aquí, se describe un método para aislar miocitos aurinos y ventriculares a través de la perfusión de Langendorff retrógrada basada en enzimas, que permite mediciones simultáneas de transitorios de calcio y corriente de calcio de tipo L.

Aislamiento de miocitos aurículas y ventriculares murinas de alta calidad para mediciones simultáneas de transitorios de Ca2+ y corriente de calcio tipo L

Este protocolo describe cómo medir la contractilidad en cardiomiocitos primarios humanos adultos de corazones de donantes con el sistema MyoBLAZER, una plataforma fiable para evaluar los cambios en la contractilidad inducidos por fármacos durante el desarrollo preclínico.

Medición de la contractilidad cardíaca en cardiomiocitos primarios humanos adultos aislados

Este protocolo introduce el mapeo óptico de doble colorante de corazones de ratón obtenidos de animales de tipo salvaje y knock-in afectados por taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica, incluyendo mediciones electrofisiológicas de voltaje transmembrana y transitorios intracelulares de Ca2+ con alta resolución temporal y espacial.

Mapeo óptico de doble colorante de corazones a partir de ratones knock-in RyR2R2474S de taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica

Aprende a medir la función contráctil y los transitorios de calcio en miocitos de rata mediante detección de longitud de sarcómero. Este protocolo permite estudiar la insuficiencia cardíaca y evaluar respuestas a agentes terapéuticos.

Análisis de disfunción contráctil cardíaca y transitorios de Ca²⁺ en miocitos de roedores

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