Name: Medición repetida y en tiempo real del crecimiento del músculo esquelético en peces cebra vivos individuales sometidos a actividad eléctrica alterada (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T14:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: Aprende a medir el crecimiento del músculo esquelético en peces cebra vivos con alta precisión espacial y temporal mediante microscopía confocal. Este método permite estudiar la regulación del desarrollo muscular y sus implicaciones para trastornos de atrofia.

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Los autores están profundamente en deuda con los esfuerzos de los miembros del laboratorio de Hughes, los doctores Seetharamaiah Attili, Jana Koth, Fernanda Bajanca, Victoria C. Williams, Yaniv Hinits, Giorgia Bergamin y Vladimir Snetkov para el desarrollo de los protocolos descritos, y con Henry Roehl, Christina Hammond, David Langenau y Peter Currie por compartir plásmidos o líneas de pez cebra. SMH es un científico del Consejo de Investigación Médica (MRC) con subvenciones del programa G1001029, MR / N021231 / 1 y MR / W001381 / 1 de apoyo. MA tuvo una beca de doctorado del Programa de Formación Doctoral MRC del King's College de Londres. Este trabajo se benefició de la aportación trigonométrica de David M. Robinson, erudito, mentor y amigo.

Los autores declaran que no hay intereses contrapuestos.

Aquí presentamos un método para la estimación precisa y eficiente del volumen muscular de larvas vivas de pez cebra en etapas o en variantes genéticas en las que la pigmentación no es un gran obstáculo para la obtención de imágenes y cuando la anestesia transitoria y / o la inmovilización son bien toleradas. Mientras que hemos empleado microscopía confocal de escaneo láser, los enfoques descritos son aplicables a la microscopía confocal de disco giratorio o de hoja de luz y a cualquier otro método que cree pilas de imáge...

El crecimiento regulado del tejido, que comprende el aumento del número de células (hiperplasia) y / o el tamaño de las células (hipertrofia), es un factor crucial en el desarrollo, la regeneración y la adaptación ecológica y evolutiva. A pesar de los enormes avances en la comprensión genética molecular de la biología celular y del desarrollo en las últimas décadas, la comprensión mecanicista de la regulación del tamaño de los tejidos y órganos todavía está en su infancia. Una de las razones de esta laguna en el conocimiento es la dificultad de cuantificar el crecimiento de tejidos en organismos vivos con la precisión espacial y temporal necesaria.
Varios aspectos del crecimiento de organismos enteros se pueden medir repetidamente a lo largo del tiempo, revelando curvas de crecimiento para cada individuo 1,2,3,4,5. Los métodos de exploración cada vez más sofisticados, como la absorciometría dual de rayos X (DXA), la tomografía computarizada (TC) y la resonancia magnética (RM), permiten el seguimiento del crecimiento de órganos completos y otras regiones del cuerpo (por ejemplo, músculos esqueléticos identificados individualmente) en individuos individuales, tanto humanos como en organismos modelo 6,7,8,9,10 . Sin embargo, estos métodos aún no tienen la resolución para revelar células individuales y, por lo tanto, los vínculos entre los comportamientos celulares y el crecimiento a nivel de tejido han sido difíciles de discernir. Para establecer tales vínculos, los estudios tradicionales a menudo se han basado en cohortes de animales individuales similares, algunos de los cuales se sacrifican en puntos de tiempo sucesivos y luego se analizan en detalle citológico. Tales enfoques requieren promediar los cambios observados entre grupos de individuos (preferiblemente similares, pero no obstante variables) y, por lo tanto, sufren de una falta de resolución temporal y espacial, lo que dificulta encontrar eventos correlacionados a nivel celular que sugieran causa y efecto.
Los estudios sobre organismos modelo de invertebrados, inicialmente en C. elegans y D. melanogaster, han eludido estos problemas mediante el desarrollo de microscopía óptica para lograr la resolución celular y medir con precisión el crecimiento a lo largo del tiempo en individuos individuales. Tales estudios han revelado comportamientos de linaje celular sorprendentemente invariantes en el crecimiento de estos pequeños organismos modelo 11,12,13,14,15,16,17. Sin embargo, muchos animales, incluidos todos los vertebrados, tienen linajes celulares indeterminados y controlan el crecimiento de los tejidos mediante misteriosos procesos de retroalimentación que sirven para convertir el programa de crecimiento codificado genéticamente en un organismo tridimensional funcional con todos sus tejidos y órganos constituyentes adecuadamente emparejados en tamaño. Para comprender estos complejos procesos de crecimiento, es deseable obtener imágenes de tejidos u órganos completos a lo largo del tiempo en individuos individuales que puedan manipularse experimentalmente mediante intervenciones genéticas, farmacológicas u otras en el momento de su elección y el efecto se analice posteriormente.
Cada músculo esquelético vertebrado tiene un tamaño, forma y función definidos, e interacciones bien caracterizadas con tejidos adyacentes, como huesos, tendones y nervios. Algunos músculos son pequeños, se encuentran justo debajo de la piel y, por lo tanto, son buenos candidatos para estudios de imágenes de alta resolución. Al igual que la mayoría de los órganos, cada músculo crece a lo largo de la vida embrionaria, postnatal y juvenil, antes de alcanzar un tamaño adulto estable. El músculo, sin embargo, también tiene una capacidad única para cambiar de tamaño durante la vida adulta, dependiendo del uso y la nutrición18, y esta propiedad tiene un gran impacto en la aptitud del organismo, el rendimiento deportivo y la vida independiente. La pérdida de masa muscular y de función en la vejez, la sarcopenia, es un tema de creciente preocupación para las sociedades que se enfrentan a una población envejecida 19,20,21.
Nosotros y otros nos hemos centrado en el crecimiento de bloques definidos de tejido muscular esquelético en el cuerpo segmentariamente repetitivo de larvas de pez cebra, como un sistema aparentemente cerrado que contiene varios cientos de células en las que se puede observar y manipular el crecimiento, mantenimiento y reparación de tejidos 22,23,24,25,26. Si bien se ha informado previamente de algunos trabajos cuantitativos 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35, no se dispone de un método detallado y validado para medir el crecimiento muscular en detalle celular en organismos vertebrados individuales a lo largo del tiempo. Aquí se describe un protocolo eficiente sobre cómo realizar tales mediciones repetidas, junto con la validación, y se proporciona un ejemplo de su uso para analizar los cambios en el crecimiento hipertrófico e hiperplásico en respuesta a la actividad eléctrica alterada.

<table><tbody><tr><td>Adhesivo, Blu Tack</td><td>Bostik</td> <td>-</td> Vacío <td>de</td></tr> <tr><td>aerosol &nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539-Agarosa</td><td></td></tr><tr><td>, baja temperatura de gelificación</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td>Una vez derretido, manténgalo a 37oC en un calentador de bloque para que permanezca en forma líquida para uso repetido.</td></tr><tr><td>Calentador</td><td>de bloque Cole-Parmer</td><td>SBH130-BODIPY</td><td></td></tr> <tr><td>FL C5-ceramida</td><td>Thermo Scientific</td><td>D3521</td><td>Para diluir en agua de pescado y utilizar a 5 &micro; M para incubación nocturna.</td></tr><tr><td>Pinzas y alambres de cocodrilo</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>-Fiji/imageJ</td><td>Institutos Nacionales de Salud, NIH</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Medio para peces, Agua para peces</td><td>-</td><td>-</td><td>Agua del sistema de circulación recogida de la instalación de peces.</td></tr><tr><td>Medio de pescado, medio E3</td><td>:</td><td></td> <td>E3 se describe en El libro del pez cebra. http://zfin.org (5 mM de NaCl, 0,17 mM de KCl, 0,33 mM de CaCl2 y 0,33 mM de MgSO4 en agua destilada).</td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia</td><td>Leica Leica</td><td>MZ16F</td><td>También se espera que el microscopio de fluorescencia de otro tipo sea adecuado.</td></tr><tr><td>Aguja de vidrio</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B100-6</td><td>Ser pulido al fuego para evitar daños en los embriones durante la manipulación.</td></tr><tr><td>Estimulador de césped</td><td>Grass Instruments</td><td>S88</td><td>También se espera que los estimuladores de otro tipo sean adecuados.</td></tr><tr><td>Kimwipes, Limpiaparabrisas para tareas delicadas</td><td></td> Microscopio de barrido profesional <td>13258179-láser</td><td></td></tr> <tr><td>(LSM) de Kimberly-Clark&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss LSM 5 Exciter También se espera que Zeiss LSM 880</td><td>LSM de otro tipo sean adecuados.</td></tr><tr><td>Nunc Cell-Culture Tratado, placa de 6 pocillos</td><td>Thermo Scientific</td><td></td> <td>140675-Objective</td></tr><tr><td>, 20&times;/1.0W inmersión en agua</td><td>Zeiss</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur, graduada 1 mL</td><td>Starlab Group</td><td>E1414-0100-Pasteur</td><td></td></tr> <tr><td>Pipeta, Micro Punta Fina 1 mL</td><td>Starlab Group</td><td>E1414-1100-Placa</td> <td>de</td></tr> <tr><td>Petri, 60 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5481</td><td>-</td></tr><tr><td>Plásmido CMV-Cerúleo</td><td>Christina L. Hammond (Universidad de Bristol)</td><td></td><td>PCS2+_cerulean_kanR plásmido inyectado a 25-75 pg en una etapa celular.&nbsp; Cita: Bussman J y Schulte-Merker S. (2011) Desarrollo 138:4327-4332. doi: 10.1242/dev.068080.</td></tr><tr><td>Plásmido, pCS-mCherry-CAAX</td><td>Henry Roehl (Universidad de Sheffield)</td><td>-</td><td>Para la transcripción in vitro utilizando el promotor SP6 (se pueden utilizar plásmidos que contienen otros marcadores de marcaje de membrana); ARNm encapsulado sintetizado para inyectar a 100-200 pg en una célula.</td></tr><tr><td>Controlador de pulsos&nbsp;</td><td>Hoefer Scientific Instruments</td><td>PC750-Soldador</td><td></td></tr><tr><td></td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>-Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>3-aminobenzoato de etilo metanosulfonato / MS-222; para ser disuelto en agua de peces y utilizado a 0.6 mM.</td></tr><tr><td>Volocity</td><td>Perkin Elmer/Quorum Technologies Inc</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Pinzas de relojero, n.º 5</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Alambre, platino</td><td>Goodfellow</td><td>PT005142/12</td><td>0,40 mm de diámetro; una alternativa costosa de la plata.</td></tr><tr><td>Alambre, plata</td><td>Acros Organics</td><td>317730010</td><td>0,25 mm de diámetro (se había probado un rango de diámetro, es decir, 0,25-0,5 mm, que produjo resultados similares).</td></tr><tr><td>Pez cebra, myog:H2B-mRFP</td><td>David M. Langenau (Hospital General de Massachusetts; Instituto de Células Madre de Harvard)</td><td>-</td><td>ZFIN nombre oficial: Tg (myog: Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg.&nbsp; http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2&nbsp; Citación: Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yord&aacute; n N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. Imagen de la heterogeneidad de las células tumorales después del trasplante de células en pez cebra con inmunodeficiencia ópticamente clara. Nat Commun. 21 de enero de 2016;7:10358. doi: 10.1038/ncomms10358.</td></tr><tr><td>Pez cebra, &alpha;-actina:mCherry-CAAX</td><td>Peter D. Currrie (ARMI, Universidad de Monash)</td><td>-</td><td>ZFIN nombre oficial: Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg.&nbsp; http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 Citación: Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A y Currie PD. Pérdida de tropomodulina4 en el pez cebra mutante tr&auml; La EG causa la formación de bastones citoplasmáticos y debilidad muscular que recuerda a la miopatía nemalínica. Dis Model Mech. 2014 Dic; 7(12):1407-15. doi: 10.1242/dmm.017376.</td></tr><tr><td>Pez cebra, &beta;-actina:HRAS-EGFP</td><td>-</td><td>-</td><td>Nombre oficial de ZFIN: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2&nbsp; Cita: Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I y Kimelman D. Visualización de la morfogénesis en embriones de pez cebra transgénicos utilizando el colorante de éster metílico BODIPY TR como contratinción vital para GFP. Dev Dyn. febrero de 2005; 232(2):359-68. doi: 10.1002/dvdy.20252.</td></tr><tr><td>Software ZEN</td><td>Zeiss</td><td>-</td><td>-</td></tr></tbody></table>

medición repetida y en tiempo real del crecimiento del músculo esquelético en peces cebra vivos individuales sometidos a actividad eléctrica alterada

Real Time and Repeated Measurement of Skeletal Muscle Growth in Individual Live Zebrafish Subjected to Altered Electrical Activity

Se pueden utilizar varios métodos para visualizar células individuales en todo el cuerpo de peces cebra embrionarios vivos, larvales o juveniles. Mostramos que los peces vivos con membranas plasmáticas marcadas con fluorescencia se pueden escanear en un microscopio de escaneo láser confocal para determinar el volumen de tejido muscular y el número de fibras musculares presentes. Se describen y validan enfoques eficientes para la medición del número y tamaño de células en animales vivos a lo largo del tiempo contra métodos de segmentación más arduos. Se describen métodos que permiten el control de la actividad eléctrica muscular y, por lo tanto, contráctil. La pérdida de la actividad contráctil del músculo esquelético redujo en gran medida el crecimiento muscular. En larvas, se describe un protocolo que permite la reintroducción de la actividad contráctil evocada eléctricamente modelada. Los métodos descritos minimizan el efecto de la variabilidad interindividual y permitirán el análisis del efecto de estímulos eléctricos, genéticos, farmacológicos o ambientales en una variedad de parámetros de crecimiento celular y fisiológico en el contexto del organismo vivo. Posteriormente se puede realizar un seguimiento a largo plazo de los efectos medidos de una intervención definida en los primeros años de vida en los individuos.

Una medida rápida y precisa del volumen de somita Se describe un método de preparación de muestras, adquisición de datos y análisis volumétrico que permite la medición rápida del crecimiento muscular en larvas de pez cebra. El tamaño muscular se puede medir en animales vivos utilizando peces marcados en sus membranas plasmáticas con una GFP dirigida a la membrana (β-actina: HRAS-EGFP) o mCherry (α-actina: mCherry-CAAX). Las larvas fueron anestesiadas transitoriamente usando tricaína,...

La claridad óptica es una gran ventaja para el trabajo biológico y fisiológico celular en el pez cebra. Se describen métodos robustos para medir el crecimiento celular en animales individuales que permiten nuevos conocimientos sobre cómo el crecimiento del músculo esquelético y los tejidos vecinos se integran con el crecimiento de todo el cuerpo.

Medición repetida y en tiempo real del crecimiento del músculo esquelético en peces cebra vivos individuales sometidos a actividad eléctrica alterada

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish ...

Nuestro protocolo nos permite estudiar cómo los tejidos, como el músculo esquelético, regulan su tamaño, que sigue siendo una cuestión clave en la biología celular y del desarrollo con importantes implicaciones fisiológicas y médicas. La principal ventaja de nuestra técnica es que el crecimiento celular se puede observar y medir en animales vivos in vivo con un alto grado de precisión espacial y temporal. El progreso en la comprensión básica del crecimiento muscular temprano puede resaltar los orígenes del desarrollo de los problemas musculares tempranos y conducir al descubrimiento de Novo Therapeutics para proteger contra la pérdida muscular en ancianos y pacientes con trastornos de desgaste muscular.Prepare 1% LMA en un tubo de 1.5 mililitros y manténgalo en un bloque de calor de 37 grados centígrados para uso repetido. Seleccione los peces que se montarán y anestesie transitoriamente a cada pez. Para evitar el choque térmico, retire la alícuota LMA del bloque de calor y deje que se enfríe justo por encima de la configuración.Tome una placa de Petri de 60 mililitros que haya sido recubierta con una capa de 1% de LMA y colóquela en el escenario de un microscopio de disección. Tra

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Este video muestra el registro de señales eléctricas de las neuronas aferentes en una larva de pez cebra paralizada colocando una micropipeta cerca del ganglio de la línea lateral y formando un sello suelto para la captura de señales. La solución extracelular mantiene la viabilidad neuronal durante este proceso.

Monitoreo de señales eléctricas de las neuronas aferentes en una larva de pez cebra inmovilizada

Un método simple para registrar los potenciales de campo extracelular en el cerebro anterior de las larvas de pez cebra se describe. El método proporciona una...

Prosencéfalo electrofisiológico de grabación en larvas de pez cebra

El pez cebra es un sistema emergente para modelar enfermedades humanas del músculo esquelético. Se describe un método rápido y eficaz para aislar las miofibrillas del músculo esquelético de pez cebra embrionario y larval. Este método proporciona una preparación de alta densidad miofibra adecuada para el estudio de la morfología sola fibra muscular esquelética, localización subcelular de proteínas, y la fisiología muscular.

Análisis de embriones y larvas de pez cebra esqueléticas miofibras de Preparativos disociadas

Mediciones de fuerza se pueden utilizar para demostrar los cambios en la función muscular debido al desarrollo, lesión, enfermedad, tratamiento o toxicidad química. En este vídeo, se demuestra un método para medir la fuerza durante una contracción máxima de los músculos del tronco larvas de pez cebra.

Medición de fuerza durante la contracción para evaluar la función muscular en larvas de pez cebra

El pez cebra es ahora una herramienta establecida y poderosa para modelar distrofias musculares, miopatías congénitas y enfermedades neuromusculares relacionadas. La birrefringencia y el comportamiento de escape evocado por el tacto son dos ensayos no invasivos comunes que se utilizan para determinar el grado de desorganización muscular y deterioro locomotor de los embriones de pez cebra durante el desarrollo temprano.

Análisis de defectos del músculo esquelético en larvas de pez cebra mediante ensayos de birrefringencia y respuesta de escape de evocación táctil

Este artículo describe cómo un pez cebra adulto se puede inmovilizar, intubado, y se utiliza para in vivo experimentos electrofisiológicos para permitir grabaciones y la manipulación de la actividad neuronal en un animal intacto.

Registro electrofisiológico en el cerebro del pez cebra adultos Intacto

peces cebra son un excelente modelo para estudiar la función muscular y las enfermedades. Durante la embriogénesis temprana, el pez cebra comienza a realizar contracciones musculares regulares produciendo un comportamiento rítmico de natación, que se altera cuando el músculo se interrumpe. Aquí describimos una respuesta evocada por el tacto y un ensayo de locomoción para examinar el rendimiento de la natación como una medida de la función muscular.

Usando respuesta evocada-Touch y la locomoción ensayos para evaluar el rendimiento muscular y la función en el pez cebra

Los protocolos descritos aquí permiten el estudio de las propiedades eléctricas de las células excitables en las condiciones fisiológicas más no invasivas mediante el empleo de embriones de pez cebra en un sistema in vivo junto con un indicador de voltaje genéticamente codificado (GEVI) basado en la transferencia de energía por resonancia fluorescente (FRET) expresado selectivamente en el tipo de célula de interés.

Potencial de membrana de la neurona motora de Biosensing en los embriones vivos de pez cebra

Aquí, mostramos el proceso de crear una línea de pez cebra de reportero de tensión eléctrica celular para visualizar el desarrollo embrionario, movimiento, y las células de tumor de peces en vivo.

Visualización de la actividad eléctrica celular en embriones tempranos de pez cebra y tumores

La regeneración del músculo esquelético es impulsada por las células madre musculares residentes en el tejido, que se ven afectadas en muchas enfermedades musculares, como la distrofia muscular, y esto resulta en la incapacidad del músculo para regenerarse. Aquí, describimos un protocolo que permite el examen de la regeneración muscular en modelos de pez cebra de enfermedad muscular.

Examinando la regeneración muscular en modelos de pez cebra de enfermedad muscular

La unión neuromuscular de las larvas de pez cebra es un modelo atractivo para el estudio de la fisiología sináptica. Es susceptible de muchas técnicas experimentales, como la electrofisiología y las imágenes ópticas. Aquí, describimos un protocolo para la transmisión sináptica de imágenes utilizando una sonda basada en pHluorin bajo un microscopio de epifluorescencia vertical.

Imágenes en vivo del reciclaje de vesículas sinápticas en la unión neuromuscular de larvas de pez cebra disecadas

Aprende a medir el crecimiento del músculo esquelético en peces cebra vivos con alta precisión espacial y temporal mediante microscopía confocal. Este método permite estudiar la regulación del desarrollo muscular y sus implicaciones para trastornos de atrofia.

Medición repetida y en tiempo real del crecimiento del músculo esquelético en peces cebra vivos individuales sometidos a actividad eléctrica alterada (Video) | JoVE Journal

Medición repetida y en tiempo real del crecimiento del músculo esquelético en peces cebra vivos individuales sometidos a actividad eléctrica alterada

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