Name: Protocolo de rescate embrionario para hibridación interespecífica en calabaza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Aprende el protocolo de rescate embrionario para regenerar híbridos inmaduros entre Cucurbita pepo y Cucurbita moschata usando medio MS con antibióticos. Esta técnica simple mejora la diversidad genética en programas de mejoramiento de calabaza.

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Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Alimentos y Agricultura del USDA, Proyecto NRS No. FLA-TRC-006176 y el Instituto de Ciencias Alimentarias y Agrícolas de la Universidad de Florida.

1. Plantación y polinización
NOTA: Es importante identificar genotipos compatibles cuya hibridación daría lugar a la fructificación y la producción de embriones viables.
<ol><li>Condiciones de plantación y mantenimiento<ol><li>Obtener semillas de genotipos de calabaza (cultivares/accesiones) para hibridación (Tabla 1).</li>
		<li>Llene 50 celdas planas de arranque (25 cm de ancho x 50 cm de largo) con medio de maceta modificado con fertilizante NPK completo que contenga 1.38 g / kg N, 1.38 g / kg P y 1.38 g / kg K.</li>
		<li>Siembre las semillas a una profundidad igual a su longitud y cúbralas con un medio para macetas. Riegue los pisos sin crear agua estancada. Después, mantenga el medio húmedo regándolo a mano una vez al día.</li>
		<li>En la segunda etapa de hoja verdadera, transplante las plántulas en macetas de 25 cm a 30 cm de diámetro enmendadas con un fertilizante NPK completo a 3 cucharadas / maceta. Fertilice las plantas una vez a la semana con 500 ml / maceta de fertilizante líquido que contenga NPK 20:20:20 agregado a una concentración de 1 g por galón de agua.</li>
		<li>Mantener las plantas en el invernadero a temperaturas entre 22-28 °C bajo régimen de luz natural. Para los genotipos de vid, proporcione un enrejado de soporte en el invernadero (Figura 1).</li>
	</ol></li>
	<li>Realización de polinización<ol><li>Por lo general, la floración en la calabaza comienza a las 6 a 8 semanas de la siembra, dependiendo del cultivar (Figura 2A, B). Comience a hacer hibridación controlada (cruces) tan pronto como las plantas comiencen a florecer. En condiciones de invernadero, la polinización se puede hacer durante todo el año.</li>
		<li>Identifique las flores masculinas y femeninas de los cultivares C. pepo y C. moschata que estarán listas para la polinización al día siguiente. Para identificar tales flores, verifique si hay flores cuyos pétalos tengan un tono amarillo pero no estén abiertos. Cierre suavemente las flores en la parte superior con cinta adhesiva para evitar la polinización accidental de insectos (Figura 2C, D).</li>
		<li>La mañana del día siguiente, las flores están listas para polinizar. Realizar la polinización antes de las 10:00 a.m. para mejorar la tasa de éxito de la hibridación27.</li>
		<li>Abra las flores femeninas y masculinas retirando suavemente la parte superior pegada con cinta adhesiva de los pétalos. Retire los pétalos de la flor masculina y transfiera el polen frotando suavemente la antera sobre el estigma de la flor femenina (Figura 3A).</li>
		<li>Después de la polinización, cierre inmediatamente la flor femenina polinizada con cinta adhesiva. Use una etiqueta para registrar la fecha de polinización e indicar los padres paternos y maternos utilizados en la cruz (Figura 3B).</li>
		<li>Un cruce exitoso se indica mediante un ovario expandido que forma rápidamente un pequeño fruto en 1 semana (Figura 4A). La planta está lista para la cosecha 45-55 días después de la polinización28 (Figura 4B).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Técnica de rescate embrionario
<ol><li>Preparación de los medios<ol><li>Preparar existencias de antibióticos: Para cefotaxima (sal de sodio), disolver el antibiótico en 4 ml de agua desionizada o destilada, filtrar a través de un filtro de jeringa estéril de 0,22 μm y hacer 0,5 ml de alícuotas. Conservar a -20 °C. La solución madre resultante tendrá una concentración de 250 mg/ml.</li>
		<li>Para la ampicilina (sal de sodio), disolver el polvo en 10 ml de agua, filtrar a través de un filtro de jeringa estéril de 0,22 μm y alícuota en 1 ml de material con una concentración final de 100 mg/ml. Conservar a -20 °C.</li>
		<li>Haga que Murashige y Skoog (MS) sean medianos disolviendo 2,45 g de medio (concentración de 4,91 g/L) en 500 ml de agua destilada en una botella de 1 L. Añadir 1,5 g de goma gellan y autoclave a 121 °C durante 20 min. La goma gellan se disuelve completamente durante el autoclave.</li>
		<li>Después del autoclave, enfriar el medio colocando la botella en un baño maría a 50 °C. Retire las existencias de antibióticos del congelador y descongélelas en el gabinete de flujo laminar.</li>
		<li>Transfiera la botella mediana a la campana de flujo laminar. Agregue 0.6 ml de solución madre de cefotaxima (250 mg / ml) y 0.25 ml de ampicilina (100 mg / ml) al frasco mediano y mezcle bien. Vierta aproximadamente 7 ml del medio en una placa de Petri estéril (60 mm x 15 mm).</li>
		<li>Deje que el medio se solidifique en las placas de Petri durante aproximadamente 15-20 min. Cierre las placas de Petri con una envoltura selladora y colóquelas en una caja de almacenamiento. Conservar a temperatura ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Rescate de embriones<ol><li>Antes de comenzar, limpie y esterilice el gabinete de flujo de aire laminar con alcohol etílico al 70%.</li>
		<li>Coseche la fruta de calabaza rompiéndola / cortándola de la vid principal y desinfecte la superficie de la fruta lavándola con detergente líquido (por ejemplo, cloroxilenol al 0,3%) en el fregadero del laboratorio hasta que se elimine toda la suciedad suelta (Figura 5A).</li>
		<li>Enjuague con abundante agua del grifo. Seque la fruta con toallas de papel limpias. Mueva la fruta al gabinete de flujo de aire laminar (Figura 5B).</li>
		<li>Esterilice la superficie de la fruta rociando etanol al 70% sobre la fruta en el gabinete estéril de flujo de aire laminar. Dividir la fruta con un cuchillo estéril (Figura 5C) y extraer las semillas.</li>
		<li>Utilice fórceps estériles para abrir asépticamente la capa de la semilla y exponer los embriones inmaduros (Figura 6). Coloque cuidadosamente los embriones inmaduros en una placa de Petri que contenga medio MS suplementado con cefotaxima y ampicilina (Figura 7A). Cierre la placa de Petri y selle con una película de envoltura. NOTA: Dependiendo del tamaño del embrión, es posible colocar cinco o seis embriones en una placa de Petri.</li>
		<li>Colocar las placas de Petri selladas con embriones en una cámara de crecimiento bajo fotoperiodo de 16 h a 25 °C y 70% de humedad relativa. Si se produce contaminación, subcultive rápidamente los embriones no contaminados en una nueva placa con el mismo medio.</li>
		<li>Los cotiledones comenzarán a expandirse después de 4 días y se volverán verdes en 10 días (Figura 7B). En este punto, si es necesario, realice el subcultivo en nuevas placas que contengan el mismo medio para permitir la expansión del tejido. Las raíces comenzarán a aparecer a los 14 días (Figura 7C), y a los 21 días las plántulas tendrán raíces extendidas y cotiledones (Figura 7D). NOTA: El medio de cultivo utilizado en el protocolo es apropiado para la diferenciación en brotes y raíces sin reguladores de crecimiento suplementarios.</li>
		<li>En esta etapa, retire las plántulas de las placas de Petri y lave suavemente los medios de las raíces con agua del grifo (Figura 8). Coloque las plántulas en un recipiente de plástico (14 cm x 9 cm x 4 cm) y cubra las raíces con toallas de papel húmedas (Figura 9A). Cubra el recipiente y vuelva a humedecer las toallas de papel según sea necesario.</li>
		<li>Conservar los envases a temperatura ambiente (25-28 ºC) y con un fotoperiodo de 16 h. Este paso aclimatará las plántulas. Después de la aclimatación durante 7-10 días en el contenedor, las plántulas tendrán aproximadamente 3-4 de largo. Durante este período, vuelva a humedecer las toallas de papel según sea necesario.</li>
		<li>Transfiera las plántulas a 50 planos de partida de celdas (25 cm de ancho x 50 cm de largo) modificados con fertilizante como se describió anteriormente y muévalos al invernadero (Figura 9B). No riegue demasiado las plántulas para evitar que se pudran; agregue aproximadamente 10-20 ml por celda según sea necesario.</li>
		<li>En la segunda a tercera etapa de hoja verdadera, transplante las plántulas en macetas de 30 cm de diámetro llenas de medio para macetas modificado con fertilizante como se describió anteriormente (Figura 10A). Proporcionar soporte de enrejado para las plantas de enredadera y realizar una hibridación controlada cuando las plantas comiencen a florecer, como se describió anteriormente (Figura 10B).</li>
		<li>Mantener las plantas en el invernadero a temperaturas entre 22-28 °C bajo régimen de luz natural. Evalúe las características de las plantas para las frutas y semillas.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Hay dos cuellos de botella principales para una hibridación interespecífica exitosa entre C. moschata y C. pepo: la barrera de compatibilidad cruzada, que está determinada por la capacidad de respuesta del genotipo para producir embriones híbridos, y las barreras posteriores a la fertilización, que dificultan el desarrollo de embriones híbridos a semillas normales. Como se informó anteriormente para la calabaza, la prueba de compatibilidad cruzada en el estudio actual reveló que la mayor parte de la fru...

Cucurbita (2n = 40) es un género muy diverso en la familia Cucurbitaceae que contiene 27 especies diferentes, de las cuales cinco son domesticadas1. Entre estos, Cucurbita moschata, C. pepo y C. maxima son los más importantes económicamente a nivel mundial. En los Estados Unidos, C. moschata y C. pepo son las dos especies más importantes en la producción agrícola. C. pepo consiste en cuatro subespecies (ovifera, pepo, fraternal y gumala) que contienen grupos de cultivares de calabaza de verano e invierno de cuello torcido, cuello recto, bellota, vieira, cocozelle, médula vegetal, calabacín y calabaza 2,3,4,5. C. moschata consiste principalmente en tipos de mercado de calabaza de invierno, incluyendo butternut, Dickinson y el grupode queso 1. Las dos especies son morfológica y fenotípicamente diversas, con C. pepo considerado por su rendimiento, precocidad, hábito de crecimiento de arbustos y diversos rasgos de la fruta que incluyen la forma de la fruta, el tamaño de la fruta, el color de la carne y el patrón de la corteza. Por otro lado, C. moschata es apreciada por su adaptación al calor y la humedad, así como por su resistencia a enfermedades y plagas 6,7. La hibridación interespecífica entre C. moschata y C. pepo no sólo es una estrategia importante para la introgresión de características deseables entre las dos especies, sino que también permite la ampliación de la base genética en los programas de mejoramiento 7,8.
Los primeros cruces entre C. moschata y C. pepo se realizaron para determinar su compatibilidad y/o barreras taxonómicas 9,10,11, mientras que estudios posteriores se centraron principalmente en la transferencia de rasgos deseables12,13,14. La hibridación interespecífica entre las dos especies se ha centrado en la transferencia de nuevos rasgos como un hábito de crecimiento arbustivo o semiarbusto y un mejor rendimiento de C. pepo junto con resistencia a enfermedades, adaptabilidad al estrés abiótico y mayor vigor de C. moschata14,15,16. Por ejemplo, cruces específicos entre C. pepo (P5) y C. moschata (MO3) han resultado en un mayor rendimiento de la fruta 13, mientras que las accesiones de C. moschata (Nigerian Local y Menina) han sido ampliamente utilizadas como la principal fuente de resistencia a potyvirus en cultivares cultivados de C. pepo 17,18. 
Estudios previos mostraron que la hibridación entre C. moschata y C. pepo es posible pero difícil 8,15. Los cruces interespecíficos podrían resultar en ningún cuajado (aborto), frutos partenocárpicos desprovistos de semillas viables (semillas vacías), frutos sin semillas donde los embriones inmaduros no se desarrollan (estenospermocarpia), o frutos con pocos embriones inmaduros que pueden ser rescatados en plantas maduras a través del rescate de embriones15,16. Por ejemplo, no se obtuvieron semillas viables cruzando C. pepo (reina de mesa, materna) con C. moschata (queso grande, paterno), sin embargo, el cruce recíproco arrojó 57 semillas viables de 134 polinizaciones9. Hayase obtuvo semillas viables de cruces de C. moschata y C. pepo solo cuando se hicieron cruces a las 04:00 a.m. usando polen almacenado a 10 ° C durante la noche19. Baggett cruzó ocho variedades diferentes de C. moschata con C. pepo (delicata) e informó que de 103 polinizaciones totales, se obtuvieron 83 frutos que parecían normales, pero ninguno de ellos contenía semillas viables8. En un cruce entre C. pepo (S179) y C. moschata (NK), Zhang et al. obtuvieron 15 frutos con 2.994 semillas, pero solo 12 de esas semillas eran viables, mientras que el resto mostraba solo un desarrollo rudimentario. Estos estudios sugieren que a pesar de que el cruce interespecífico entre C. moschata y C. pepo es altamente beneficioso, la obtención de frutos con semillas viables de los cruces es exigente16.
El rescate embrionario ha sido sugerido como un método apropiado para superar los problemas derivados del aborto precoz o embriones poco desarrollados y es una de las técnicas de cultivo in vitro más tempranas y exitosas para la regeneración de embriones inmaduros16,20. El rescate embrionario implica el cultivo in vitro de embriones subdesarrollados/inmaduros, seguido de la transferencia a un medio nutriente estéril para facilitar la recuperación de las plántulas y, en última instancia, de las plantas maduras21. Aunque el rescate de embriones se usa comúnmente en la cría de calabazas, falta una descripción detallada de la metodología adecuada que permita su aplicación rutinaria. El uso de la técnica de rescate embrionario para superar las barreras de hibridación interespecífica en especies de Cucurbita se informó ya en 195422. Sin embargo, el éxito del rescate de embriones en los primeros estudios no se informó o fue muy bajo. Metwally et al. reportaron una tasa de éxito del 10% (regeneración en plantas maduras) entre 100 embriones híbridos interespecíficos rescatados de un cruce entre C. pepo y C. martinezii23. Sisko et al. reportaron una tasa de éxito variable de regeneración embrionaria entre embriones obtenidos de diferentes combinaciones cruzadas: la tasa de regeneración de híbridos obtenidos por cruce de C. maxima (Bos. Max) y C. pepo (Gold Rush) fue de 15,5%, para C. pepo (calabacín) y C. moschata (Hokaido) fue de 20%, mientras que para C. pepo (fiebre del oro) y C. moschata (Dolga) fue de 37,5%24. Además del genotipo, los medios y las condiciones de cultivo in vitro son factores importantes para el éxito de la técnica25,26. En el estudio actual, se probaron varias combinaciones cruzadas entre C. moschata y C. pepo, y se desarrolló una metodología simple para utilizar la técnica de rescate de embriones en calabaza. El desarrollo de una técnica de rescate embrionario simple y fácilmente reproducible facilitará la hibridación interespecífica y la mejora del germoplasma en los programas de mejoramiento de calabazas.

<table><tbody><tr><td>ampicilina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-5</td><td></td></tr><tr><td>autoclave</td><td>Steris</td><td>AMSCO LAB 250</td><td></td></tr><tr><td>cefotaxima</td><td>de equilibrio</td><td></td> Sigma Alfrich C 7039 <td></td></tr><tr><td>tubos de centrífuga (1,5 ml)</td><td>Sigma Alfrich</td><td>T9661</td><td></td></tr><tr><td>detergente</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> etanol, 95%<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Pinza Decon Labs</td><td>2805HC</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>82027-408</td><td></td></tr><tr><td>goma gellan</td><td>Caisson Laboratories</td><td>G024</td><td></td></tr><tr><td>cámara de crecimiento o estante</td><td></td><td></td><td></td>iluminado</tr><tr><td>campana laminar / armario de bioseguridad</td><td>The Baker Company, Inc</td><td>Cinta</td> de enmascarar Edgegard <td></td></tr><tr><td></td><td>Uline</td><td>S-11735</td><td></td></tr><tr><td>medios botella</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige & Skoog Medium</td><td>Research Products International</td><td>M10200</td><td></td></tr><tr><td>NPK fertilizante (20-20-20)</td><td>BWI Companies, Inc</td><td>&nbsp; PR200</td><td></td></tr><tr><td>Fertilizante Osmocote Plus</td><td>BWI Companie,s Inc</td><td>OS90590</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Sigma Alfrich</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri (60 x 15 mm)</td><td>USA Scientific, Inc</td><td>8609-0160</td><td></td></tr><tr><td>macetas</td><td>BWI Companies, Inc</td><td>NP4000BXL</td><td></td></tr><tr><td>envases de plástico para alimentos, reutilizados</td><td>Oscar Mayer</td><td>4470003330</td><td></td></tr><tr><td>etiquetas colgantes de plástico</td><td>Amazon</td><td>B07QTZRY6T</td><td></td></tr><tr><td>mezcla para macetas</td> Bandejas de inicio de plántulas <td>Jolly Gardener</td><td>Pro-Line C/B</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BWI Companies Inc</td><td>GPPF128S4</td><td></td></tr><tr><td>filtro de jeringa (0.22 mmm )</td><td>Soporte</td> de enrejado <td>ExtraGene B25CA022-S</td><td></td></tr><tr><td></td><td>The Home Depot</td><td>&nbsp; 2A060006</td><td></td></tr><tr><td>baño</td><td></td><td></td><td></td> de agua</tr></tbody></table>

protocolo de rescate embrionario para hibridación interespecífica en calabaza

Embryo Rescue Protocol for Interspecific Hybridization in Squash

La hibridación interespecífica en cultivos de Cucurbita (calabaza) es deseable para ampliar la variación genética y para la introgresión de alelos útiles. Los embriones inmaduros generados a partir de estos cruces anchos deben regenerarse utilizando técnicas apropiadas de rescate embrionario. Aunque esta técnica está bien establecida para muchos cultivos, falta una descripción detallada de la metodología adecuada para la calabaza que permita su aplicación rutinaria. Aquí, describimos un protocolo de rescate embrionario útil para la hibridación interespecífica de C. pepo y C . moschata. Para identificar combinaciones viables para el rescate embrionario, se realizaron 24 cruces interespecíficos. El cuajado se obtuvo a partir de veintidós cruces, lo que indica una tasa de éxito del 92%. Sin embargo, la mayoría de los frutos obtenidos eran partenocárpicos, con semillas desprovistas de embriones (semillas vacías). Solo una combinación cruzada contenía embriones inmaduros que podían regenerarse utilizando medios de crecimiento basal de plantas. Un total de 10 embriones fueron rescatados de la fruta F1 interespecífica, y la tasa de éxito del rescate de embriones fue del 80%. El protocolo de rescate de embriones desarrollado aquí será útil para la hibridación interespecífica en programas de cría de calabazas.

Cuajado de frutos y viabilidad de semillas Se realizó una prueba inicial para determinar la viabilidad del cuajado de frutos y la semilla en una variedad de combinaciones cruzadas. Se eligieron un total de 15 genotipos de calabaza, cuatro de C. pepo y 11 de C. moschata (Tabla 1). De las 24 combinaciones cruzadas interespecíficas intentadas, se obtuvo un cuajado para 22 (Tabla 2), lo que representa un éxito global del &gt;92% en el cuajado. No se obtu...

El artículo describe un protocolo de rescate embrionario para la regeneración de embriones inmaduros derivado de la hibridación interespecífica de Cucurbita pepo y Cucurbita moschata. El protocolo se puede replicar fácilmente y será un recurso importante para los programas de cría de calabazas.

Protocolo de rescate embrionario para hibridación interespecífica en calabaza

Interspecific hybridization in Cucurbita crops (squash) is desirable for widening genetic variation and for the introgression of useful alleles. Immature ...

El protocolo de rescate embrionario es obligatorio para la regeneración de embriones inmaduros derivados de cruces interespecíficos entre diferentes especies de Cucurbita. Se usa más comúnmente para cruces entre Cucurbita moschata y Cucurbita pepo. La principal ventaja de esta técnica es su simplicidad.El protocolo utiliza solo medios de EM con antibióticos. Por lo tanto, puede ser fácilmente replicado por cualquier laboratorio. Sería posible modificar esta técnica para investigar diferentes barreras a la hibridación interespecífica o intergenérica.Prestar atención a los detalles durante cada paso será útil para un resultado exitoso. Comience con la siembra de las plantas de Cucurbita llenando 50 celdas planas de 25 por 50 centímetros utilizando un medio para macetas complementado con fertilizante completo de nitrógeno, fósforo y potasio, que contiene 1.38 gramos por kilogramo de nitrógeno, fósforo y potasio cada uno. A continuación, siembre las semillas a una profundidad igual a su longitud y cúbralas con el medio para macetas.Riegue los pisos sin crear agua estancada y mantenga los medios húmedos regándolos una vez al día. Al final de la segunda etapa de hoja verdadera, transplante las plántulas en macetas de 30 centímetros de diámetro complementadas con tres cucharadas de fertilizante completo por maceta. Después de cada siete días, fertilice cada maceta con 500 mililitros de fertilizante líquido que contenga 20, 20, 20 nitrógeno, fósforo y potasio en un gramo agregado a un galón de agua.Mantener las plantas en el invernadero a temperaturas entre 22 y 28 grados centígrados bajo el régimen de luz natural. Para los genotipos de enredadera, proporcione un enrejado de soporte en el invernadero. Realice la hibridación o polinización controlada tan pronto como las plantas comiencen a florecer a las seis u ocho semanas de la siembra.Verifique las flores sin abrir que tienen un tono amarillo en los pétalos e identifique las flores masculinas y femeninas de los cultivares Cucurbita pepo y Cucurbita moschata. Para evitar la polinización accidental de insectos, pegue suavemente la flor cerrada en la parte superior con cinta adhesiva. A la mañana siguiente, realice la polinización antes de las 10:00 AM retirando suavemente la parte superior con cinta adhesiva de la flor masculina y femenina.Separar los pétalos de la flor masculina y transferir el polen frotando suavemente la antera sobre el estigma de la flor femenina. Después de la polinización, cierre inmediatamente la flor femenina polinizada con cinta adhesiva y use una etiqueta para registrar la fecha de polinización e indicar los padres paternos y maternos utilizados en la cruz. Una cruz exitosa indicada por un ovario expandido formará una pequeña fruta dentro de una semana.Coseche la fruta después de 45 a 55 días de polinización. Preparar un caldo de cefotaxima. Filtrarlo a través de un filtro de jeringa estéril de 0,22 micras.Y haga alícuotas de 0.5 mililitros de 250 miligramos por mililitro de cefotaxima antes de almacenarlas a menos 20 grados centígrados. Del mismo modo, prepare el caldo de ampicilina. Filtre a través de un filtro de jeringa estéril de 0,22 micras y prepare alícuotas de un mililitro de 100 miligramos por mililitro de ampicilina antes de almacenarlas a menos 20 grados centígrados.Prepare Murashige y Skoog, o medio MS disolviendo 2,45 gramos del medio en 500 mililitros de agua destilada en una botella de un litro. Agregue 1,5 gramos de goma gellan al medio MS y autoclave a 121 grados centígrados durante 20 minutos. Enfríe el medio colocando la botella en un baño de agua a 50 grados centígrados.Descongele las existencias de antibióticos dentro del gabinete de flujo laminar. Transfiera la botella mediana a la campana de flujo laminar y agregue 0.6 mililitros de caldo de cefotaxima y 0.25 mililitros de caldo de ampicilina al medio con la mezcla adecuada. Vierta aproximadamente siete mililitros del medio en una placa de Petri estéril de 60 por 15 milímetros.Deje que el medio se solidifique en las placas de Petri durante aproximadamente 15 a 20 minutos. Cierre las placas de Petri con una envoltura de sellado y colóquelas en una caja de almacenamiento a temperatura ambiente hasta que se vuelvan a usar. Coseche la fruta de calabaza cortándola de la vid principal y desinfecte la fruta lavando su superficie en el fregadero del laboratorio con un detergente líquido como 0.3% de cloroxilenol.Enjuague la fruta con abundante agua del grifo y séquela con toallas de papel limpias antes de transferir la fruta al gabinete de flujo de aire laminado. Esterilice la superficie de la fruta dentro del gabinete rociando etanol al 70%. Divide la fruta con un cuchillo estéril y extrae las semillas.Use fórceps estériles o manos con guantes estériles para abrir asépticamente la capa de semilla y exponer los embriones inmaduros antes de colocarlos en una placa de Petri que contenga MS Medium suplementado con antibióticos. Selle las placas de Petri con una película de envoltura y colóquelas en una cámara de crecimiento con una temperatura de 25 grados centígrados, un período fotográfico de 16 horas y una humedad relativa del 70%. En caso de contaminación, subcultive inmediatamente los embriones no contaminados en una nueva placa que tenga el mismo medio.Una vez que las raíces se desarrollan después de 10 a 14 días, y los cotiledones se desarrollan después de 15 a 21 días, retire las plántulas de las placas de Petri y lave suavemente los medios presentes alrededor de las raíces con agua del grifo. Coloque las plántulas limpias en un recipiente de plástico de 14 por 9 por 4 centímetros y cubra las raíces con toallas de papel húmedas. Cubra el recipiente y vuelva a humedecer las toallas de papel cuando sea necesario.Mantenga los recipientes de plástico a 25 a 28 grados centígrados, y en un período fotográfico de 16 horas para aclimatar las plántulas mientras mantiene la condición húmeda de las toallas de papel. Después de 7 a 10 días de aclimatación, transfiera las plántulas de tres a cuatro centímetros de largo a 50 pisos de celdas que contengan una mezcla comercial para macetas modificada con fertilizante y muévalas al invernadero. Evite el riego excesivo para evitar que se pudra y agregue aproximadamente de 10 a 20 mililitros de agua por celda según sea necesario.En la segunda a la tercera etapa de hoja verdadera, transplante las plántulas en macetas de 25 centímetros de diámetro llenas de medio para macetas modificado con fertilizante y realice una hibridación controlada cuando las plantas comiencen a florecer. Mantenga las plantas en el invernadero a 22 a 28 grados centígrados bajo el régimen de luz natural. Y evalúe las características de las plantas para las frutas y semillas.Se eligieron cuatro Cucurbita pepo y 11 Cucurbita moschata para hibridación interespecífica. De las 24 combinaciones cruzadas interespecíficas intentadas, se obtuvo un cuajado de frutos para 22 cruces que representan más del 92% de éxito en el cuajado. Los cruces entre Cucurbita moschata y Cucurbita pepo que involucran genotipos O y M, y genotipos E y J, no produjeron frutos maduros.Mientras que el cruce entre Cucurbita moschata y Cucurbita pepo que involucra los genotipos F y J, produjo seis frutos. El número de flores polinizadas para diferentes combinaciones cruzadas varió de 1 a 11. Y la tasa de éxito de la polinización varió de 0% a 100%De 44 frutas producidas a partir de todas las combinaciones cruzadas, solo una fruta de un cruce entre Cucurbita moschata y Cucurbita pepo, los genotipos C y J produjeron embriones inmaduros que pudieron ser rescatados.Para el desarrollo de estos embriones poco desarrollados, se cultivaron utilizando los medios de rescate de embriones, lo que resultó en una tasa de éxito del 80% para el rescate de embriones. Los dos procedimientos más importantes son la identificación de cruces compatibles entre dos especies, Cucurbita moschata y Cucurbita pepo, y la regeneración exitosa del embrión. Dado que la técnica de rescate de embriones es simple y fácilmente replicable, los criadores de calabaza de todo el mundo pueden usar esta técnica para rescatar embriones inmaduros derivados de cruces interespecíficos entre diferentes especies de Cucurbita.

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Research

Investigación

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