Name: Suplementación lipídica para la longevidad y análisis transcripcional de genes en Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T13:05:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Aprende estrategias de suplementación lipídica en Caenorhabditis elegans para estudios de longevidad y análisis transcripcional de genes. Este método permite evaluar cambios en la expresión génica desde pocos gusanos o tejidos disecados.

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Agradecemos a P. Svay por el apoyo de mantenimiento. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los NIH R01AG045183 (MCW), R01AT009050 (MCW), R01AG062257 (MCW), DP1DK113644 (MCW), March of Dimes Foundation (MCW), Welch Foundation (MCW), HHMI investigator (M.C.W.) y NIH T32 ES027801 predoctoral student fellow (M.S.). Algunas cepas fueron proporcionadas por el CGC, que está financiado por la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de los NIH (P40 OD010440).

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<li>Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+desaturation+and+the+regulation+of+adiposity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Fatty acid desaturation and the regulation of adiposity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 176 (2), 865-875 (2007).</li>
<li>Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulation+of+unsaturated+fatty+acid+composition+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic regulation of unsaturated fatty acid composition in C. elegans.</a> PloS Genetics. 2 (7), 108(2006).</li>
<li>Watts, J. L., Phillips, E., Griffing, K. R., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiencies+in+C20+poly-unsaturated+fatty+acids+cause+behavioral+and+developmental+defects+in+Caenorhabditis+elegans+fat-3+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Deficiencies in C20 poly-unsaturated fatty acids cause behavioral and developmental defects in Caenorhabditis elegans fat-3 mutants.</a> Genetics. 163 (2), 581-589 (2003).</li>
<li>Watts, J. L., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+poly-unsaturated+fatty+acid+synthesis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of poly-unsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (9), 5854-5859 (2002).</li>
<li>Watts, J. L., Browse, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoyl-CoA-specific+%CE%949+fatty+acid+desaturase+from+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Palmitoyl-CoA-specific Δ9 fatty acid desaturase from Caenorhabditis elegans.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (1), 263-269 (2000).</li>
<li>Watts, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat+synthesis+and+adiposity+regulation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Fat synthesis and adiposity regulation in Caenorhabditis elegans.</a> Trends in Endocrinology & Metabolism. 20 (2), 58-65 (2009).</li>
<li>Peyou-Ndi, M. M., Watts, J. L., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+an+animal+%CE%9412+fatty+acid+desaturase+gene+by+heterologous+expression+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of an animal Δ12 fatty acid desaturase gene by heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 376 (2), 399-408 (2000).</li>
<li>Spychalla, J. P., Kinney, A. J., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+animal+%CF%89-3+fatty+acid+desaturase+by+heterologous+expression+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Identification of an animal ω-3 fatty acid desaturase by heterologous expression in Arabidopsis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (4), 1142-1147 (1997).</li>
<li>Watts, J. L., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+a+%CE%945-fatty+acid+desaturase+from+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of a Δ5-fatty acid desaturase from Caenorhabditis elegans.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 362 (1), 175-182 (1999).</li>
<li>Deline, M. L., Vrablik, T. L., Watts, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+supplementation+of+polyunsaturated+fatty+acids+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dietary supplementation of polyunsaturated fatty acids in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e50879(2013).</li>
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<li>Qi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%CF%89-3+fatty+acid+%CE%B1-linolenic+acid+extends+Caenorhabditis+elegans+lifespan+via+NHR-49%2FPPAR%CE%B1+and+oxidation+to+oxylipins%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">The ω-3 fatty acid α-linolenic acid extends Caenorhabditis elegans lifespan via NHR-49/PPARα and oxidation to oxylipins.</a> Aging Cell. 16 (5), 1125-1135 (2017).</li>
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<li>Kass, J., Jacob, T. C., Kim, P., Kaplan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EGL-3+proprotein+convertase+regulates+mechanosensory+responses+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The EGL-3 proprotein convertase regulates mechanosensory responses of Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 21 (23), 9265-9272 (2001).</li>
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</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses.

La suplementación con lípidos se ha empleado en la investigación del envejecimiento para dilucidar el impacto directo de ciertas especies lipídicas en el envejecimiento saludable 6,7,23,26,27,31. Sin embargo, el procedimiento de suplementación con lípidos puede ser un desafío, y cualquier inconsistencia entre los experimentos...

Lípidos Los lípidos son pequeñas moléculas hidrofóbicas o anfipáticas solubles en disolventes orgánicos pero insolubles en agua 1,2. Las distintas moléculas lipídicas se diferencian entre sí en función del número de carbonos contenidos en sus cadenas, ubicación, número de dobles enlaces y estructuras unidas, incluidos el glicerol o los fosfatos. Los lípidos desempeñan un papel crucial dentro y a través de distintas células para regular las funciones del organismo, incluida la constitución de bicapas de membrana, el almacenamiento de energía y la actuación como moléculas de señalización 3,4.
En primer lugar, los lípidos son componentes estructurales de las membranas biológicas, incluyendo la membrana plasmática y las membranas subcelulares intracelulares que dividen los compartimentos internos del entorno extracelular. En segundo lugar, los lípidos son la principal forma de almacenamiento de energía en animales vertebrados e invertebrados. Los lípidos neutros, incluidos los triacilgliceroles, se almacenan durante un período prolongado en varios tejidos, incluido el tejido adiposo. En el nematodo Caenorhabditis elegans, el intestino es el principal órgano metabólico de almacenamiento de grasa; Su función no solo está involucrada en la digestión y absorción de nutrientes, sino también en el proceso de desintoxicación, que se asemeja a la actividad de los hepatocitos de mamíferos. Otros tejidos de almacenamiento de grasa incluyen la línea germinal, en la que los lípidos son esenciales para el desarrollo de ovocitos, y la hipodermis, que está compuesta por células epidérmicas similares a la piel 3,5. En tercer lugar, en los últimos años, más evidencia ha sugerido que los lípidos son poderosas moléculas de señalización involucradas en la señalización intra y extracelular al actuar directamente sobre una variedad de receptores, incluidos los receptores nucleares y acoplados a proteínas G, o indirectamente a través de la modulación de la fluidez de la membrana o modificaciones postraduccionales 6,7,8,9 . Otros estudios continuarán dilucidando los mecanismos moleculares subyacentes de la señalización lipídica en la promoción de la longevidad y la salud.
Los organismos modelo son importantes para abordar cuestiones biológicas específicas que son demasiado complejas para estudiarlas en humanos. Por ejemplo, el gusano redondo C. elegans es un excelente modelo para realizar análisis genéticos para diseccionar procesos biológicos relevantes para la nutrición humana y la enfermedad10. Las vías moleculares altamente conservadas relevantes para la fisiología humana, los tejidos complejos, los patrones de comportamiento y las abundantes herramientas de manipulación genética hacen de C. elegans un organismo modelo notable11. Por ejemplo, C. elegans es excelente en el envío de pantallas genéticas para identificar genes específicos del fenotipo, así como en pantallas genéticas inversas de todo el genoma a través de la interferencia de ARN12.
En los laboratorios, los nematodos se cultivan en placas de Petri de agar sembradas con un césped de bacterias Escherichia coli, proporcionando macronutrientes como proteínas, carbohidratos y ácidos grasos saturados e insaturados como fuentes de energía y bloques de construcción, y micronutrientes como cofactores y vitaminas13. Al igual que los mamíferos, los nematodos sintetizan moléculas de ácidos grasos tanto del ácido palmítico como del ácido esteárico (moléculas saturadas de 16 carbonos y 18 carbonos, respectivamente) que se desaturan secuencialmente y se alargan a una variedad de ácidos grasos monoinsaturados (MUFA) y ácidos grasos poliinsaturados (PUFA)14,15,16,17,18. Curiosamente, C. elegans es capaz de sintetizar de novo todos los ácidos grasos requeridos y enzimas centrales involucradas en la biosíntesis, desaturación y elongación de ácidos grasos, facilitando la síntesis de AGPI de cadena larga19. A diferencia de otras especies animales, C. elegans puede convertir ácidos grasos ω-6 de 18 carbonos y 20 carbonos en ácidos grasos ω-3 con sus propias enzimas desaturasas ω-3. Además, los gusanos poseen una Δ12 desaturasa que cataliza la formación de ácido linoleico (LA) a partir del ácido oleico (OA, 18:1)20,21. La mayoría de los animales o plantas carecen de desaturasas tanto Δ12 como ω-3 y, por lo tanto, dependen de la ingesta dietética de ω-6 y ω-3 para obtener sus AGPI, mientras que C. elegans no requiere ácidos grasos dietéticos22. Los mutantes aislados que carecen de enzimas desaturasas funcionales se han utilizado para estudiar las funciones de ácidos grasos específicos en distintos procesos biológicos, incluida la reproducción, el crecimiento, la longevidad y la neurotransmisión. El efecto de los ácidos grasos individuales sobre vías biológicas específicas puede ser abordado utilizando tanto un enfoque genético como la suplementación dietética16,17,23. Hasta la fecha, la investigación lipídica se ha centrado en la caracterización de genes implicados en la síntesis, degradación, almacenamiento y descomposición de lípidos en condiciones neurológicas y de desarrollo24. Sin embargo, los roles de los lípidos en la regulación de la longevidad apenas comienzan a revelarse.
Señalización lipídica en la regulación de la longevidad Los lípidos juegan un papel crucial en la regulación de la longevidad mediante la activación de cascadas de señalización celular en distintos tejidos y tipos de células. Estudios recientes han destacado el papel activo de los lípidos en la modulación de la transcripción y la comunicación célula-célula a través de proteínas de unión a lípidos o el reconocimiento de receptores de membrana25. Además, la suplementación con lípidos en la dieta ofrece una excelente herramienta para diseccionar cómo el metabolismo de los lípidos influye en la vida útil de C. elegans. Se ha demostrado que distintos MUFA y PUFA promueven la longevidad mediante la activación de factores de transcripción26,27.
Los modelos de longevidad, incluida la señalización de insulina/IGF-1 y la ablación de células precursoras de la línea germinal, están asociados con la vía de biosíntesis de MUFA, y la suplementación con MUFA, que incluye ácido oleico, ácido palmitoleico y cis-vaccénico, es suficiente para extender la vida útil de C. elegans 26. Aunque el efecto de longevidad conferido por la administración de MUFA requiere más investigación, es probable que el mecanismo subyacente esté mediado por el factor de transcripción SKN-1/Nrf2, que es un activador clave de la respuesta al estrés oxidativo y la regulación de la longevidad28,29. Entre los MUFA, una clase particular de etanolamidas de acilo graso llamadas N-aciletanolaminas (NAE) desempeña un papel crucial en distintos mecanismos, incluyendo inflamación, alergias, aprendizaje, memoria y metabolismo energético30. En particular, la molécula lipídica conocida como oleoiletanolamida (OEA) ha sido identificada como un regulador positivo de la longevidad al promover la translocación de la proteína de unión a lípidos 8 (LBP-8) en el núcleo para activar los receptores de hormonas nucleares NHR-49 y NHR-807. La suplementación del análogo OEA KDS-5104 es suficiente para prolongar la vida útil e induce la expresión de genes implicados en las respuestas al estrés oxidativo y en la β-oxidación mitocondrial 7,8.
Al mismo tiempo, el papel de los PUFA también se ha relacionado con la regulación de la longevidad. La administración de AGPI ω-3 de ácidos grasos α-ácido linolénico (ALA) promueve la longevidad activando los factores de transcripción NHR-49/PPARα, SKN-1/NRF e induciendo la β-oxidación mitocondrial31. Curiosamente, los productos peroxidados de ALA, conocidos como oxilipinas, activan SKN-1/NRF, sugiriendo que tanto los AGPI como sus derivados oxidativos pueden conferir beneficios de longevidad23. La suplementación de ácido graso ω-6 ácido araquidónico (AA) y ácido dihomo-γ-linolénico (DGLA) extiende la vida útil a través de la activación de la autofagia, promoviendo el control de calidad de las proteínas y resultando en la degradación de agregados proteicos desperdiciados y tóxicos27,32. Más recientemente, una regulación de señalización celular no autónoma mediada por la proteína de unión a lípidos 3 (LBP-3) y DGLA ha demostrado ser crucial para promover la longevidad mediante el envío de señales periféricas a las neuronas, lo que sugiere un papel de largo alcance de las moléculas lipídicas en la comunicación intertisular a niveles sistémicos33. El presente estudio informa cada paso para realizar la suplementación lipídica con bacterias sembradas en placas o suspensión bacteriana en cultivo líquido. Estas metodologías se utilizan para evaluar la vida útil y el análisis transcripcional, empleando contenido corporal completo o tejidos disecados derivados de unos pocos gusanos. Las siguientes técnicas se pueden adaptar a una variedad de estudios nutricionales y ofrecen una herramienta válida para diseccionar cómo el metabolismo de los lípidos influye en la longevidad y el envejecimiento saludable.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL Mortle</td><td>Genesee Scientific</td><td>93-165P15</td><td>Para molienda de gusanos con Trizol</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9639-500G</td><td></td></tr><tr><td>AmfiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix</td><td>GenDEPOT</td><td>R5600</td><td>Para la transcripción inversa de muestras de gusanos a granel</td></tr><tr><td>Applied Biosystems QuanStudio 3 PCR en tiempo real</td><td>ThermoFisher</td><td>A28567</td><td>para qRT-PCR</td></tr><tr><td>Microcentrífuga Benchmark Scientific StripSpin 12</td><td>Benchmark Scientific</td><td>C1248</td><td>Para tubos de PCR giratorios</td></tr><tr><td>Branson 450 Sónico digital, con punta de 1/8"</td><td>Branson Ultrasonic Corporation</td><td>100-132-888R</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Fisher Scientific</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Sigma</td><td>C8503-25G</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D8418-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Eppendorf 5424 R</td><td>Eppendorf</td><td>22620444R</td><td>Para extracción de ARN</td></tr><tr><td>Eppendorf vapo protect mastercycler pro</td><td>Eppendorf</td><td>950030010</td><td>Para transcripción inversa</td></tr><tr><td>Etanol, absoluto (200 pruebas)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-500</td><td></td></tr><tr><td>Greiner Bio-One CELLSTAR, placa de 12 W</td><td>Neta Scientific</td><td>665180</td><td>12 pocillos Placas para alimentación LiCuid</td></tr><tr><td>Placa de Petri Greiner Bio-One, Ps, 100 x 20 mm</td><td>Neta Scientific</td><td>664161</td><td>Para placas LB bacterianas y placas NGM de 10 cm</td></tr><tr><td>Greiner Bio-One Placa de Petri, Ps, 60 x 15 mm</td><td>Neta Scientific</td><td>628161</td><td>Para gusanosPlacas NGM de 6 cm</td></tr><tr><td>Invitrogen Agua sin nucleasas</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Isoproanol</td><td>Sigma</td><td>PX1835-2</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de levamisol</td><td>VWR</td><td>SPCML1054</td><td></td></tr><tr><td>lipl-4Tg</td><td>MCW Lab</td><td>N/A</td><td>Transgénico C. elegans</td></tr><tr><td>lipl-4Tg; fat-3(WA22)</td><td>MCW Lab</td><td>N/A</td><td>Transgénico C. elegans</td></tr><tr><td>Luria Base de caldo</td><td>ThermoFisher</td><td>12795-084</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio (MgSO4)</td><td>Sigma</td><td>M2643-500G</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp EnduraPlate Placa óptica de reacción rápida y transparente de 96 pocillos con código de barras</td><td>ThermoFisher</td><td>4483354</td><td>placa</td></tr> <tr><td>qPCR de 96 pocillosPelícula adhesiva óptica MicroAmp</td><td>BioSystem aplicada</td><td></td><td>4311971 Para sellar la placa qPCR de 96 pocillos</td></tr><tr><td>Sistema de purificación de agua Milli-Q Advantage A10</td><td>Sigma</td><td>Z00Q0V0WW</td><td>Agua desionizada utilizada para fabricar todos los reactivos, incluidos los medios tampón y culturales, a menos que se especifique como agua libre de nucleasas en el protocolo</td></tr><tr><td>N2</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>N/A</td><td>C. ELEGANS aislado silvestre</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro NanoDrop ND-1000</td><td>ThermoFisher</td><td>N/A</td><td>Para medir la concentración de ARN</td></tr><tr><td>OP50</td><td>Centro de Genética de Caenorhabditis</td><td>N/A</td><td>Bacterias utilizadas como alimento C. elegans</td></tr><tr><td>Fosfato de potasio dibásico trihidrato (K2HPO4&middot; 3H2O)</td><td>Sigma</td><td>P5504-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4)</td><td>Sigma</td><td>P0662-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Kit de celdas verdes a Ct</td><td>ThermoFisher</td><td>4402953</td><td>Para la transcripción inversa y qPCR de unos pocos gusanos o tejido de lombriz</td></tr><tr><td>Power SYBR Green Master Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>4367659</td><td>para qPCR a partir de muestras de gusanos a granel</td></tr><tr><td>Pure Bright germicida ultra bleach&nbsp;</td><td>KIK International LLC.</td><td>59647210143</td><td>6% de lejía doméstica Para la preparación de huevos de lombriz</td></tr><tr><td>Placa puntual Pyrex con nueve depresiones</td><td>Sigma</td><td>CLS722085-18EA Vidrio de</td><td>reloj para diseccionar los gusanos</td></tr><tr><td>RNaseZap Solución de descontaminación de RNasa</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Sigma</td><td>S7653-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio (NaOH)</td><td>Sigma</td><td>SX0590-3</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico heptahidratado (Na2HPO4&middot; 7H2O)</td><td>Sigma</td><td>S9390-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Thermo Sorvall Legend Mach 1.6R</td><td>Thermo</td><td>7500-4337</td><td>Para la recogida de bacterias</td></tr><tr><td>Centrífuga Thermo Sorvall ST 8</td><td>Thermo</td><td>7500-7200</td><td>Para la preparación de huevos de lombriz</td></tr><tr><td>Reactivo TRIzol Reactivo</td> de <td>extracción de ARN</td><td>TheroFisher</td><td></td></tr><tr><td>15596018 Kit sin ADN Turbo ThermoFisher</td><td></td><td>AM1907</td><td>Para eliminar la contaminación del ADN en extracciones de ARN</td></tr><tr><td>Vortexer 59</td><td>Denville Scientific INV</td><td>S7030</td><td></td></tr><tr><td>VWR Mezcladores de pellets desechables y motor inalámbrico</td><td>VWR</td><td>47747-370</td><td>Para la molienda de gusanos con Trizol</td></tr><tr><td>Minicentrífuga VWR Kinetic Energy 26 Joules C1413 V-115</td><td>VWR</td><td>N/A</td><td>Para la recogida de gusanos. Modelo descontinuado, uno similar disponible en VWR con Cat# 76269-064</td></tr><tr><td>Recogedor de gusanos</td><td>WormStuff</td><td>59-AWP</td><td></td></tr></tbody></table>

suplementación lipídica para la longevidad y análisis transcripcional de genes en caenorhabditis elegans

Lipid Supplementation for Longevity and Gene Transcriptional Analysis in Caenorhabditis elegans

El envejecimiento es un proceso complejo caracterizado por cambios fisiológicos progresivos resultantes de contribuciones ambientales y genéticas. Los lípidos son cruciales para constituir componentes estructurales de las membranas celulares, almacenar energía y como moléculas de señalización. La regulación del metabolismo lipídico y la señalización es esencial para activar distintas vías de longevidad. El gusano redondo Caenorhabditis elegans es un organismo excelente y poderoso para diseccionar la contribución del metabolismo lipídico y la señalización en la regulación de la longevidad. Múltiples estudios de investigación han descrito cómo la suplementación dietética de moléculas lipídicas específicas puede extender la vida útil de C. elegans ; Sin embargo, las diferencias menores en las condiciones de suplementación pueden causar problemas de reproducibilidad entre los científicos en diferentes laboratorios. Aquí, se informan dos métodos detallados de suplementación para C. elegans que emplean suplementos de lípidos con bacterias sembradas en placas o suspensión bacteriana en cultivo líquido. También se proporcionan aquí los detalles para realizar ensayos de vida útil con suplementos lipídicos de por vida y análisis qRT-PCR utilizando un lisado de gusanos enteros o tejidos disecados derivados de unos pocos gusanos. Utilizando una combinación de estudios longitudinales e investigaciones transcripcionales sobre la suplementación con lípidos, los ensayos de alimentación proporcionan enfoques confiables para diseccionar cómo los lípidos influyen en la longevidad y el envejecimiento saludable. Esta metodología también se puede adaptar para varios enfoques de detección nutricional para evaluar los cambios en un subconjunto de transcripciones utilizando un pequeño número de tejidos disecados o unos pocos animales.

Validación de cambios transcripcionales usando unos pocos gusanos enteros sobre la suplementación de lípidos Para investigar si el protocolo para extraer y retrotranscribir ARN en ADNc de unos pocos gusanos enteros es reproducible y comparable con los datos de gusanos a granel, se empleó una cepa de gusano de larga vida que sobreexpresa la lipasa ácida lisosomal lipl-4 en el intestino 7,8,33,35....

El presente protocolo describe métodos de suplementación lipídica en cultivos líquidos y en placa para Caenorhabditis elegans, junto con estudios longitudinales y análisis transcripcionales de genes a granel o unos pocos gusanos y tejidos de gusanos.

Suplementación lipídica para la longevidad y análisis transcripcional de genes en Caenorhabditis elegans

Aging is a complex process characterized by progressive physiological changes resulting from both environmental and genetic contributions. Lipids are ...

Este protocolo describe dos estrategias de suplementación lipídica con una combinación de análisis longitudinal y transcripcional en el organismo modelo, C.elegans. La técnica describe cómo examinar los cambios transcripcionales utilizando pocos gusanos o tejidos de gusanos disecados y cómo la alimentación líquida para una población de insectos podría combinarse con técnicas hidráulicas. Las personas que realizan esta técnica deben practicar la disección de tejidos debido a la corta ventana de tiempo para realizar el experimento para lograr un análisis transcripcional adecuado.Para comenzar, recolecte la bacteria OP50 centrifugando el cultivo cultivado durante la noche a 4, 000 G durante 10 minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante. Suspender el pellet bacteriano en 20 mililitros de dilución bacteriana, restricción dietética o base BDR por vórtice y nuevamente, repetir la centrifugación durante 10 minutos.Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet bacteriano en el medio BDR para preparar un stock bacteriano 20 X BDR. Diluir el stock bacteriano a 5X usando un medio BDR antes de usarlo. Usando etanol o sulfóxido de dimetilo como solvente, prepare una solución de reserva lipídica en un nuevo vial de vidrio esterilizado en autoclave y llene el vial de vidrio con argón o nitrógeno para evitar la oxidación.Transfiera la solución de reserva lipídica a la solución de bacterias BDR para lograr la concentración final deseada en condiciones de alimentación. Mezclar bien mediante vórtice durante 20 segundos. Preparar el vehículo controlado mezclando los mismos volúmenes de etanol filtrado o dimetilsulfóxido con bacterias BDR.Realice la suplementación de lípidos y el cultivo líquido transfiriendo la cantidad deseada de control de lípidos o vehículos a cada pocillo de una placa de 12 pocillos con tres o cuatro réplicas para cada condición de alimentación. Mezcle la suspensión sincronizada de gusanos Caenorrhabditis elegans con bacterias 5X BDR en una proporción de uno a uno para lograr una concentración final de 1, 500 gusanos por mililitro y 2.5X para bacterias. Luego transfiera dos mililitros de la mezcla de bacterias del gusano a cada pocillo de la placa de 12 pocillos.Cuando haya terminado, envuelva la placa de 12 pocillos con papel de aluminio y agite la placa en una incubadora de 20 grados centígrados a 100 RPMM para obtener la longitud de incubación deseada. Para la suplementación de lípidos en placas, siembre un mililitro de las bacterias condicionadas por lípidos en el centro de un medio de crecimiento de nematodos de 10 centímetros o placa de agar NGM. Asegúrese de que la solución de trabajo final se mueva varias veces entre la siembra de las dos placas cuando trabaje con un gran número de placas.Seque la placa en la oscuridad dentro de una campana de bioseguridad. Transfiera 3000 gusanos del cultivo de gusanos sincronizado a la placa de 10 centímetros. Seque la placa en una campana de bioseguridad hasta que los gusanos que nadaban en las placas suplementadas con lípidos comiencen a gatear.Una vez seca, incubar la placa acondicionada con lípidos en una incubadora de 20 grados centígrados durante el tiempo deseado y, si usa lípidos poliinsaturados, proteja la placa de la luz. Prepare 20 microlitros de solución de lisis final para cada muestra mezclando 0,2 microlitros de DNasa I con 19,8 microlitros de solución de lisis en un tubo de PCR y mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo cinco veces. Para extraer el ARN del pequeño número de gusanos enteros, elimine las bacterias transfiriendo de 15 a 20 gusanos del césped bacteriano a una placa NGM recién sin sembrar.Transfiera de 15 a 20 gusanos de la placa NGM sin sembrar al tubo de PCR que contiene 20 microlitros de la solución de lisis final recién preparada con el número mínimo de bacterias e incube la reacción de lisis durante cinco minutos a temperatura ambiente. Una vez finalizada la incubación, mantenga la muestra en un buen baño de agua fría y sonice sonicar los gusanos cuatro veces, cinco segundos cada vez con 30% de amplitud y pulso durante 15 segundos entre cada momento de sonicación. Incubar el tubo a temperatura ambiente durante cinco minutos antes de agregar dos microlitros de solución de parada en la reacción de lisis y mezclar con golpeteo suave.Incubar la reacción durante dos minutos a temperatura ambiente y luego colocar el tubo en hielo. Para extraer el ARN del tejido del gusano, recoja alrededor de 20 gusanos del césped bacteriano y colóquelos en una placa NGM fresca sin semillas para eliminar las bacterias de los gusanos. Transfiera 20 gusanos con la menor cantidad posible de bacterias a un vidrio de reloj que contenga 500 microlitros de solución M9 que contenga cuatro levamisoles micromolares.Cuando los gusanos estén inmovilizados, diseccionar la línea germinal o el intestino con una aguja de calibre 25 que se puede conectar a la jeringa de un mililitro. Usando una pipeta de vidrio esterilizada en autoclave, transfiera los tejidos disecados al tubo de PCR y coloque el tubo en hielo durante dos minutos permitiendo la deposición del material en la parte inferior. Retire el sobrenadante del tubo de PCR antes de agregar 20 microlitros de solución de lisis final y mezcle bien golpeando.Después de incubar la reacción de lisis durante cinco minutos, agregue dos microlitros de solución de parada y golpee el tubo varias veces. Incubar el tubo durante dos minutos antes de proceder a la transcripción inversa. En el estudio de validación, el ARN extraído de una gran población y unos pocos gusanos mostraron una inducción similar de los genes de procesamiento de neuropéptidos, egl-3 y egl-21.Sugiere que la extracción de ARN de unos pocos gusanos puede ser una alternativa válida a las técnicas estándar de síntesis de CDNA de grandes poblaciones. En el intestino diseccionado de los gusanos transgénicos lipl-4, suplementado con ácido dihomo-gamma-linolénico, o DGLA, no se indujeron los genes de procesamiento de neuropéptidos neuronales. La suplementación con DGLA a diferentes concentraciones rescató la extensión de la vida útil en los gusanos tras la eliminación de grasa-3.Los gusanos con suplementos lipídicos también pueden procesarse para secuenciación de ARN, proteómica, metabolómica y estudios de comportamiento para identificar fenotipos adicionales bajo estas condiciones específicas. Esta metodología se puede aplicar a la investigación del envejecimiento, la biología de los lípidos y cualquier otra área de investigación que tenga como objetivo establecer una relación entre un determinado fenotipo y un factor nutricional o metabolito.

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