Name: Síntesis microfluídica de bloques de construcción de microgel para andamios de partículas recocidas microporosas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T14:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Aprende a sintetizar microgeles monodispersos mediante microfluídica para crear andamios porosos en medicina regenerativa. Este protocolo de alto rendimiento mejora la uniformidad y la integración tisular.

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Los autores desean agradecer a Joe de Rutte y al Laboratorio Di Carlo de la Universidad de California, Los Ángeles, por su ayuda con el diseño original del dispositivo microfluídico a partir del cual se desarrolló el dispositivo informado, así como su orientación temprana en la fabricación y solución de problemas del dispositivo PDMS. Los esquemas de las figuras se crearon con Biorender.com.

<ol><li>Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., di Carlo, D., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+wound+healing+by+injectable+microporous+gel+scaffolds+assembled+from+annealed+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks.</a> Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).</li>
<li>Koh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+in+vivo+delivery+of+stem+cells+using+microporous+annealed+particle+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Enhanced in vivo delivery of stem cells using microporous annealed particle scaffolds.</a> Small. 15 (39), 1903147(2019).</li>
<li>Pruett, L. J., Jenkins, C. H., Singh, N. S., Catallo, K. J., Griffin, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin+microislands+in+microporous+annealed+particle+scaffolds+for+accelerated+diabetic+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Heparin microislands in microporous annealed particle scaffolds for accelerated diabetic wound healing.</a> Advanced Functional Materials. 31 (35), 2104337(2021).</li>
<li>Darling, N. J., Sideris, E., Hamada, N., Carmichael, S. T., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+and+spatially+patterned+microporous+annealed+particle+%28MAP%29+hydrogels+for+tissue+repair+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">Injectable and spatially patterned microporous annealed particle (MAP) hydrogels for tissue repair applications.</a> Advanced Science. 5 (11), 1801046(2018).</li>
<li>Isaac, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microporous+bio-orthogonally+annealed+particle+hydrogels+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).</li>
<li>Pruett, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+microporous+annealed+particle+hydrogel+for+long-term+vocal+fold+augmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Development of a microporous annealed particle hydrogel for long-term vocal fold augmentation.</a> Laryngoscope. 130 (10), 2432-2441 (2020).</li>
<li>Nih, L. R., Sideris, E., Carmichael, S. T., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+microporous+annealing+particle+%28MAP%29+hydrogels+in+the+stroke+cavity+reduces+gliosis+and+inflammation+and+promotes+NPC+migration+to+the+lesion%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Injection of microporous annealing particle (MAP) hydrogels in the stroke cavity reduces gliosis and inflammation and promotes NPC migration to the lesion.</a> Advanced Materials. 29 (32), (2017).</li>
<li>Griffin, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+an+adaptive+immune+response+from+a+hydrogel+scaffold+imparts+regenerative+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing.</a> Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).</li>
<li>Sideris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+hydrogels+based+on+hyaluronic+acid+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).</li>
<li>Schaeffer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+microannealed+porous+scaffold+for+articular+cartilage+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Plastic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Injectable microannealed porous scaffold for articular cartilage regeneration.</a> Annals of Plastic Surgery. 84, 6S Suppl 5 446-450 (2020).</li>
<li>Pruett, L., Ellis, R., McDermott, M., Roosa, C., Griffin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+heterogeneous+epidermal+growth+factor+release+from+microporous+annealed+particle+%28MAP%29+hydrogel+for+improved+wound+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Spatially heterogeneous epidermal growth factor release from microporous annealed particle (MAP) hydrogel for improved wound closure.</a> Journal of Materials Chemistry B. 9 (35), 7132-7139 (2021).</li>
<li>Jivan, F., Alge, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-orthogonal%2C+site-selective+conjugation+of+recombinant+proteins+to+microporous+annealed+particle+hydrogels+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Bio-orthogonal, site-selective conjugation of recombinant proteins to microporous annealed particle hydrogels for tissue engineering.</a> Advanced Therapeutics. 3 (1), 1900148(2020).</li>
<li>de Rutte, J. M., Koh, J., di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+high-throughput+production+of+modular+microgels+for+in+situ+assembly+of+microporous+tissue+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds.</a> Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071(2019).</li>
<li>Pfaff, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+and+improved+photoannealing+of+microporous+annealed+particle+%28MAP%29+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Selective and improved photoannealing of microporous annealed particle (MAP) scaffolds.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (2), 422-427 (2021).</li>
<li>Darling, N. J., Hung, Y. S., Sharma, S., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+kinetics+of+thiol-maleimide+Michael-type+addition+gelation+kinetics+for+the+generation+of+homogenous+poly%28ethylene+glycol%29+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Controlling the kinetics of thiol-maleimide Michael-type addition gelation kinetics for the generation of homogenous poly(ethylene glycol) hydrogels.</a> Biomaterials. 101, 199-206 (2016).</li>
<li>Sandell, J. L., Zhu, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+in-vivo+optical+properties+of+human+tissues+and+its+impact+on+PDT%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">A review of in-vivo optical properties of human tissues and its impact on PDT.</a> Journal of Biophotonics. 4 (11-12), 773-787 (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Este protocolo describe métodos para sintetizar y caracterizar microgeles, que sirven como bloques de construcción para andamios de partículas recocidas microporosas (MAP). Este protocolo utiliza un enfoque microfluídico de alto rendimiento para generar grandes volúmenes de microgeles uniformes, lo que no se puede lograr con otros métodos como la microfluídica de enfoque de flujo 1,4,7,9 (alta monodisperisidad, bajo rendimiento), emulsión por lotes 6,10 y electropulverización 5,12 (baja monodispersidad, alto rendimiento). Con los métodos descritos en la presente invención, se pueden fabricar microgeles monodispersos para su uso en andamios MAP que se pueden usar para una variedad de aplicaciones de medicina regenerativa (por ejemplo, administración celular, cicatrización de heridas).
Un paso crítico de este protocolo es la creación de los dispositivos microfluídicos PDMS. Si los dispositivos no se fabrican correctamente, esto podría tener efectos negativos posteriores en la formación de microgel y la monodispersión. Es importante evitar la introducción de artefactos (es decir, burbujas, polvo) en el PDMS antes de que se cure, ya que esto podría obstruir los canales y afectar significativamente la formación de microgel. Para mitigar esto tanto como sea posible, uno debe usar cinta adhesiva para eliminar el polvo, almacenar los dispositivos en un recipiente libre de polvo y trabajar en una capucha libre de polvo, si es posible. También se recomienda almacenar los dispositivos a 60 °C para obtener los mejores resultados con el tratamiento de la superficie.
Al verter los dispositivos PDMS, es importante mantener un grosor uniforme que sea aproximadamente igual o menor que la longitud del punzón de biopsia. Si el dispositivo es demasiado grueso, el punzón de biopsia no podrá penetrar hasta el final. También es crucial no romper las entradas/salidas del dispositivo PDMS mientras se perfora con el punzón de biopsia y/o se inserta un tubo. Un desgarro en el dispositivo PDMS causará fugas de las entradas / salidas, lo que puede causar la pérdida de la solución precursora de gel. Si hay fugas en un dispositivo PDMS, la mejor solución es reemplazarlo con un nuevo dispositivo lo más rápido posible.
Al tratar con plasma el dispositivo, el uso de oxígeno puro y el tratamiento con plasma durante 30 s ha producido los mejores resultados para adherir PDMS al portaobjetos de vidrio. Si el dispositivo no se adhiere correctamente (es decir, el PDMS aún se puede levantar del portaobjetos de vidrio después del tratamiento con plasma), se debe verificar que el tratador de plasma funcione correctamente y que el dispositivo y los portaobjetos se hayan limpiado a fondo. También es importante utilizar el tratamiento superficial de silano correcto y, para obtener los mejores resultados, los dispositivos PDMS deben tratarse directamente antes de su uso. También podrían utilizarse otros métodos de tratamiento de superficies, como la deposición química de vapor.
Otro paso crucial es utilizar correctamente los dispositivos microfluídicos PDMS para la formación de microgeles. Se recomienda utilizar una relación de caudal de al menos 2:1 (este protocolo utiliza un caudal de aceite de 6 ml/h y un caudal acuoso de 3 mL/h), pero esto se puede ajustar para lograr el tamaño de microgel deseado. El pH de la solución precursora de microgel también es una métrica importante a optimizar para evitar la obstrucción del dispositivo. La solución salina tamponada con fosfato (PBS) acelera la formación de tiolatos en la química de adición de tipo Michael, y las concentraciones de PBS utilizadas en este protocolo producen los mejores resultados para la gelificación de microgel en los dispositivos microfluídicos. Una vez que se inician las bombas de jeringa, puede haber algunas burbujas en los canales microfluídicos, pero esto debería equilibrarse después de unos minutos. Se recomienda controlar la formación de microgel con un microscopio. Si el flujo no se ve similar al de este video y / o hay algunos canales que producen partículas grandes, es probable que esto se deba a problemas con el paso de tratamiento de la superficie. La mejor solución es reemplazar el dispositivo por uno que haya sido recién tratado en la superficie.
Si los microgeles parecen estar fusionándose, esto puede deberse a una concentración insuficiente de fluorosurfactante. La solución recomendada es aumentar el % en peso del surfactante en la fase oleosa. Sin embargo, una limitación para usar altas concentraciones de surfactante es que puede ser más difícil de eliminar durante la etapa de purificación. Se recomienda usar dispositivos microfluídicos una sola vez, pero los dispositivos se pueden reutilizar si se lavan con aceite Novec inmediatamente después de su uso para eliminar cualquier solución acuosa que pueda gelificar el dispositivo y obstruir los canales. Mientras que un dispositivo microfluídico puede producir un volumen de alto rendimiento de microgeles (ml / h), esta tasa de producción se puede escalar mediante el uso de múltiples dispositivos microfluídicos en paralelo.
El paso de recocido del conjunto de andamio MAP se basa en el uso de un fotoiniciador activado por luz de polimerización radical, y el fotoiniciador se puede seleccionar en función de la aplicación deseada. Por ejemplo, el fotoiniciador LAP tiene tiempos de recocido rápidos (<30 s) cuando se utiliza luz UV de onda larga, lo que tiene un impacto mínimo en la viabilidad celular in vitro14. Sin embargo, esta longitud de onda es altamente absorbida por el tejido16 y puede no tener una eficacia de recocido tan alta in vivo como in vitro.
La eosina Y es otro fotoiniciador activado por longitudes de onda visibles (505 nm) y tiene una penetración más profunda en el tejido, lo que mejora la capacidad del andamio MAP para ser recocido debajo del tejido. Sin embargo, los largos tiempos de exposición a la luz necesarios para el recocido de eosina Y pueden prolongar la exposición celular a los radicales libres e impactar la viabilidad celular in vitro14. El uso de estos métodos para la generación de alto rendimiento de bloques de construcción de microgel altamente uniformes acelerará la investigación centrada en andamios MAP y avanzará en el conocimiento en el campo de los materiales porosos inyectables para la medicina regenerativa.

La plataforma de andamio MAP es un biomaterial inyectable compuesto completamente de micropartículas de hidrogel (microgeles) que proporcionan microporosidad a escala celular cuando se entrecruzan, lo que permite la migración celular independiente de la degradación y la integración de tejidos a granel1. Debido a su capacidad para integrarse rápidamente con el tejido huésped y su inmunogenicidad inherentemente baja, la plataforma de andamio MAP ha demostrado aplicabilidad preclínica para una amplia variedad de terapias de medicina regenerativa 2,3,4,5,6,7,8,9,10, incluida la aceleración de la cicatrización de heridas dérmicas 1,3 ,11, revascularizar la cavidad 7 del accidente cerebrovascularcerebral, administrar células madre mesenquimales2 y proporcionar aumento de volumen tisular para tratar la insuficiencia glótica6. También se ha demostrado que MAP transmite efectos antiinflamatorios al tejido huésped a través del reclutamiento de macrófagos M23 e incluso puede ajustarse para promover una respuesta inmune Th2 de "reparación tisular"8. Estas propiedades favorables de la plataforma de andamio MAP permiten expandirla a una amplia gama de aplicaciones clínicas.
Los métodos publicados anteriormente para generar microgeles para la formación de andamios MAP han incluido microfluídica de gotas de enfoque de flujo 1,4,7,9, electropulverización 5,12 y centrifugado aéreo con emulsión por lotes 6,10. El método microfluídico de gotas puede producir partículas con alta monodispersidad pero utiliza caudales muy lentos que producen bajos rendimientos de partículas (μL / h). Alternativamente, los métodos de electropulverización y emulsión por lotes pueden producir un alto volumen de partículas, pero con alta polidispersidad de partículas. Este protocolo utiliza un método microfluídico de alto rendimiento para producir microgeles con una población monodispersa, basado en el trabajo de Rutte et al13. Este método utiliza técnicas de litografía blanda para hacer un dispositivo microfluídico de polidimetilsiloxano (PDMS) a partir de una fotomáscara, que luego se une a un portaobjetos de vidrio. El diseño del dispositivo se basa en la emulsificación escalonada para generar un alto volumen de partículas de microgel (ml / h). La monodispersidad que se puede lograr con este método proporciona un control superior de la porosidad en comparación con otras técnicas, ya que los microgeles monodispersos pueden formar andamios con tamaños de poro más uniformes2.
Los métodos para sintetizar y caracterizar los microgeles individuales que pueden actuar como bloques de construcción para andamios MAP se describen dentro de este manuscrito, específicamente en términos de creación de microgeles que consisten en una columna vertebral PEG con un grupo de maleimida (MAL), que participa fácilmente en la adición eficiente de tipo Michael con reticulantes funcionalizados con tiol para la gelificación de microgel. Para desacoplar la gelificación de microgel del recocido de andamios MAP, este manuscrito también describe cómo sintetizar un macrómero de recocido personalizadopublicado de 14 , MethMAL, que es un macrómero PEG heterofuncional de metacrilamida / maleimida de 4 brazos. Los grupos funcionales de metacrilamida participan fácilmente en la fotopolimerización de radicales libres (para el recocido de microgel), mientras que permanecen relativamente inertes a las condiciones que promueven la adición de tipo Michael para los grupos funcionales MAL.
Además, este manuscrito describe los protocolos para crear dispositivos microfluídicos PDMS, determinar la cinética de gelificación de microgel y caracterizar el tamaño del microgel. La parte final del manuscrito detalla el recocido del andamio MAP, que es cuando los microgeles se transfieren in situ a un andamio a granel a través de un paso de reticulación secundario iniciado por la foto que une covalentemente las superficies de los microgeles. Es importante tener en cuenta que existen otros métodos de recocido que pueden implementarse en sistemas de andamios MAP que no dependen de productos químicos basados en la luz, como el recocido mediado por enzimas, como se describió anteriormente1. En general, estos métodos se pueden usar directamente o con diferentes productos químicos de formulación de hidrogel (por ejemplo, a base de ácido hialurónico) para generar andamios MAP para cualquier aplicación.

<table><tbody><tr><td>Clorhidrato de 2-aminoetanotiol</td><td>Acros Organics</td><td>AC153770250</td><td>para la síntesis de metMa MW: 113,61 Da</td></tr><tr><td>Rotor de placa de 35 mm Geometría</td><td>HAAKE</td><td>P35/Ti</td><td>para viscosímetro HAAKE</td></tr> 4 <tr><td>brazos PEG-Maleimida (10 kDa)</td><td>NOF AMERICA Corporation</td><td>SUNBRIGHT PTE-100MA</td> Para solución precursora de <td>microgel</td></tr><tr><td>PEG-Maleimida de 4 brazos (20 kDa)</td><td>NOF AMERICA Corporación</td><td>SUNBRIGHT PTE-200MA</td><td>Para MethMal Synthesis Peso molecular específico para cada lote</td></tr><tr><td>Jeringa BD con puntas Luer-Lok</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>Jeringas de plástico desechables</td></tr><tr><td>Punzón de biopsia</td><td>Mitex</td><td>MLTX33-31A-P/25</td><td>1,5 mm de diámetro</td></tr><tr><td>Cloroformo-d</td><td>Acros Organics</td><td>AC209561000</td><td>para la síntesis de MethMal</td></tr><tr><td>Luz LED colimada Fuente</td><td>: ThorLabs</td><td>M365LP1-C1 Plato de cultivo de</td><td>365 nm</td></tr><tr><td>(15 cm)</td><td>Corning</td><td>CLS430599</td><td>150 mm x 25 mm</td></tr><tr><td>DMTMM(4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metil-morfolinio</td> <td>cloruro</td>)<td>Oakwood Chemical 151882</td><td>para la síntesis de metmales MW: 276.72 Da</td></tr><tr><td>Fluorosurfactant</td><td>Ran Technologies</td><td>008-Flurosurfactant-5wtH-200G</td><td>5 porcentaje en peso de 008- Flurosurfactante en HFE7500</td></tr><tr><td>FreeZone Triad Triad Liofilizado</td> Serie <td>Labconco</td><td>7400000</td><td>para síntesis de metales Liofilizador</td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-A3</td><td>Portaobjetos de vidrio liso, sin recubrimiento</td></tr><tr><td>Viscosímetro HAAKE Rheowin</td><td>HAAKE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>versión 1.8.0_172</td></tr><tr><td>KDS Legato 210 Jeringa de doble punta Bomba</td><td>Kd Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Controlador LED</td><td>ThorLabs</td><td>DC2200</td><td></td></tr><tr><td>Fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato (LAP)</td><td>Fotoiniciador</td>de <td>900889</td> <td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Ácido metacrílico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>155721</td><td>para la síntesis de MethMa MW: 86.09 Da Densidad: 1.015g/</td></tr><tr><td>mL Dispositivo microfluídico SU8-Si oblea maestra</td><td>FlowJem</td><td>N/A</td><td>Hecho a medida, con silanización</td></tr><tr><td>Reticulante degradable MMP-2</td><td>Secuencia FlowJem</td><td></td><td>: Ac-GCGPQGIAGQDGCG-NH2</td></tr><tr><td>Agujas (25 G, biseladas)</td><td>BD</td><td>305122</td><td>Longitud: 15,88 mm Calibre: 0,5 mm</td></tr><tr><td>Novec 7500</td><td>3M</td><td>7100025016</td><td>Aceite fluorado</td></tr><tr><td>Oxígeno</td><td>Praxair</td><td>UN1072</td><td>Tubo</td></tr> de <tr><td>Peek comprimido</td><td>Trajan Scientific</td><td>03-350-523</td><td>1/32" de diámetro exterior; 0.02" de diámetro interior; 10' de longitud</td></tr><tr><td>PFOCTS (tricloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silano)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448931</td><td>Para el tratamiento de superficies</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Fisher BioReagants</td><td>BP3994</td><td>Diluido a 1x en agua ultrapura, pH = 7.4</td></tr><tr><td>Limpiador de plasma</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001-HP</td><td></td></tr><tr><td>Hoja de afeitar</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>RGD péptido adhesivo celular WatsonBio</td><td>Sciences</td><td></td><td>Secuencia: Ac-RGDSPGGC-NH2</td></tr><tr><td>Rheowin software</td><td>HAAKE&nbsp;</td><td></td><td>Software compatible con el viscosímetro HAAKE</td></tr><tr><td>Hoja de bisturí</td><td>Bard-Parker</td><td>371210</td><td>Tamaño: #10</td></tr><tr><td>Mango de bisturí</td><td>Bard-Parker</td><td>371030</td><td>Tamaño: #3</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP358-1</td><td>para la síntesis de metanfetaminas MW: 58.44 Da</td></tr><tr><td>Sylgard 184 kit de elastómero de silicona</td><td>DOW Chemical</td><td>2065622</td><td>Base y agente de curado</td></tr><tr><td>Trietilamina</td><td>Fisher Scientific</td><td>O4884-100</td><td>para síntesis de metMa MW: 101.19 da Densidad: 0,73 g/</td></tr><tr><td>mL Tubo Tygon</td><td>Saint Gobain Performance Plastics</td><td></td><td>AAD04103 ID: 0,51 mm OD: 1,52 mm</td></tr><tr><td>Espectrómetro Varian Inova 500</td><td>Varian</td><td></td><td>NMR ubicado en la instalación de resonancia magnética biomolecular de la UVA</td></tr></tbody></table>

síntesis microfluídica de bloques de construcción de microgel para andamios de partículas recocidas microporosas

Microfluidic Synthesis of Microgel Building Blocks for Microporous Annealed Particle Scaffold

La plataforma de andamio de partículas recocidas microporosas (MAP) es una subclase de hidrogeles granulares. Se compone de una suspensión inyectable de microgeles que puede formar un andamio estructuralmente estable con porosidad a escala celular in situ después de un paso secundario de reticulación química basada en la luz (es decir, recocido). El andamio MAP ha demostrado éxito en una variedad de aplicaciones de medicina regenerativa, incluida la cicatrización de heridas dérmicas, el aumento de las cuerdas vocales y la administración de células madre. Este artículo describe los métodos para la síntesis y caracterización de microgeles de poli(etilenglicol) (PEG) como los bloques de construcción para formar un andamio MAP. Estos métodos incluyen la síntesis de un macrómero de recocido personalizado (MethMAL), la determinación de la cinética de gelificación del precursor de microgeles, la fabricación de dispositivos microfluídicos, la generación microfluídica de microgeles, la purificación de microgel y la caracterización básica de andamios, incluido el dimensionamiento de microgel y el recocido de andamios. Específicamente, los métodos microfluídicos de alto rendimiento descritos en este documento pueden producir grandes volúmenes de microgeles que se pueden usar para generar andamios MAP para cualquier aplicación deseada, especialmente en el campo de la medicina regenerativa.

El objetivo de este protocolo es describir todos los pasos necesarios para sintetizar bloques de construcción de microgel que se utilizarán en un andamio MAP. El macrómero recocido MethMAL es altamente selectivo y eficiente y es compatible con múltiples redes troncales de polímeros14. Es importante que al menos el 67%-75% de la PEG-maleimida de 20 kDa se modifique con grupos funcionales de metacrilamida para garantizar una alta eficiencia de recocido. La modificación porcentual se puede determinar más fácilmente analizando los picos de espectros de 1H-RMN, como se muestra en la Figura 1. La cinética de gelificación, determinada por un viscosímetro, es una métrica importante a considerar para cada formulación de gel. Este protocolo utiliza una solución precursora de gel que consiste en una columna vertebral PEG con un grupo MAL, que reacciona eficientemente con reticulantes funcionalizados con tiol para la gelificación de microgel. Sin embargo, muchas químicas de hidrogel se pueden utilizar para fabricar microgeles a través del método microfluídico de alto rendimiento descrito en este documento. El tiempo hasta el inicio de la gelificación proporcionará información sobre la duración de la generación de microgel microfluídico. Se recomienda elegir un pH precursor del gel que pueda iniciar la gelificación entre 30 min (Figura 2) y 2 h.
Si el tiempo de gelificación es demasiado rápido, la solución precursora de gel comenzará a polimerizarse dentro del dispositivo microfluídico y obstruirá los canales. Además, es importante tener en cuenta que el cambio de las concentraciones de ligando tiolado (por ejemplo, RGD) puede tener impactos en la formación de la red durante la gelificación y puede ser necesario tener en cuenta ajustando la formulación. Los pasos de fabricación del dispositivo microfluídico pueden ser tediosos, pero los resultados representativos de un dispositivo unido con éxito se muestran en la Figura 3. Este protocolo utiliza un dispositivo microfluídico de emulsificación escalonada, paralelizado y de alto rendimiento que fue adaptado de un diseño de Rutte et al.13, y la fabricación de obleas de silicio se subcontrató a una empresa de tecnología microfluídica. Sin embargo, los pasos descritos en este protocolo se pueden usar con cualquier diseño de dispositivo grabado en una fotomáscara de oblea de silicio SU-8. Es importante tener en cuenta que el tamaño de paso de los canales en la fotomáscara debe optimizarse durante la fabricación del dispositivo, ya que afectará el tamaño de las partículas de microgel.
Los caudales para la generación microfluídica de microgeles deben optimizarse para cada formulación de gel en función de factores como el tiempo de gelificación, el tamaño de partícula deseado y el diseño del dispositivo microfluídico. Si se utiliza el dispositivo de alto rendimiento, los caudales para la fase acuosa pueden llegar hasta 5 ml / h. La figura 4B muestra la configuración de los dispositivos de alto rendimiento utilizados en este protocolo. Si el dispositivo funciona correctamente, la formación de microgel debe ser similar a la que se muestra en la Figura 4D. Antes de la purificación, los microgeles serán opacos. Después de completar los diversos lavados de aceite, PBS y hexano, el gel debe verse claro como la imagen representativa en la Figura 5. Si se incorpora un fluoróforo en los microgeles, el producto purificado puede tener un ligero tinte de color, pero aún debe estar cerca de translúcido. Después de la purificación y la hinchazón, los microgeles deben ser de tamaño muy uniforme y tener un PDI entre 1.00 y 1.05, como se muestra en la Figura 6. Se pueden utilizar varios fotoiniciadores para el fotorecocido de andamios MAP. Si se utiliza una alternativa a la LAP, descrita en este documento, se debe determinar la cinética de recocido como se describió anteriormente14. Además, se pueden usar varias fuentes de luz para el fotorecocido, siempre que la fuente de luz se corresponda con el fotoiniciador. Uno debe asegurarse de calibrar y enfocar la fuente de luz. El tiempo de recocido y la intensidad de la luz pueden necesitar ser optimizados en función de la formulación del gel y la concentración del fotoiniciador. El método de recocido descrito en este protocolo se puede utilizar para estudios in vitro e in vivo. Después del recocido, los microgeles formarán un andamio poroso que se puede visualizar con microscopía de dos fotones (Figura 7B-C).

Este protocolo describe un conjunto de métodos para sintetizar los bloques de construcción de microgel para andamios de partículas recocidas microporosas, que se pueden usar para una variedad de aplicaciones de medicina regenerativa.

Síntesis microfluídica de bloques de construcción de microgel para andamios de partículas recocidas microporosas

The microporous annealed particle (MAP) scaffold platform is a subclass of granular hydrogels. It is composed of an injectable slurry of microgels that ...

La fabricación de alto rendimiento de bloques de construcción de microgel monodispersos para andamios de partículas recocidas microporosas proporciona un control mejorado de la porosidad del andamio. Esto puede afectar el tamaño de los poros y los resultados posteriores de integración de tejidos. Este protocolo utiliza un enfoque microfluídico de alto rendimiento para generar grandes volúmenes de microgeles monodispersos que no se pueden lograr con otros métodos como la microfluídica de enfoque de flujo, la emulsión por lotes y la electropulverización.Los microgeles generados se pueden formar en andamios de partículas recocidas microporosas que son ventajosas para aplicaciones de medicina regenerativa debido a la porosidad a escala celular que permite un rápido crecimiento y tejido. Comience preparando un portaobjetos de vidrio por dispositivo microfluídico PDMS. Use cinta adhesiva, aire filtrado o lavados con alcohol isopropílico para eliminar el polvo del portaobjetos.Coloque un portaobjetos de vidrio en un diseño de dispositivo PDMS, deslícese uno al lado del otro en una tapa de placa de 96 pocillos y colóquelo en un limpiador de plasma. Cierre la puerta y la válvula de flujo de aire y encienda la bomba de vacío. Déjelo funcionar durante al menos 30 segundos y apáguelo.Conecte el tubo de gas del tanque de oxígeno a la válvula de flujo de aire. Deje que la cámara de plasma se llene de oxígeno durante 30 segundos, luego apague el oxígeno y cierre la válvula de flujo de aire. Encienda la bomba de vacío y ajuste el nivel de radiofrecuencia a alto.Espere hasta que la cámara se vuelva de color rosa violeta y deje pasar 30 segundos. Cuando el temporizador se apague, apague el plasma y el vacío, luego abra lentamente la válvula de flujo de aire para liberar el vacío. Retire la bandeja del limpiador de plasma.Voltee suavemente el dispositivo PDMS sobre la diapositiva de vidrio para unirlos. A medida que ocurre la unión, observe la ligera diferencia en la transparencia del PDMS. Para obtener los mejores resultados, guarde los dispositivos unidos a 60 grados centígrados hasta inmediatamente antes de su uso.Prepare el tratamiento de la superficie diluyendo PFOCTS y aceite Novec y use un mililitro para tres o cuatro dispositivos. Transfiera el volumen a una jeringa de un mililitro y coloque una aguja de calibre 25. Corte una pieza de 10 a 12 centímetros de tubo Tygon por dispositivo.Corte un trozo de tubo de PEEK de aproximadamente una pulgada de largo. Inserte un par de milímetros del tubo PEEK en el extremo del tubo Tygon para evitar que la aguja perfore las entradas del tubo Tygon. Saque los dispositivos de la cámara calentada e inserte el extremo no PEEK del tubo Tygon en el orificio de entrada acuoso.Inserte la aguja de la jeringa de tratamiento de superficie en el tubo PEEK y cubra el orificio de salida de la cámara de aceite. Inyecte el tratamiento lentamente y asegúrese de que llene el dispositivo sin burbujas. Espere a que las cámaras acuosas se llenen primero, seguidas de los canales más pequeños y luego la cámara de aceite.Retire el tubo Tygon del dispositivo. Una vez que el dispositivo se haya llenado, déjelo reposar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Llene una jeringa de cinco mililitros solo con aceite y coloque una aguja de calibre 25.Aspire el tratamiento de la superficie fuera del dispositivo a través de las entradas y salidas. Inserte el tubo Tygon en la entrada acuosa. Inserte la jeringa con aceite en el tubo PEEK y enjuague cada dispositivo con aceite.Aspire el aceite del dispositivo. Repita el lavado de aceite dos veces y retire el tubo Tygon. Inserte el extremo no PEEK del tubo Tygon en las entradas de los dispositivos microfluídicos.Inserte la pieza restante del tubo Tygon sin tubo PEEK en el extremo en la salida del dispositivo microfluídico. Agregue al menos tres mililitros de aceite a una jeringa de plástico de cinco mililitros y conéctela a una aguja de calibre 25. Inserte cuidadosamente la aguja en el tubo PEEK de una de las entradas Tygon.Enjuague suavemente el tubo y el dispositivo con aceite. Recoja el aceite de la salida en un tubo cónico. Repita la descarga de aceite en la otra entrada Tygon.Ajuste las bombas de jeringa a los caudales deseados. Conecte la jeringa que contiene el surfactante a la entrada de aceite a través de una aguja de calibre 25 y dispense suavemente suficiente aceite para cebar el tubo y el canal de aceite del dispositivo microfluídico. Una vez que se hayan configurado el dispositivo y las entradas de aceite, agregue 0,5 mililitros de aceite a una nueva jeringa de cinco mililitros que contendrá el precursor del gel.Use esta pequeña cantidad de aceite para ayudar a eliminar la solución precursora a través del dispositivo microfluídico. En un tubo cónico, combine 1,5 mililitros de la solución troncal PEG y 1,5 mililitros de la solución reticulante. Vortex durante 30 segundos y transfiera rápidamente la solución combinada de precursor de gel a la jeringa de cinco mililitros.Conecte la jeringa con la solución precursora de gel a la entrada acuosa a través de una aguja de calibre 25. Dispense suavemente suficiente solución para cebar el tubo y el canal acuoso. Sujete las jeringas a las bombas de jeringa y presione ejecutar.Busque partículas de tamaño uniforme de los canales. Recoja los microgeles de la salida en un tubo cónico. Una vez completada la gelificación, utilice una pipeta para retirar cuidadosamente la fase oleosa del fondo del tubo.Deposite esto en un contenedor de residuos apropiado para residuos fluorados. Agregue más aceite en el tubo de recolección de microgel. Mezclar invirtiendo suavemente el tubo de recolección.Deje que el tubo de recolección se asiente durante cinco minutos para permitir que las fases se separen. Busque la fase oleosa en la parte inferior y la fase acuosa de microgel en la parte superior. Repita los lavados con aceite al menos dos veces más.Agregue más aceite con el gel como se demostró anteriormente, luego agregue PBS al gel. Invertir para mezclar varias veces. Para separar las capas, centrifugar el tubo a 2, 000 RCF durante unos 30 segundos.Busque la fase oleosa en la parte inferior del tubo, el gel en el medio y PBS en la parte superior. Retire la fase oleosa con una pipeta y deséchela en un contenedor de residuos. Repita el aceite y los lavados de PBS dos veces.Busque que el gel pase de opaco a claro por el lavado final. Retire todo el aceite. No retire PBS del tubo cónico.En una campana extractora de humos químicos, use una pipeta de vidrio para agregar hexanos al tubo a un volumen igual al PBS. Vortex el tubo cónico durante 30 segundos o hasta que se mezcle bien. Centrífuga a 4, 696 RCF durante cinco minutos.Después de la separación, busque hexanos en la capa superior, PBS en el medio y gel en la parte inferior. Retire la capa de hexano y deséchela en un recipiente para residuos orgánicos. Aspirar el PBS.Repita el hexano en los lavados PBS al menos dos veces o hasta que el gel parezca casi translúcido. Lave el gel con PBS una vez más para eliminar cualquier residuo de hexano restante. Centrifugar a 4, 696 RCF durante cinco minutos y aspirar la capa de PBS.Alrededor del 67-75% de la maleimida PEG de 20 kilodalton se modificó con grupos funcionales de metacrilamida para garantizar una alta eficiencia de recocido. El porcentaje de modificación se determinó analizando los picos de espectros de RMN 1H. El inicio de la gelificación proporcionó información sobre la duración de la generación de microgel microfluídico.Se recomienda elegir un pH precursor de gel que pueda iniciar la gelificación entre 30 minutos y dos horas. Después de la purificación y el hinchamiento, los microgeles tuvieron un tamaño uniforme y un índice de polidispersidad entre 1,00 y 1,02 definido como una población monodispersa. Después del recocido, los microgeles formaron un andamio poroso visualizado con microscopía de dos fotones.La unión correcta del dispositivo PDMS al portaobjetos de vidrio y el tratamiento correcto de la superficie del dispositivo es crucial para el mejor rendimiento del dispositivo microfluídico. Esta técnica permite la producción rápida de bloques de construcción de microgel uniformes para formar andamios de mapas que se pueden utilizar para una variedad de aplicaciones regenerativas in vivo, incluida la cicatrización de heridas.

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Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

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Síntesis de Poli (<em&gt; N</em&gt; -isopropylacrylamide) Janus Microhydrogels para anisotrópico Thermo-respuesta y la organófila / hidrofílico La capacidad de carga

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Síntesis microfluídica de bloques de construcción de microgel para andamios de partículas recocidas microporosas

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