Name: 微流体合成微孔退火粒子支架用微凝胶构建块 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T14:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: 了解高通量微流控方法合成单分散微凝胶构建块，用于构建微孔退火粒子支架。该技术可精确控制支架孔隙率，促进组织整合，为再生医学研究提供高效可靠的工具。

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作者谨此感谢加州大学洛杉矶分校的 Joe de Rutte 及 Di Carlo 实验室，感谢他们在本研究中所用微流控装置的原始设计方面提供的帮助，以及在 PDMS 装置制备和故障排查方面的早期指导。图示示意图使用 Biorender.com 制作。

<ol><li>Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., di Carlo, D., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+wound+healing+by+injectable+microporous+gel+scaffolds+assembled+from+annealed+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks.</a> Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).</li>
<li>Koh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+in+vivo+delivery+of+stem+cells+using+microporous+annealed+particle+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Enhanced in vivo delivery of stem cells using microporous annealed particle scaffolds.</a> Small. 15 (39), 1903147(2019).</li>
<li>Pruett, L. J., Jenkins, C. H., Singh, N. S., Catallo, K. J., Griffin, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin+microislands+in+microporous+annealed+particle+scaffolds+for+accelerated+diabetic+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Heparin microislands in microporous annealed particle scaffolds for accelerated diabetic wound healing.</a> Advanced Functional Materials. 31 (35), 2104337(2021).</li>
<li>Darling, N. J., Sideris, E., Hamada, N., Carmichael, S. T., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+and+spatially+patterned+microporous+annealed+particle+%28MAP%29+hydrogels+for+tissue+repair+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">Injectable and spatially patterned microporous annealed particle (MAP) hydrogels for tissue repair applications.</a> Advanced Science. 5 (11), 1801046(2018).</li>
<li>Isaac, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microporous+bio-orthogonally+annealed+particle+hydrogels+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).</li>
<li>Pruett, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+microporous+annealed+particle+hydrogel+for+long-term+vocal+fold+augmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Development of a microporous annealed particle hydrogel for long-term vocal fold augmentation.</a> Laryngoscope. 130 (10), 2432-2441 (2020).</li>
<li>Nih, L. R., Sideris, E., Carmichael, S. T., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+microporous+annealing+particle+%28MAP%29+hydrogels+in+the+stroke+cavity+reduces+gliosis+and+inflammation+and+promotes+NPC+migration+to+the+lesion%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Injection of microporous annealing particle (MAP) hydrogels in the stroke cavity reduces gliosis and inflammation and promotes NPC migration to the lesion.</a> Advanced Materials. 29 (32), (2017).</li>
<li>Griffin, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+an+adaptive+immune+response+from+a+hydrogel+scaffold+imparts+regenerative+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing.</a> Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).</li>
<li>Sideris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+hydrogels+based+on+hyaluronic+acid+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).</li>
<li>Schaeffer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+microannealed+porous+scaffold+for+articular+cartilage+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Plastic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Injectable microannealed porous scaffold for articular cartilage regeneration.</a> Annals of Plastic Surgery. 84, 6S Suppl 5 446-450 (2020).</li>
<li>Pruett, L., Ellis, R., McDermott, M., Roosa, C., Griffin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+heterogeneous+epidermal+growth+factor+release+from+microporous+annealed+particle+%28MAP%29+hydrogel+for+improved+wound+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Spatially heterogeneous epidermal growth factor release from microporous annealed particle (MAP) hydrogel for improved wound closure.</a> Journal of Materials Chemistry B. 9 (35), 7132-7139 (2021).</li>
<li>Jivan, F., Alge, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-orthogonal%2C+site-selective+conjugation+of+recombinant+proteins+to+microporous+annealed+particle+hydrogels+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Bio-orthogonal, site-selective conjugation of recombinant proteins to microporous annealed particle hydrogels for tissue engineering.</a> Advanced Therapeutics. 3 (1), 1900148(2020).</li>
<li>de Rutte, J. M., Koh, J., di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+high-throughput+production+of+modular+microgels+for+in+situ+assembly+of+microporous+tissue+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds.</a> Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071(2019).</li>
<li>Pfaff, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+and+improved+photoannealing+of+microporous+annealed+particle+%28MAP%29+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Selective and improved photoannealing of microporous annealed particle (MAP) scaffolds.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (2), 422-427 (2021).</li>
<li>Darling, N. J., Hung, Y. S., Sharma, S., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+kinetics+of+thiol-maleimide+Michael-type+addition+gelation+kinetics+for+the+generation+of+homogenous+poly%28ethylene+glycol%29+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Controlling the kinetics of thiol-maleimide Michael-type addition gelation kinetics for the generation of homogenous poly(ethylene glycol) hydrogels.</a> Biomaterials. 101, 199-206 (2016).</li>
<li>Sandell, J. L., Zhu, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+in-vivo+optical+properties+of+human+tissues+and+its+impact+on+PDT%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">A review of in-vivo optical properties of human tissues and its impact on PDT.</a> Journal of Biophotonics. 4 (11-12), 773-787 (2011).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本方案描述了合成与表征微凝胶的方法，这些微凝胶是多孔退火颗粒（MAP）支架的基本构建单元。本方案采用高通量微流控技术，可制备大量均一的微凝胶，而其他方法难以实现这一目标，例如流动聚焦式微流控1,4,7,9（单一分散性高，产率低）、批量乳化法6,10以及电喷雾法5,12（单一分散性低，产率高）。通过本方案所述方法，可制备出单一分散的微凝胶，用于构建适用于多种再生医学应用（如细胞递送、伤口愈合）的MAP支架。
本方案的关键步骤是制备PDMS微流控装置。如果装置制备不当，可能会对微凝胶的形成及其单分散性产生不利的下游影响。在PDMS固化前应避免引入杂质（如气泡、灰尘），因为这些杂质可能堵塞通道并显著影响微凝胶的形成。为尽可能减少此类问题，建议使用胶带去除灰尘，将装置存放在无尘容器中，并尽可能在无尘环境的通风橱内操作。此外，建议将装置在60 °C下保存，以获得表面处理的最佳效果。
浇注PDMS装置时，应保持均匀的厚度，其厚度应等于或小于活检打孔器的长度。如果装置过厚，活检打孔器将无法完全穿透。使用活检打孔器打孔或插入管路时，必须避免撕裂PDMS装置的入口/出口。PDMS装置出现撕裂会导致入口/出口处泄漏，进而造成凝胶前体溶液流失。若PDMS装置发生泄漏，最佳解决方案是尽快更换为新的装置。
进行等离子体处理时，使用纯氧气并处理30秒，可获得PDMS与玻璃载片粘附的最佳效果。如果器件未能正确键合（即等离子体处理后PDMS仍可从玻璃载片上剥离），应仔细检查等离子体处理仪是否正常工作，并确认器件和载片是否已彻底清洗。正确选择硅烷表面处理剂也至关重要；为获得最佳效果，PDMS器件应在使用前立即进行表面处理。其他表面处理方法，如化学气相沉积，也可使用。
另一个关键步骤是正确使用PDMS微流控装置进行微凝胶的形成。建议使用至少2:1的流速比（本方案采用6 mL/h的油相流速和3 mL/h的水相流速），但可根据需要调整以获得理想的微凝胶尺寸。微凝胶前体溶液的pH值也是优化过程中一个重要的参数，需加以控制以防止装置堵塞。在迈克尔加成化学反应中，磷酸盐缓冲液（PBS）可加速硫醇盐的形成，本方案中所用的PBS浓度在微流控装置中可实现最佳的微凝胶凝胶化效果。启动注射泵后，微流控通道中可能会出现少量气泡，但数分钟后应会达到平衡。建议使用显微镜监测微凝胶的形成过程。如果流动状态与本视频中显示的不一致，和/或部分通道产生较大颗粒，则问题很可能出在表面处理步骤。最佳解决方案是更换为 freshly 经过表面处理的新装置。
如果微凝胶出现聚结现象，可能是由于氟化表面活性剂浓度不足所致。建议的解决方案是增加油相中表面活性剂的质量百分比（wt%）。然而，使用高浓度表面活性剂的一个局限性在于，其在后续纯化步骤中更难被完全去除。建议微流控装置仅使用一次，但如果在使用后立即用Novec油冲洗以去除可能在装置内发生凝胶化并堵塞通道的水相溶液，则装置可重复使用。虽然单个微流控装置即可实现高通量的微凝胶生产（mL/h），但通过并行使用多个微流控装置，可进一步放大生产速率。
MAP支架组装的退火步骤依赖于使用光引发的自由基聚合光引发剂，可根据预期应用选择合适的光引发剂。例如，LAP光引发剂具有较快的退火时间（&#60;使用长波紫外光时，对细胞活力影响极小，照射时间约为30秒 体外14然而，该波长的光会被组织强烈吸收16 退火效率可能较低 体内 作为 体外.
伊红Y是另一种可被可见光波长（505 nm）激活的光引发剂，其在组织中的穿透深度更大，从而增强了MAP支架在组织下方进行退火的能力。然而，伊红Y退火所需的较长光照时间可能会延长细胞暴露于自由基的时长，影响体外细胞活力in vitro14。采用这些方法可高通量地制备高度均一的微凝胶结构单元，将加速以MAP支架为核心的研究，并推动可注射多孔材料在再生医学领域的发展。

MAP支架平台是一种可注射的生物材料，完全由水凝胶微粒（微凝胶）组成，这些微粒交联后形成细胞尺度的微孔结构，可支持不依赖于材料降解的细胞迁移及整体组织整合1由于其能够快速与宿主组织整合且具有固有的低免疫原性，MAP支架平台已在多种再生医学治疗中展现出临床前应用潜力。2,3,4,5,6,7,8,9,10，包括加速皮肤伤口愈合1,3,11，再血管化脑卒中病灶空腔7，递送间充质干细胞2以及通过组织增容治疗声门闭合不全6MAP 还被证明可通过募集 M2 巨噬细胞，对宿主组织产生抗炎作用3 甚至可以调节以促进 Th2 反应 &#34;组织修复&#34; 免疫反应8MAP支架平台的这些优良特性使其能够拓展至多种临床应用领域。
先前报道的用于生成微凝胶以形成 MAP 支架的方法包括流动聚焦液滴微流控技术1,4,7,9、电喷雾法5,12以及批量乳化结合顶置式旋转法6,10。液滴微流控方法可生成单一分散性高的微粒，但其流速极慢，导致微粒产率较低（µL/h）。相比之下，电喷雾法和批量乳化法虽可产生大量微粒，但微粒的多分散性较高。本实验方案采用一种高通量微流控方法，基于 de Rutte 等人13的研究，制备具有高度单一分散性的微凝胶。该方法利用软光刻技术，通过光掩模制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控装置，并将其键合至玻片表面。该装置设计依赖于阶梯式乳化，以实现高产量微凝胶颗粒的生成（mL/h）。与其他技术相比，该方法所达到的单一分散性可更精确地调控孔隙率，因为单一分散的微凝胶可形成孔径更均匀的支架结构2。
本文详细阐述了合成和表征可作为MAP支架构建单元的单个微凝胶的方法，特别是针对含有聚乙二醇（PEG）主链并带有马来酰亚胺（MAL）基团的微凝胶的制备。该MAL基团可高效地与含硫醇官能团的交联剂发生迈克尔加成反应，从而实现微凝胶的凝胶化。为了将微凝胶的凝胶化过程与MAP支架的退火过程解耦，本文还介绍了如何合成一种已发表的14定制退火大分子单体MethMAL。MethMAL是一种具有甲基丙烯酰胺/马来酰亚胺双功能团的四臂PEG大分子单体。其中甲基丙烯酰胺官能团可高效参与自由基光聚合反应（用于微凝胶退火），同时在促进MAL基团发生迈克尔加成反应的条件下保持相对惰性。
此外，本文还概述了制备PDMS微流控装置、测定微凝胶凝胶动力学以及表征微凝胶尺寸的实验方案。文末部分详细描述了MAP支架退火过程，即微凝胶发生转变的阶段 原位 通过二次光引发交联步骤，将微凝胶表面共价键合，从而形成整体支架。需要注意的是，在MAP支架体系中还可采用其他不依赖光化学的退火方法，例如前文所述的酶介导退火。1总体而言，这些方法可直接使用，或与不同的水凝胶配方化学性质结合使用（例如，&#160;基于透明质酸）以生成适用于任何应用的 MAP 支架。

<table><tbody><tr><td>2-氨基乙硫醇盐酸盐</td><td>Acros Organics</td><td>AC153770250</td><td>用于 MethMal 合成&lt;br/&gt; 分子量：113.61 Da</td></tr><tr><td>35 mm 平板转子</td><td>HAAKE</td><td>P35/Ti</td><td>HAAKE 粘度计用几何转子</td></tr><tr><td>4-臂 PEG-马来酰亚胺（10 kDa）</td><td>NOF AMERICA Corporation</td><td>SUNBRIGHT PTE-100MA</td><td>用于微凝胶前体溶液</td></tr><tr><td>4-臂 PEG-马来酰亚胺（20 kDa）</td><td>NOF AMERICA Corporation</td><td>SUNBRIGHT PTE-200MA</td><td>用于 MethMal 合成&lt;br/&gt; 分子量因批次而异</td></tr><tr><td>带鲁尔锁扣头的 BD 注射器</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>一次性塑料注射器</td></tr><tr><td>活检打孔器</td><td>Mitex</td><td>MLTX33-31A-P/25</td><td>直径 1.5 mm</td></tr><tr><td>氘代氯仿</td><td>Acros Organics</td><td>AC209561000</td><td>用于 MethMal 合成</td></tr><tr><td>准直 LED 光源</td><td>ThorLabs</td><td>M365LP1-C1</td><td>365 nm</td></tr><tr><td>培养皿（15 cm）</td><td>Corning</td><td>CLS430599</td><td>150 mm × 25 mm</td></tr><tr><td>DMTMM（4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物）</td><td>Oakwood Chemical</td><td>151882</td><td>用于 MethMal 合成&lt;br/&gt; 分子量：276.72 Da</td></tr><tr><td>氟化表面活性剂</td><td>Ran Technologies</td><td>008-Flurosurfactant-5wtH-200G</td><td>HFE7500 中含 5 wt% 的 008-氟化表面活性剂</td></tr><tr><td>FreeZone Triad 冷冻干燥系统</td><td>Labconco</td><td>7400000 系列</td><td>用于 MethMal 合成&lt;br/&gt; 冻干机</td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-A3</td><td>普通未涂层载玻片</td></tr><tr><td>HAAKE Rheowin 粘度计</td><td>HAAKE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>版本 1.8.0_172</td></tr><tr><td>KDS Legato 210 双通道注射泵</td><td>Kd Scientific&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LED 驱动器</td><td>ThorLabs</td><td>DC2200</td><td></td></tr><tr><td>二苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次磷酸锂（LAP）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>900889</td><td>光引发剂</td></tr><tr><td>甲基丙烯酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>155721</td><td>用于 MethMal 合成&lt;br/&gt; 分子量：86.09 Da&lt;br/&gt; 密度：1.015 g/mL</td></tr><tr><td>微流控装置 SU8-Si 母版晶圆</td><td>FlowJem</td><td>N/A</td><td>定制，经硅烷化处理</td></tr><tr><td>MMP-2 可降解交联剂</td><td>FlowJem</td><td></td><td>序列：Ac-GCGPQGIAGQDGCG-NH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>针头（25 G，斜面）</td><td>BD</td><td>305122</td><td>长度：15.88 mm&lt;br/&gt; 规格：0.5 mm</td></tr><tr><td>Novec 7500</td><td>3M</td><td>7100025016</td><td>氟化油</td></tr><tr><td>氧气</td><td>Praxair</td><td>UN1072</td><td>压缩气体</td></tr><tr><td>peek 管</td><td>Trajan Scientific</td><td>03-350-523</td><td>外径 1/32&quot;；内径 0.02&quot;；长度 10 英尺</td></tr><tr><td>PFOCTS（三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448931</td><td>用于表面处理</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Fisher BioReagants</td><td>BP3994</td><td>用超纯水稀释至 1×，pH = 7.4</td></tr><tr><td>等离子清洗机</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001-HP</td><td></td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>RGD 细胞黏附肽</td><td>WatsonBio Sciences</td><td></td><td>序列：Ac-RGDSPGGC-NH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Rheowin 软件</td><td>HAAKE&amp;nbsp;</td><td></td><td>与 HAAKE 粘度计兼容的软件</td></tr><tr><td>手术刀片</td><td>Bard-Parker</td><td>371210</td><td>型号：#10</td></tr><tr><td>手术刀柄</td><td>Bard-Parker</td><td>371030</td><td>型号：#3</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP358-1</td><td>用于 MethMal 合成&lt;br/&gt; 分子量：58.44 Da</td></tr><tr><td>Sylgard 184 硅橡胶弹性体套件</td><td>DOW Chemical</td><td>2065622</td><td>基础剂与固化剂</td></tr><tr><td>三乙胺</td><td>Fisher Scientific</td><td>O4884-100</td><td>用于 MethMal 合成&lt;br/&gt; 分子量：101.19 Da&lt;br/&gt; 密度：0.73 g/mL</td></tr><tr><td>Tygon 管</td><td>Saint Gobain Performance Plastics</td><td>AAD04103</td><td>内径：0.51 mm&lt;br/&gt; 外径：1.52 mm</td></tr><tr><td>Varian Inova 500 核磁共振波谱仪</td><td>Varian</td><td></td><td>NMR&lt;br/&gt; 位于弗吉尼亚大学生物分子磁共振中心</td></tr></tbody></table>

用于微孔退火颗粒支架的微凝胶构筑单元的微流控合成

Microfluidic Synthesis of Microgel Building Blocks for Microporous Annealed Particle Scaffold

微孔退火颗粒（MAP）支架平台是颗粒状水凝胶的一个子类。它由可注射的微凝胶浆料组成，在经过二次基于光的化学交联步骤（即&#160;退火）后，可在原位形成具有细胞尺度孔隙率的结构稳定支架。in situ MAP支架已在多种再生医学应用中取得成功，包括皮肤伤口愈合、声带增强以及干细胞递送。本文描述了以聚乙二醇（PEG）微凝胶作为构建单元制备MAP支架的合成与表征方法。这些方法包括定制退火大分子单体（MethMAL）的合成、微凝胶前体凝胶化动力学的测定、微流控装置的制备、微流控生成微凝胶、微凝胶纯化以及基本的支架表征，包括微凝胶尺寸测量和支架退火。具体而言，本文所述的高通量微流控方法可大量生产微凝胶，用于生成适用于各种预期应用（尤其是在再生医学领域）的MAP支架。

本实验方案的目的是概述合成用于MAP支架的微凝胶构建单元所需的所有步骤。MethMAL退火大分子单体具有高度选择性和高效性，并且可与多种聚合物主链兼容14。为确保高效的退火效率，必须使20 kDa PEG-马来酰亚胺中至少67%–75%被甲基丙烯酰胺功能基团修饰。修饰百分比最简便的测定方法是分析1H-NMR谱图中的峰，如图1所示。通过黏度计测定的凝胶动力学是每种凝胶配方需考虑的重要指标。本方案采用含有MAL基团的PEG主链作为凝胶前体溶液，该基团可高效地与硫醇功能化的交联剂反应，从而实现微凝胶的凝胶化。然而，多种水凝胶化学体系均可通过本文所述的高通量微流控方法制备微凝胶。凝胶化起始时间将有助于确定微流控微凝胶生成过程的持续时间。建议选择能够在30分钟（图2）至2小时之间引发凝胶化的凝胶前体pH值。
如果凝胶时间过快，凝胶前体溶液将在微流控装置内开始聚合，导致通道堵塞。此外，需要注意的是，改变巯基化配体的浓度（例如., RGD）可能会影响凝胶过程中的网络形成，可能需要通过调整配方来加以考虑。微流控装置的制备步骤可能较为繁琐，但文中展示了成功键合装置的代表性结果。 图3本方案采用一种高通量、并行化、阶梯式乳化微流控装置，该装置改编自 de Rutte 等人的设计。13，硅晶圆的制备已外包给一家微流控技术公司。然而，本方案中所述的步骤可适用于在SU-8硅晶圆光刻掩模上刻蚀的任何装置设计。需要注意的是，在器件制备过程中，必须优化光刻掩模上通道的台阶尺寸，因为它将影响微凝胶颗粒的大小。
微流控生成微凝胶的流速应根据凝胶化时间、期望的颗粒尺寸以及微流控装置设计等因素，针对每种凝胶配方进行优化。若使用高通量装置，水相的流速最高可达 5 mL/h。图 4B 展示了本实验方案中所用高通量装置的设置。若装置运行正常，微凝胶的形成情况应与 图 4D 所示相似。在纯化前，微凝胶呈不透明状。完成各种油相、PBS 和正己烷洗涤后，凝胶应呈现如 图 5 中代表性图像所示的透明外观。若将荧光染料掺入微凝胶中，纯化后的产品可能带有轻微颜色，但仍应接近半透明状态。纯化并溶胀后，微凝胶的尺寸应高度均一，多分散系数（PDI）介于 1.00 至 1.05 之间，如 图 6 所示。可使用多种光引发剂对 MAP 支架进行光退火处理。若使用本文所述 LAP 以外的替代光引发剂，必须如先前所述方法确定其退火动力学14。此外，只要光源与所用光引发剂相匹配，可采用多种光源进行光退火。必须确保对光源进行校准和聚焦。退火时间与光强可能需要根据凝胶配方和光引发剂浓度进行优化。本实验方案中所述的退火方法可用于体外（in vitro）和体内（in vivo）研究。退火后，微凝胶将形成多孔支架结构，可通过双光子显微镜观察（图 7B-C）。

本方案描述了一组用于合成微孔退火颗粒支架微凝胶构建单元的方法，该支架可用于多种再生医学应用。

微孔退火颗粒（MAP）支架平台是颗粒状水凝胶的一个子类，由可注射的微凝胶浆料组成，这些微凝胶……

高通量制备用于微孔退火颗粒支架的单一分散微凝胶构建单元，可增强对支架孔隙率的控制，从而影响孔径大小及后续的组织整合效果。本方案采用高通量微流控方法，生成其他方法（如流动聚焦微流控、批量乳化法和电喷雾法）无法实现的大体积单一分散微凝胶。生成的微凝胶可形成微孔退火颗粒支架，由于具有细胞尺度的孔隙率，可实现快速组织生长，因此在再生医学应用中具有优势。首先，为每个PDMS微流控装置准备一块玻璃载片。使用胶带、过滤空气或异丙醇清洗，以去除载片上的任何灰尘。将一块载玻片和一个PDMS装置设计的载玻片并排放置在96孔板盖上，然后放入等离子清洗仪中。关闭门和气流阀，启动真空泵。运行至少30秒后，关闭真空泵。将氧气罐的气体管路连接至气流阀。让等离子腔体充入氧气30秒，然后关闭氧气并关紧气流阀。打开真空泵，并将射频功率调至高位。等待腔室变为紫粉色，并持续30秒。计时结束后，关闭等离子体和真空，然后缓慢打开气流阀以释放真空。从等离子清洗仪中取出托盘。轻轻将PDMS装置翻转到玻片上，使其粘合。粘合过程中，注意观察PDMS透明度的微小变化。为获得最佳效果，将粘合好的装置在60°C下保存，直至使用前立即取出。通过稀释PFOCTS和Novec油来配制表面处理液，每三至四个装置使用一毫升。将该体积转移至一毫升注射器中，并连接25号针头。每个装置准备一段10至12厘米长的Tygon管。截取一段长约一英寸的PEEK管。将PEEK管的两端各插入几毫米至Tygon管末端，以防止针头刺穿Tygon管的入口。将装置从加热室中取出，并将Tygon管非PEEK端插入水相入口孔中。将表面处理注射器的针头插入PEEK管中，并覆盖油室出口孔。缓慢注入处理液，确保液体充满装置且无气泡。先等待水相室充满，随后是较细的通道，最后是油室。从设备上取下Tygon管。设备充满后，在室温下静置10分钟。用仅含油的5毫升注射器抽取油液，并连接25号针头。通过入口和出口将表面处理液从装置中吸出。将Tygon管插入水相入口。将装有油的注射器插入PEEK管，用油冲洗每个装置。吸出装置中的油。重复油冲洗两次，并移除Tygon管。将Tygon管的非PEEK端插入微流控装置的入口。将另一段未连接PEEK管的Tygon管插入微流控装置的出口。向一个5毫升塑料注射器中加入至少3毫升油，并将其连接到25号针头上。小心地将针头插入其中一段Tygon管入口的PEEK管中。用油轻轻冲洗管路和装置。用锥形管收集出口处的油。对另一根Tygon进样管重复进行油冲洗。将注射泵设置为所需的流速。使用25号针头将含有表面活性剂的注射器连接至油相入口，并缓慢注入足够的油以润洗管路及微流控装置的油相通道。一旦装置和油相入口准备就绪，向一支新的5毫升注射器中加入0.5毫升油，该注射器将用于盛装凝胶前驱体。使用少量油帮助将前体溶液冲洗通过微流控装置。在锥形管中，加入1.5毫升PEG主链溶液和1.5毫升交联剂溶液。涡旋混合30秒，迅速将混合后的凝胶前体溶液转移至5毫升注射器中。将装有凝胶前体溶液的注射器通过25号针头连接至水相入口。轻轻排出足够的溶液以润洗管路和水相通道。将注射器固定在注射泵上，然后启动运行。从通道中观察大小均匀的颗粒。用锥形管从出口收集微凝胶。凝胶完成后，使用移液器小心地从管底去除油相。将此物放入指定的含氟废物容器中。向微凝胶收集管中加入更多油。通过轻轻倒置收集管进行混合。将收集管静置5分钟，使两相充分分离。观察底部的油相和顶部的水相微凝胶层。至少再重复油相洗涤两次。按照之前的方法向凝胶中加入更多油，然后向凝胶中加入PBS。颠倒混匀数次。为分离各层，将离心管在2,000 RCF下离心约30秒。观察离心管底部的油相、中间的凝胶层和顶部的 PBS。用移液器移除油相，并弃入废液容器中。重复油相和 PBS 洗涤两次。在最后一次洗涤结束时，观察凝胶由不透明变为透明。去除所有油分，但不要从锥形管中移除 PBS。在化学通风橱中，使用玻璃移液管向试管中加入与 PBS 等体积的己烷。涡旋混匀锥形管 30 秒，或直至充分混合。在 4,696 RCF 条件下离心 5 分钟。分离后，观察上层为己烷，中层为磷酸盐缓冲液（PBS），底层为凝胶。移除上层己烷并弃置于有机废液容器中。用吸管吸除PBS层。用 PBS 中的正己烷重复洗涤至少两次，直至凝胶几乎变为半透明。再用 PBS 洗涤一次，以去除残留的正己烷。在 4,696 RCF 下离心五分钟，并吸除 PBS 层。约67-75%的20千道尔顿PEG马来酰亚胺被修饰上甲基丙烯酰胺功能基团，以确保较高的退火效率。修饰百分比通过分析1H NMR谱图峰确定。凝胶化的起始时间提供了关于微流控微凝胶生成持续时间的信息。建议选择凝胶前体的 pH 值，使其在 30 分钟至两小时内启动凝胶化过程。纯化和溶胀后，微凝胶具有均匀的尺寸，多分散指数介于 1.00 至 1.02 之间，定义为单一分散体系。退火后，微凝胶形成多孔支架结构，可通过双光子显微镜观察。正确地将PDMS装置键合到玻璃载片上，并对装置进行正确的表面处理，对于实现最佳的微流控装置性能至关重要。该技术可快速制备均匀的微凝胶构建单元，用于形成可用于多种体内再生应用（包括伤口愈合）的支架结构。

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科研

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Bioengineering

生物工程

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一种用于研究多孔介质中生物堵塞的微流控平台

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明胶甲基丙烯酰基颗粒水凝胶支架：高通量微凝胶制备、冻干、化学组装与三维生物打印

了解高通量微流控方法合成单分散微凝胶构建块，用于构建微孔退火粒子支架。该技术可精确控制支架孔隙率，促进组织整合，为再生医学研究提供高效可靠的工具。

用于微孔退火颗粒支架的微凝胶构筑单元的微流控合成

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