Name: Ediciones precisas mediadas por CRISPR-Cas9 en corazones de pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T13:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Aprende a realizar ediciones precisas con CRISPR-Cas9 en embriones de Danio rerio para modelar variantes del síndrome de QT largo. Este protocolo permite la detección visual mediante reportadores fluorescentes y el análisis fenotípico posterior.

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Esta investigación fue apoyada por una subvención del Proyecto de Investigación de los Institutos Canadienses de Salud (T.W.C.) y las subvenciones de Descubrimiento del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (T.W.C.).

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<li>Irion, U., Krauss, J., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+and+efficient+genome+editing+in+zebrafish+using+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system.</a> Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).</li>
<li>Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+knock-in+transgenic+zebrafish+carrying+reporter%2Fdriver+genes+by+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering.</a> Scientific Reports. 4 (1), 6545(2014).</li>
<li>Levic, D. S., Yamaguchi, N., Wang, S., Knaut, H., Bagnat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knock-in+tagging+in+zebrafish+facilitated+by+insertion+into+non-coding+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Knock-in tagging in zebrafish facilitated by insertion into non-coding regions.</a> Development. 148 (19), (2021).</li>
<li>Prykhozhij, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+knock-in+of+point+mutations+in+zebrafish+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Optimized knock-in of point mutations in zebrafish using CRISPR/Cas9.</a> Nucleic Acids Research. 46 (17), 102(2018).</li>
<li>Wierson, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeted+integration+directed+by+short+homology+in+zebrafish+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Efficient targeted integration directed by short homology in zebrafish and mammalian cells.</a> eLife. 9, 53968(2020).</li>
<li>Boel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+homology-directed+repair+by+ssODNs+in+zebrafish+induces+complex+mutational+patterns+resulting+from+genomic+integration+of+repair-template+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair by ssODNs in zebrafish induces complex mutational patterns resulting from genomic integration of repair-template fragments.</a> Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).</li>
<li>Tessadori, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+CRISPR%2FCas9-based+nucleotide+editing+in+zebrafish+to+model+human+genetic+cardiovascular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Effective CRISPR/Cas9-based nucleotide editing in zebrafish to model human genetic cardiovascular disorders.</a> Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).</li>
<li>Zhang, Y., Zhang, Z., Ge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+platform+for+generating+somatic+point+mutations+with+germline+transmission+in+the+zebrafish+by+CRISPR%2FCas9-mediated+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An efficient platform for generating somatic point mutations with germline transmission in the zebrafish by CRISPR/Cas9-mediated gene editing.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (17), 6611-6622 (2018).</li>
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</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

La ingeniería de ediciones genéticas precisas utilizando CRISPR-Cas9 se ve desafiada por la baja eficiencia de los mecanismos HDR y su detección eficiente. Aquí, se describe un enfoque de reemplazo de exones de dos sgRNA basado en CRISPR-Cas9 que produce ediciones precisas en peces cebra con detección visual directa de ediciones positivas. La eficacia de este enfoque se demuestra mediante la generación de ediciones precisas en el gen zkcnh6a . Este documento muestra cómo la función cardíaca en larvas de pez cebr...

Las estrategias de edición de genes basadas en CRISPR en modelos animales permiten el estudio de enfermedades genéticamente hereditarias, el desarrollo y la toxicología a nivel de todo el organismo 1,2,3. El pez cebra proporciona un modelo poderoso que está más cerca en numerosos aspectos fisiológicos de los humanos que los modelos celulares murinos o derivados de humanos4. Se ha utilizado una amplia gama de herramientas y estrategias genéticas en el pez cebra tanto para el cribado genético hacia adelante5 como para el inverso6. El mapeo genético integral y la anotación en el pez cebra han facilitado los enfoques de edición de genes como una técnica primaria para diseñar knockouts de genes dirigidos (KO) y knock-ins precisos (KI)7.
A pesar de esto, la generación de ediciones precisas de KI en el pez cebra está limitada por las bajas eficiencias y la dificultad de una detección precisa. Aunque las nucleasas efectoras similares a factores de transcripción (TALEN) se han utilizado y optimizado con éxito para KI8, CRISPR proporciona una estrategia mejorada de edición de genes con una orientación más simple de sgRNA. Numerosos estudios han utilizado CRISPR para generar KI precisos en peces cebra 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20, aunque estas ediciones generadas a través de la reparación dirigida por homología mediada por CRISPR (HDR) tienden a ser ineficientes con bajo éxito intrínseco tasas que requieren genotipado como cribado primario 9,10,14,21. Esto demuestra la necesidad de un sistema KI CRISPR eficiente en el pez cebra, así como un sistema confiable de alto rendimiento para detectar ediciones precisas.
El objetivo de este estudio fue describir una plataforma para generar un gen cardíaco preciso KI en corazones de pez cebra con detección simple y de alto rendimiento de ediciones exitosas. Se describe un enfoque de reemplazo de exón de dos sgRNA basado en CRISPR-Cas9, que se basa en un enfoque TALEN8. Este enfoque implica la escisión de la secuencia diana utilizando guías de dos sgRNA y el reemplazo con una secuencia plantilla exógena que contiene el KI de interés, así como un gen informador intrónico codificado genéticamente (Figura 1). La integración de un reportero fluorescente codificado genéticamente dentro de la secuencia intrónica del gen objetivo permite la detección eficiente de ediciones positivas. Luego se describe una plataforma de fenotipado para evaluar la función eléctrica cardíaca en larvas de pez cebra para la caracterización no invasiva de las variantes genéticas asociadas con LQTS hereditario, un trastorno eléctrico cardíaco que predispone a los individuos a la muerte súbita cardíaca.
Estos enfoques mejorarán el acceso y el uso de las ediciones del gen KI del pez cebra para modelar enfermedades hereditarias y abordar cuestiones biológicas y fisiológicas, como el mapeo de patrones de expresión génica y la regulación del desarrollo. Dado que los corazones de pez cebra son mejores características electrofisiológicas cardíacas humanas paralelas que los modelos murinos, pueden ser particularmente atractivos como un sistema genéticamente tratable para el modelado de enfermedades cardíacas 7,22,23.

<table><tbody><tr><td><Programa>fuerte</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CRISPOR</td><td>TEFOR Infraestructura</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ENSEMBL</td><td>Instituto</td><td></td><td></td>Europeo</tr><tr>de<td>Bioinformática ImageJ</td><td>Institutos Nacionales de Salud (NIH)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-Manager</td><td>Código Abierto (Github)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEBiocalculator</td><td>Nueva Inglaterra Biolabs (NEB)</td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>EQUIPO</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa de 24 pocillos</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 mm Placa de Petri</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blackfly Cámara USB3</td><td>Teledyne FLIR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1000 Termociclador</td> Centrífuga <td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5415C</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de extracción de gel EZNA</td><td>Kit de transcripción Omega Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MAXIscript T7 Incubadora</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MaxQ 5000</td><td>Barnstead Lab Line</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mMessage mMachine T7 Ultra Kit de transcripción</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ND1000</td><td>Kit</td> de purificación de PCR Nanodrop <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLI 100A Picoinyector</td><td>Aparato</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Harvard PowerPac Fuente de alimentación básica</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stemi 305 Esteroscopio</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wide Mini Sub Cell GT Sistema de electroforesis</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZebTec Carcasa de pez cebra Sistema</td><td>Tecniplast</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SERVICES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gene Synthesis</td><td>Genewiz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sanger Sequencing</td><td>Genewiz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>REAGENTS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10&beta; Células competentes</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X Tampón PCR</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mM Mezcla de nucleótidos</td><td>ABM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BamHI Endonucleasa con tampón</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BsaI Endonucleasa con tampón</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DR274 Plásmido (XL1 apuñalado de agar bacteriano azul)</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EcoRI Endonucleasa con tampón</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HindIII Endonucleasa con tampón</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azul de metileno</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MLM3613 plásmido (XL1 Azul apuñalado de agar bacteriano)</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MS-222 (Tricaína)</td><td>Plásmido Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pKHR5 (DH5 y alfa; apuñalamiento de agar bacteriano)</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PmeI Endonucleasa con tampón</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SalI Endonucleasa con tampón</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 Ligasa con tampón</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Taq Polimerasa</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TE Tampón</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris Clorhidrato Sigma</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>XhoI Endonucleasa con tampón</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RECIPES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solution</td><td></td><td>Component Supplier</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de recocido (pH 7,5-8,0)</td><td>10 mM Tris</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>50 mM NaCl</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>1 mM EDTA</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>E3 Media (pH 7,2)</td><td>5 mM NaCl</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>0,17 mM KCl</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>0,33 mM CaCl2</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>0,33 mM Tampón de inyección MgSO4</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>(pH 7,5)</td><td>20 mM HEPES</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>150 mM KCl</td><td>Sigma</td><td></td></tr></tbody></table>

ediciones precisas mediadas por crispr-cas9 en corazones de pez cebra

CRISPR-Cas9-Mediated Precise Knock-In Edits in Zebrafish Hearts

Las repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR) en modelos animales permiten una manipulación genética precisa para el estudio de fenómenos fisiológicos. El pez cebra se ha utilizado como un modelo genético eficaz para estudiar numerosas cuestiones relacionadas con la enfermedad hereditaria, el desarrollo y la toxicología a nivel de todo el órgano y el organismo. Debido al genoma del pez cebra bien anotado y mapeado, se han desarrollado numerosas herramientas para la edición de genes. Sin embargo, la eficacia de generar y la facilidad de detectar ediciones precisas utilizando CRISPR es un factor limitante. Aquí se describe un enfoque knock-in basado en CRISPR-Cas9 con la detección simple de ediciones precisas en un gen responsable de la repolarización cardíaca y asociado con el trastorno eléctrico, el síndrome de QT largo (LQTS). Este enfoque de ARN de dos guías únicas (sgRNA) elimina y reemplaza la secuencia objetivo y vincula un gen informador codificado genéticamente. La utilidad de este enfoque se demuestra mediante la descripción de mediciones fenotípicas no invasivas de la función eléctrica cardíaca en larvas de pez cebra de tipo salvaje y editadas genéticamente. Este enfoque permite el estudio eficiente de las variantes asociadas a la enfermedad en un organismo completo. Además, esta estrategia ofrece posibilidades para la inserción de secuencias exógenas de elección, como genes reporteros, ortólogos o editores de genes.

El uso exitoso de este enfoque CRISPR de reemplazo de exón de dos sgRNA se destaca por la introducción y detección simple de una edición precisa para diseñar la variante asociada a LQTS, R56Q, en el gen zkcnh6a en pez cebra. La Figura 6 muestra una larva representativa de 3 dpf inyectadas en la etapa embrionaria de una célula con componentes CRISPR como se describió anteriormente. La Figura 6A muestra la presencia de la expresión génica reportera YFP mV...

Este protocolo describe un enfoque para facilitar ediciones precisas en embriones de pez cebra utilizando la tecnología CRISPR-Cas9. Se presenta una tubería de fenotipado para demostrar la aplicabilidad de estas técnicas para modelar una variante genética asociada al síndrome de QT largo.

Ediciones precisas mediadas por CRISPR-Cas9 en corazones de pez cebra

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) in animal models enable precise genetic manipulation for the study of physiological ...

Nuestro protocolo proporciona una canalización tanto para la integración precisa como para la detección visual simple de ediciones CRISPR, así como un ejemplo de fenotipado posterior a la edición. La principal ventaja de este enfoque es la facilidad de detección de ediciones CRISPR, lo que permite una identificación eficiente y simplificada de las ediciones exitosas. Este enfoque permite la generación y caracterización simples de variantes asociadas a enfermedades en el pez cebra.Aquí, estamos examinando el síndrome de QT largo. Los estudios de seguimiento sobre terapias farmacéuticas son entonces factibles de explorar. Comience diseñando dos guías de sgRNA para extirpar la secuencia del sitio objetivo mediante la identificación del ortólogo del pez cebra para el gen de interés.Utilice Ensembl para localizar el sitio objetivo dentro de la secuencia de genes de interés, incluida la secuencia flanqueante de dos kilobases utilizada para hacer la plantilla. Utilice una herramienta de software de diseño como CRISPOR y seleccione especies de Danio rerio y enzima Cas. Para el enfoque de dos sgRNA, elija un sgRNA antes del exón objetivo y un segundo sgRNA dentro del intrón inmediatamente p

crispr-cas9-mediated-precise-knock-in-edits-in-zebrafish-hearts

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Manipulaciones transgénicas y la edición del genoma son críticos para probar funcionalmente las funciones de los genes y elementos cis-regulador. Aquí se presenta un protocolo de microinyección detallado para la generación de modificaciones genómicas (incluyendo construcciones mediadas por Tol2 fluorescentes transgén reportero, Talens, y CRISPRs) para el modelo emergente de pescado, el espinoso de tres espinas.

La microinyección de transgénesis y Genoma edición en tres espinas espinosos

Se presenta un protocolo de microinyección simple y eficiente para la edición de genes en embriones de bagre de canal usando el sistema CRISPR/Cas9. En este protocolo, guía RNAs y proteínas Cas9 fueron microinyectados en la yema de una célula de embriones. Este protocolo ha sido validada por la anulación de dos genes relacionados con la inmune de bagre de canal.

Microinyección de la proteína CRISPR/Cas9 en bagre de canal, Ictalurus punctatus, embriones de Gene Editing

Edición del genoma específica en el sistema modelo Danio rerio (pez cebra) ha sido facilitada enormemente por la aparición de enfoques CRISPR. Adjunto, describimos un protocolo robusto optimizado para la generación y la identificación de alelos derivados CRISPR absurdo que incorpora el análisis de movilidad del heterodúplex y la identificación de mutaciones mediante secuenciación de próxima generación.

Producción eficiente y genera identificación de CRISPR/Cas9 Gene Knockouts en el sistema modelo Danio rerio

Se describen métodos para la manipulación de genes en el sistema del modelo evolutivo Astyanax mexicanus. Se describen tres técnicas diferentes: transgénesis mediada de Tol2, manipulación dirigida del genoma utilizando CRISPR/Cas9 y caída de expresión usando morfolinos. Estas herramientas deben facilitar la investigación directa de los genes subyacentes a la variación entre las formas de la superficie y cavernas.

Manipulación de la función del Gene en mexicano Cavefish

Aquí, se presenta un protocolo para producir y traseros pescado eléctrico knockout genoma CRISPR/Cas9. En detalle se describen los requisitos requeridos de biología molecular, reproducción y cría para un gimnoiforme y un mormyrid, y técnicas de inyección para producir larvas Indel F0 inducidas por Cas9.

Silenciar la chispa: Edición del genoma CRISPR/Cas9 en peces débilmente eléctricos

El objetivo de este protocolo es permitir la edición CRISPR/Cas9 sin fisuras del genoma de C. elegans utilizando complejos de ribonucleoproteína ensamblados y el marcador co-CRISPR dpy-10 para el cribado. Este protocolo se puede utilizar para realizar una variedad de modificaciones genéticas en C. elegans, incluidas inserciones, deleciones, reemplazos de genes y sustituciones de codones.

CRISPR/Cas9 Edición del gen C. elegans rbm-3.2 utilizando el marcador de detección co-CRISPR dpy-10 y complejos de ribonucleoproteína ensamblados.

El desarrollo temprano depende de los productos heredados por la madre, y el papel de muchos de estos productos es actualmente desconocido. En este documento, describimos un protocolo que utiliza CRISPR-Cas9 para identificar fenotipos de efecto materno en una sola generación.

Determinación del papel de los genes expresados por la madre en el desarrollo temprano con crispants maternos

Las tecnologías CRISPR-Cas han revolucionado el campo de la edición del genoma. Sin embargo, encontrar y aislar la edición de la línea germinal deseada sigue siendo un cuello de botella importante. Por lo tanto, este protocolo describe un método robusto para examinar rápidamente el esperma de pez cebra inyectado con CRISPR F0 para ediciones de la línea germinal utilizando técnicas estándar de PCR, digestión de restricción y electroforesis en gel.

Detección de espermatozoides para el aislamiento rápido de ediciones de la línea germinal en el pez cebra

Este protocolo describe cómo realizar una edición eficiente de la base de adenina sin limitación de PAM para construir un modelo preciso de la enfermedad del pez cebra utilizando zSpRY-ABE8e.

Edición de base eficiente sin PAM para el modelado de peces cebra de enfermedades genéticas humanas con zSpRY-ABE8e

Aquí, presentamos un protocolo para marcar proteínas con una etiqueta de proteína de fluorescencia en larvas de pez cebra, un sistema in vivo recientemente desarrollado y modificado especialmente útil para visualizar proteínas de baja abundancia en pez cebra.

Marcaje de fluorescencia para visualizar proteínas de baja expresión en el pez cebra

Aquí, describimos un protocolo para generar mutantes maternos que acopla una línea knock-in zpc:cas9 estable con la entrega mediada por Tol2 de casetes de expresión de sgRNA.

Generación de mutantes maternos usando pez cebra zpc:cas9 knock-in

Aprende a realizar ediciones precisas con CRISPR-Cas9 en embriones de Danio rerio para modelar variantes del síndrome de QT largo. Este protocolo permite la detección visual mediante reportadores fluorescentes y el análisis fenotípico posterior.

Ediciones precisas mediadas por CRISPR-Cas9 en corazones de pez cebra

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