Name: Determinación de la permeabilidad intestinal usando amarillo de lucifer en un modelo enteroide apical-out (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-27T14:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Aprende a evaluar la permeabilidad intestinal usando amarillo de lucifer en enteroides apical-out. Esta técnica permite analizar vías paracelulares en modelos 3D para estudiar enfermedades intestinales como enterocolitis necrotizante.

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Nos gustaría agradecer a Ashley Nelson del Centro Médico de la Universidad de Rochester por su ayuda instrumental con nuestro modelo enteroide. También nos gustaría agradecer a la División de Cirugía Pediátrica de la Universidad de Oklahoma por su apoyo a este proyecto. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud [NIH Grant R03 DK117216-01A1], el Centro de Investigación de Células Madre Adultas de Oklahoma y la Subvención # 20180587 de la Fundación de Salud Presbiteriana otorgada al Departamento de Cirugía del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Oklahoma.

La presente investigación se realizó de conformidad con la aprobación de la Junta de Revisión Institucional (IRB, # 11610, 11611) en la Universidad de Oklahoma. Se requirió el consentimiento de los padres antes de recolectar muestras quirúrgicas humanas según las especificaciones del IRB. Tras la aprobación del IRB y el consentimiento de los padres, se obtuvo tejido del intestino delgado humano de lactantes (edad gestacional corregida [AG] que oscilaba entre 36 y 41 semanas en el momento de la recolección de la muestra, todos con antecedentes de parto prematuro con una AG estimada de 25 a 34 semanas, 2:1 M:F) sometidos a cirugía para ECN u otra resección intestinal, como la retirada de ostomía o la reparación de la atresia. Los enteroides se generaron a partir de tejido obtenido del yeyuno o del íleon.
1. Cultivos enteroides derivados de bebés humanos: aislamiento de criptas y recubrimiento de tejido completo
<ol><li>Preparar los medios de cultivo, el tampón quelante #1 y el tampón quelante #2 (Tabla 1) después del informe anterior4. Conservar los tampones quelantes a 4 °C y utilizarlos en un plazo de 48 h.</li>
	<li>Preparar medios minigut humanos (Tabla 1). Guarde el caldo a -20 °C y caliente en un baño de agua a 37 °C antes de usar.</li>
	<li>Preparar medios acondicionados (CM) L-WRN al 50% (Tabla 1). Conservar el caldo a 4 °C durante un máximo de 1 semana. NOTA: La base 100% L-WRN para los medios acondicionados se describe en un protocolo de Miyoshi et al.12.</li>
	<li>Generar enteroides a partir de muestras de tejido del intestino delgado obtenidas de muestras quirúrgicas siguiendo el informe anterior4. Coloque cuatro pocillos de enteroides en una placa de 24 pocillos a partir de un trozo de tejido intestinal de 0,75-2,5 g. NOTA: Los enteroides se pueden generar con éxito a partir de tejido almacenado en un medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 de 30 ml en un tubo cónico de 50 ml a 4 °C durante un máximo de 48 h.</li>
	<li>Coloque la placa de 24 pocillos en una incubadora deCO2 al 5% a 37 °C boca abajo durante 15-20 min para permitir la polimerización de los domos BMM4.</li>
	<li>Agregue 500 μL de 50% de L-WRN CM (como se describe en el paso 1.3) con 0.5 μL de Y-27632, inhibidor de ROCK (IR, ver Tabla de materiales) a cada pocillo. Después de 2-3 días, reemplace con 50% L-WRN CM sin RI.</li>
</ol>2. Generación de enteroides AO
<ol><li>Cultivar enteroides incrustados en BMM durante 7-10 días con 50% de L-WRNCM 4.</li>
	<li>Retire el medio y agregue 500 μL de solución de recuperación celular (CRS, consulte la Tabla de materiales) a un pocillo. Raspa la cúpula, pipetea hacia arriba y hacia abajo varias veces, luego agrega la solución CRS/enteroide/BMM al siguiente pocillo.</li>
	<li>Raspa la cúpula, pipeta hacia arriba y hacia abajo varias veces y coloca la solución en un tubo de microcentrífuga. Agregue 500 μL de CRS al segundo pocillo, pipetear hacia arriba y hacia abajo, luego agréguelo al primer pocillo. Transfiera esta solución al mismo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.</li>
	<li>Repita el paso 2.3, agrupando dos pocillos en un tubo de microcentrífuga hasta que todo el contenido del pozo esté en CRS. NOTA: Se pueden agrupar más de dos pozos en un tubo cónico más grande de 15 ml si se generan grandes volúmenes de enteroides AO. Mantener una relación de 500 μL CRS por pocillo es importante para garantizar la solubilización completa de BMM.</li>
	<li>Colocar los tubos de microcentrífuga (paso 2.3) con solución combinada de CRS/enteroide/BMM en un rotador durante 1 h a 4 °C para solubilizar el BMM.</li>
	<li>Centrifugar la solución a 200 x g durante 3 min a 4°C, a continuación, extraer el sobrenadante con una micropipeta, dejando atrás el pellet.</li>
	<li>Resuspender el pellet enteroide en 1 ml de 50% L-WRN CM (como se preparó en el paso 1.3) por tubo de microcentrífuga. Pipetear suavemente 500 μL de la solución enteroide/medio resuspendida en cada pocillo de las placas de cultivo de tejido de 24 pocillos de fijación ultrabaja (ver Tabla de materiales).</li>
	<li>Incubar a 37 °C con 5% deCO2 durante 3 días antes de la experimentación.</li>
</ol>3. Verificación de la conformación enteroide AO mediante tinción inmunofluorescente de montaje completo
<ol><li>Después de la incubación de los enteroides en suspensión de medios durante 3 días, pipetear la suspensión enteroide/media de un pocillo en un tubo de microcentrífuga.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión enteroide/media a 200 x g durante 5 min a 4 °C. Retire el sobrenadante con una micropipeta.</li>
	<li>Resuspender los enteroides en 20 μL de BMM. Pipetear 10 μL de suspensión enteroide en un portaobjetos de microscopio y extenderlo en una capa delgada de aproximadamente 1 cm por 1 cm cuadrado. Repita con los 10 μL restantes de suspensión enteroide en una parte separada del mismo portaobjetos para que haya dos frotis de suspensión enteroide/BMM.</li>
	<li>Permita que las manchas enteroides/BMM se solidifiquen a temperatura ambiente (RT) durante 15 min.</li>
	<li>Trabajando en la campana extractora, coloque el portaobjetos en un frasco de tinción y llénelo con paraformaldehído al 4% hasta que cubra el frotis enteroide/BMM (~ 30 ml para un portaobjetos si usa un frasco de tinción de vidrio con capacidad de 10 portaobjetos). Espere 30 minutos (a temperatura ambiente) para que se realice la fijación. PRECAUCIÓN: El paraformaldehído al 4% es peligroso y puede causar daño/irritación ocular, irritación de la piel y cáncer. Siempre trabaje bajo una campana extractora cuando lo use. Use guantes protectores y equipo de protección personal cuando lo manipule. Deséchelo en un contenedor de eliminación de residuos aprobado.</li>
	<li>Deseche el paraformaldehído al 4% en un contenedor de residuos apropiado. Agregue 30 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) al frasco de tinción o hasta que PBS cubra los frotis enteroides/BMM. Déjelo reposar durante 3 minutos en RT y luego deseche el PBS en la botella de desechos de paraformaldehído. Repita este paso dos veces más para un total de tres lavados.</li>
	<li>Llene un frasco de tinción nuevo con 30 ml de Triton X-100 al 0,5% diluido en PBS. Coloque el portaobjetos con frotis enteroides/BMM en la solución Triton y déjelo permeabilizar durante 20 min a RT.</li>
	<li>Deseche el Triton X-100 al 0,5% diluido en PBS. Agregue 30 ml de PBS al frasco de tinción y déjelo reposar durante 3 minutos. Descartar el PBS por decantación.</li>
	<li>Limpie suavemente el portaobjetos alrededor de las manchas enteroides/BMM, teniendo cuidado de no interrumpirlas. Usando una pluma de barrera hidrófoba (pluma PAP de barrera, consulte la Tabla de materiales), dibuje un círculo alrededor de cada una de las frotis enteroides/BMM. Hacer un suero al 20%, específico para el animal en el que se crió el anticuerpo secundario (ver Tabla de materiales).</li>
	<li>Coloque el portaobjetos del microscopio plano sobre el banco del laboratorio. Bloquear el portaobjetos durante 1 h a 4 °C pipeteando 100 μL de suero específico al 20% del paso 3.9 en cada uno de los frotis enteroides/BMM anillados por la pluma barrera hidrófoba.</li>
	<li>Preparar una solución de 100 μL con diluciones 1:100 y 1:200 de anticuerpos primarios β-catenina y ZO-1, respectivamente, diluidos en PBS. NOTA: Cada anticuerpo primario debe ser de un animal diferente para garantizar que tendrán canales inmunofluorescentes distintos cuando se obtengan imágenes. El presente estudio utiliza un anticuerpo de ratón β-catenina y un anticuerpo ZO-1 de conejo (ver Tabla de materiales).</li>
	<li>Golpee la diapositiva en el mostrador para retirar el suero al 20% y séquelo suavemente, teniendo cuidado de no interrumpir las manchas enteroides / BMM. Pipetear 100 μL de solución de anticuerpos primarios β-catenina/ZO-1 sobre uno de los frotis enteroides/BMM. Pipetear 100 μL de PBS sin anticuerpo primario sobre el otro frotis enteroide/BMM como control negativo.</li>
	<li>Forre el fondo de un recipiente de plástico con una toalla de papel húmeda para crear un recipiente humidificado. Coloque el portaobjetos en el recipiente, teniendo cuidado de no interrumpir las soluciones que cubren los frotis enteroides/BMM. Coloque la tapa en el recipiente para sellar y guárdela plana a 4 °C durante la noche. NOTA: No permita que el portaobjetos se seque. Asegúrese de que el recipiente esté cerrado para evitar la desecación.</li>
	<li>Una vez que esté listo para continuar, toque la diapositiva en el contador para eliminar los anticuerpos primarios y PBS de los frotis enteroides / BMM.</li>
	<li>Realice un paso de lavado colocando el portaobjetos en un frasco de tinción y llenando con 30 ml de PBS o hasta que PBS cubra las manchas enteroides/BMM. Déjelo reposar durante 3 minutos a temperatura ambiente. Deseche el PBS y repita este paso dos veces más para un total de tres lavados.</li>
	<li>Preparar 200 μL de anticuerpos secundarios para dos canales inmunofluorescentes diferentes, y cada anticuerpo tiene una dilución 1:1000 en PBS (ver Tabla de materiales). Mantenga la solución alejada de la luz.</li>
	<li>Pipetear 100 μL de solución de anticuerpos secundarios sobre cada uno de los frotis enteroides/BMM. Colóquelo en la oscuridad y déjelo reposar durante 1 h en RT.</li>
	<li>Toque la diapositiva en el mostrador para eliminar los anticuerpos secundarios. Repita los pasos de lavado descritos en el paso 3.15, asegurándose de que todos los lavados se realicen en la oscuridad.</li>
	<li>Agregue una gota de medio de montaje 4′,6-diamidino-2-fenilindol (Fluoroshield con DAPI, consulte la Tabla de materiales) a cada una de las frotis enteroide/BMM y aplique un cubreobjetos para asegurarse de que ambos frotis estén adecuadamente cubiertos. Evite atrapar burbujas debajo del cubreobjetos. Mantenga el portaobjetos en la oscuridad hasta que esté listo para verlo bajo el microscopio. NOTA: La obtención inmediata de imágenes de las diapositivas produce los resultados más óptimos; sin embargo, los portaobjetos pueden almacenarse planos en un recipiente humidificado a 4 °C y obtener imágenes hasta 1 semana después de la adición de DAPI.</li>
</ol>4. Inducción de NEC experimental
<ol><li>Asegúrese de que los enteroides AO hayan estado en suspensión durante al menos 72 h antes de su uso.</li>
	<li>Pipetear suavemente toda la suspensión enteroide/media de cada pocillo en un tubo de microcentrífuga. NOTA: Se pueden agrupar varios pocillos en un tubo cónico de 15 ml si se trata un gran volumen de pocillos. Se recomienda un mínimo de tres pocillos por grupo de tratamiento para este protocolo.</li>
	<li>Centrifugar a 300 x g durante 3 min a RT y retirar el sobrenadante.</li>
	<li>Añadir 10 μL de 5 mg/ml de lipopolisacárido (LPS, ver Tabla de materiales) a 500 μL de 50% de LWRN CM por pocillo (concentración final 100 μg/ml LPS).</li>
	<li>Resuspender enteroides AO designados como grupo de tratamiento en 50% LWRN + LPS y alícuota 500 μL de suspensión a una placa de fijación ultrabaja de 24 pocillos. Resuspender enteroides AO designados como controles no tratados en 500 μL de CM LWRN al 50% por pocillo. Alícuota 500 μL de esta suspensión a una placa de fijación ultra baja de 24 pocillos separada.</li>
	<li>Inducir hipoxia en los enteroides AO tratados con LPS a través de una cámara de incubadora modular (MIC) con 1% de O 2, 5% de CO 2 y 94% de N 2 según las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales). Tratar los enteroides con hipoxia y LPS durante 24 h.</li>
	<li>Colocar los cultivos no tratados y tratados con LPS + hipoxia, todavía en la cámara de CMI, en una incubadora deCO2 al 5% a 37 °C durante 24 h.</li>
</ol>5. Medición de la permeabilidad paracelular utilizando LY
<ol><li>Pipetear suavemente la suspensión enteroide/media de cada pocillo en un tubo de microcentrífuga. DPBS caliente y 50% LRWN CM en un baño maría a 37 °C.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión enteroide/media a 300 x g durante 3 min a RT.</li>
	<li>Retire el medio. Lave los enteroides con DPBS calientes de 500 μL.</li>
	<li>Centrifugar a 300 x g durante 3 min a RT. Retirar el sobrenadante con una micropipeta.</li>
	<li>Repita los pasos 5.3-5.4 una vez más para un total de dos veces.</li>
	<li>Después del lavado, añadir 450 μL de CCR LWRN al 50% caliente (como se prepara en el paso 1.3).</li>
	<li>Agregue 50 μL de 2.5 mg / ml LY (la concentración final es de 0.25 μg / μL, consulte la Tabla de materiales) a cada pocillo y agite suavemente para mezclar. Colocar en una incubadora deCO2 al 5% a 37 °C durante 2 h.</li>
	<li>Pipetear suavemente la suspensión enteroide/media de cada pocillo en un tubo de microcentrífuga.</li>
	<li>Centrifugar a 300 x g durante 3 min en RT, luego retirar el sobrenadante, dejando atrás el pellet enteroide.</li>
	<li>Lave los enteroides con 500 μL de DPBS calientes.</li>
	<li>Centrifugar a 300 x g durante 3 min a RT, luego retirar el sobrenadante dejando atrás el pellet enteroide.</li>
	<li>Repita los pasos 5.10-5.11 tres veces más para un total de cuatro lavados.</li>
	<li>Resuspender cada pellet con 1.000 μL de DPBS frío y pipetear vigorosamente hacia arriba y hacia abajo para disociar los enteroides.</li>
	<li>Preparar estándares para la curva estándar LY diluida en DPBS (100 ng/mL; 50 ng/mL; 25 ng/mL; 12.5 ng/mL; 6.25 ng/mL; 3.13 ng/mL; 1.57 ng/mL; 0 ng/mL).</li>
	<li>Pipetear 150 μL de cada muestra por pocillo por triplicado en una placa de 96 pocillos.</li>
	<li>Mida la fluorescencia a un pico de excitación de 428 nm y un pico de emisión de 536 nm en un lector de placas capaz de leer fluorescencia (consulte la Tabla de materiales). Usando software estadístico (ver Tabla de materiales), calcule las concentraciones interpolando la curva estándar y usando una curva de cuatro parámetros.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no reportan ningún interés propietario o comercial en ningún producto mencionado o concepto discutido en este artículo.

La permeabilidad intestinal es compleja y refleja la función de barrera epitelial. La barrera intestinal comprende una sola capa de células epiteliales que media el transporte transcelular y paracelular14. La permeabilidad paracelular depende de proteínas de unión estrecha que sellan el espacio entre las células epiteliales14. Dentro de este transporte paracelular, hay tres vías distintas por las cuales las moléculas pueden cruzar: poro, fuga y sin restricciones<sup class="...

Los enteroides son estructuras tridimensionales (3D) derivadas de células madre intestinales humanas con órganos restringidos 1,2. Están formados enteramente por linaje epitelial y contienen todos los tipos de células epiteliales intestinales diferenciadas2. Los enteroides también mantienen la polaridad celular formada por una superficie luminal apical que forma un compartimento interno y una superficie basolateral frente al medio circundante. Los enteroides son un modelo único en el sentido de que conservan las características del huésped a partir del cual se generaron3. Por lo tanto, los enteroides generados a partir de bebés humanos prematuros representan un modelo útil para investigar enfermedades que afectan principalmente a esta población, como la enterocolitis necrosante (ECN).
El modelo enteroide tradicional se cultiva en una conformación basolateral hacia fuera (BO), donde el enteroide está encerrado en una cúpula de matriz de membrana basal (BMM). BMM induce al enteroide a mantener una estructura 3D con la superficie basolateral en el exterior. Los enteroides BO son un modelo adecuado para NEC que cierra la brecha entre las líneas celulares humanas primarias bidimensionales (2D) y los modelos animales in vivo 2,4. La NEC es inducida en enteroides mediante la colocación de patógenos como LPS o bacterias en los medios que rodean los enteroides, seguido de la exposición a condiciones hipóxicas 2,3. El desafío con el modelo BO enteroide NEC es que no permite el estudio efectivo de las interacciones huésped-patógeno, que ocurren en la superficie apical in vivo. Los cambios en la permeabilidad intestinal se deben a estas interacciones huésped-patógeno. Para comprender mejor cómo la permeabilidad afecta la base fisiopatológica de la enfermedad, se debe crear un modelo que implique el tratamiento de la superficie apical.
Co et al. fueron los primeros en demostrar que los enteroides BO maduros pueden ser inducidos a formar una conformación apical-out (AO) mediante la eliminación de los domos BMM y su resuspensión en medios5. Este artículo demostró que los enteroides AO mantuvieron la polaridad epitelial correcta, contenían todos los tipos de células intestinales, sostenían la barrera epitelial intestinal y permitían el acceso a la superficie apical5. El uso de enteroides AO como modelo NEC logra una reproducción fisiológica del proceso de la enfermedad y el estudio de las interacciones huésped-patógeno.
Uno de los principales contribuyentes a la fisiopatología de la ECN es el aumento de la permeabilidad intestinal6. Se han propuesto varias moléculas como una forma de probar la permeabilidad intestinal in vitro7. Entre estos, el amarillo lucifer (LY) es un colorante hidrófilo con picos de excitación y emisión a 428 nm y 540 nm, respectivamente8. A medida que atraviesa todas las principales vías paracelulares, se ha utilizado para evaluar la permeabilidad paracelular en diversas aplicaciones, incluyendo las barreras epiteliales hematoencefálicas eintestinales 8,9. La aplicación tradicional de LY utiliza células cultivadas en monocapas sobre una superficie semipermeable10. LY se aplica a la superficie apical y cruza a través de proteínas de unión estrecha paracelular para congregarse en el lado basolateral. Las concentraciones más altas de LY en el compartimiento basolateral indican una disminución de las proteínas de unión estrecha con la posterior ruptura de la barrera de las células epiteliales intestinales y una mayor permeabilidad10. También se ha descrito en modelos enteroides 3D BO donde LY se agregó a los medios y se obtuvieron imágenes de enteroides individuales para la absorción de LY en el lumen11. Aunque esto permite el análisis cualitativo a través de la visualización de la aceptación de LY, el análisis cuantitativo es limitado. Este protocolo describe una técnica única que utiliza LY para evaluar la permeabilidad paracelular utilizando un modelo enteroide NEC in vitro en enteroides AO mientras se mantiene la orientación 3D. Este método se puede utilizar para el análisis cualitativo y cuantitativo de la permeabilidad.

<table><tbody><tr><td>[leu] 15-gastrina 1</td><td>Millipore Sigma</td><td>G9145-.1MG</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; m filtro de células estériles</td><td>Corning</td><td>431752</td><td></td></tr><tr><td>medios acondicionados 100% LWRN</td> Fabricado internamente siguiendo la placa de cultivo de tejidos <td>Miyoshi et al.12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 pocillos</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Placa inferior transparente negra de 96 pocillos</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655090</td><td></td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>R& D Systems</td><td>2939/10</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 cabra anti-conejo secundaria ab, 1:1000</td><td>Invitrogen</td><td>A-11034</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 cabra anti-ratón secundaria ab, 1:1000</td><td>Invitrogen</td><td>A-11032</td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina B</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15290026</td><td></td></tr><tr><td>Anti-zonula occludens-1 conejo primario ab, 1:200</td><td>Señalización celular</td><td>#D6L1E</td><td></td></tr><tr><td>Anti-&beta;-catenina Ratón primario AB, 1:100</td><td>Señalización celular</td><td>#14-2567-82</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento de B-27 menos Vitamina A</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Barrera Pluma PAP</td><td>Laboratorio de dispositivos científicos</td><td>9804-02</td><td></td></tr><tr><td>BMM (Matrigel)</td><td>Corning</td><td>CB-40230C</td><td></td></tr><tr><td>Solución de recuperación celular</td><td>Corning</td><td>354270</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de</td><td></td><td></td><td></td>disección</tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11-965-118</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320-082</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-190-144</td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento epidérmico (EGF)</td><td>Millipore Sigma</td><td>GF144</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiaminotetraacético ácido (EDTA)</td><td>Millipore Sigma</td><td>EDS-500G</td><td></td></tr><tr><td>EVOS m7000 Sistema de imagen</td><td>Invitrogen</td><td>AMF7000</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino (FBS)</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-525</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield con DAPI</td><td>Millipore Sigma</td><td>F6057-20mL</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15-750-060</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td></td><td></td><td></td>de vidrio</tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prisma 9</td><td>Dotmatics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12585014</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisacárido (LPS)</td><td>Millipore Sigma</td><td>L2630-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Lucifer Amarillo CH, Sal de Litio</td><td>Invitrogen</td><td>L453</td><td></td></tr><tr><td>Cámara incubadora modular</td><td>Billups Rothenberg Inc.</td><td>Suplemento MIC101</td><td></td></tr><tr><td>N-2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etano sulfónico (HEPES)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>N-acetilcisteína</td><td>Millipore Sigma</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamida</td><td>Millipore Sigma</td><td>N0636-100G</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td></td><td></td><td></td>de cubo oscilante refrigerada</tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td></td><td></td><td></td>de sobremesa refrigerada</tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td> 11875093 <td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Millipore Sigma</td><td>S7067-5MG</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax Lector de microplacas iD3</td><td>Molecular dispositivos</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo Revólver Rotador</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>88881001</td><td></td></tr><tr><td>Fijación ultra baja placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos</td><td>Corning</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632, inhibidor de ROCK (RI)</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

determinación de la permeabilidad intestinal usando amarillo de lucifer en un modelo enteroide apical-out

Determining Intestinal Permeability Using Lucifer Yellow in an Apical-Out Enteroid Model

Los enteroides son una herramienta de investigación emergente en el estudio de enfermedades inflamatorias intestinales como la enterocolitis necrosante (ECN). Tradicionalmente se cultivan en la conformación basolateral hacia fuera (BO), donde la superficie apical de la célula epitelial se enfrenta a la luz interna. En este modelo, el acceso a la superficie luminal de los enteroides para el tratamiento y la experimentación es un desafío, lo que limita la capacidad de estudiar las interacciones huésped-patógeno. Para evitar esto, se creó un modelo de salida apical neonatal (AO) para la enterocolitis necrosante. Dado que los cambios en la permeabilidad de las células epiteliales intestinales son patognomónicos para la ECN, este protocolo describe el uso del amarillo lucifer (LY) como marcador de permeabilidad paracelular. LY atraviesa la barrera epitelial intestinal a través de las tres vías paracelulares principales: poro, fuga y sin restricciones. El uso de LY en un modelo AO permite un estudio más amplio de la permeabilidad en ECN. Después de la aprobación del IRB y el consentimiento de los padres, se recolectaron muestras quirúrgicas de tejido intestinal de neonatos prematuros humanos. Las células madre intestinales se cosecharon mediante aislamiento de cripta y se utilizaron para cultivar enteroides. Los enteroides se cultivaron hasta la madurez y luego se transformaron AO o se dejaron en conformación BO. Estos no fueron tratados (control) o fueron tratados con lipopolisacáridos (LPS) y sometidos a condiciones hipóxicas para la inducción de ECN in vitro . LY se utilizó para evaluar la permeabilidad. La tinción inmunofluorescente de la proteína apical zonula occludens-1 y la proteína basolateral β-catenina confirmaron la conformación AO. Tanto los enteroides AO como BO tratados con LPS e hipoxia demostraron un aumento significativo de la permeabilidad paracelular en comparación con los controles. Tanto los enteroides AO como BO mostraron una mayor captación de LY en la luz de los enteroides tratados en comparación con los controles. La utilización de LY en un modelo enteroide AO permite la investigación de las tres vías principales de permeabilidad paracelular. Además, permite la investigación de las interacciones huésped-patógeno y cómo esto puede afectar la permeabilidad en comparación con el modelo enteroide BO.

Conformación AO Los enteroides suspendidos en medios LWRN al 50% durante 72 h asumen una conformación AO (Figura 1). Esto se confirmó mediante tinción inmunofluorescente utilizando monturas enteroides enteroides de la proteína apical, zonula occludens-1 (ZO-1), y la proteína basolateral, β-catenina (Figura 1). Los enteroides AO muestran ZO-1 (verde) en la superficie externa y apical del enteroide, mientras que la β-catenina (rojo) es...

El presente protocolo describe un método que utiliza lucifer amarillo en un modelo enteroide apical-out para determinar la permeabilidad intestinal. Este método se puede utilizar para determinar la permeabilidad paracelular en enteroides que modelan enfermedades inflamatorias intestinales como la enterocolitis necrosante.

Determinación de la permeabilidad intestinal usando amarillo de lucifer en un modelo enteroide apical-out

Enteroids are an emerging research tool in the study of inflammatory bowel diseases such as necrotizing enterocolitis (NEC). They are traditionally grown ...

La aplicación de Lucifer Yellow a los medios de enteroides apicales proporciona un método simple para el análisis cuantitativo y cualitativo de las tres principales vías de permeabilidad intestinal paracelular en un modelo 3D. Es una técnica relativamente sencilla que nos permite evaluar la permeabilidad utilizando un modelo enteroide. Estamos trabajando con esta técnica en nuestros estudios de enterocolitis necrosante.Sin embargo, esta técnica puede ser útil en el estudio de cualquier enfermedad intestinal humana, utilizando un modelo enteroide. Demostrando los procedimientos hoy estarán nuestros becarios de investigación postdoctorales, el Dr. Tyler Leiva y la Dra. Alena Golubkova, así como Camille Schlegel, la Supervisora Asistente de Investigación de nuestro laboratorio. Para comenzar, cultive los androides integrados en BMM durante siete a 10 días con 50% de medios acondicionados LWRN para la generación enteroide apical-out o AO.Retire los medios de alrededor de los domos BMM y agregue 500 microlitros de solución de recuperación celular, o CRS a un pocillo. Raspa la cúpula, pipetea hacia arriba y hacia abajo varias veces para homogeneizar el CRS con los enteroides incrustados en las cúpulas BMM, y añade esta solución al siguiente pocillo. Nuevamente, raspe la cúpula y pipetearla hacia arriba y hacia abajo varias veces antes de transferir la solución a un tubo de microcentrífuga.Agregue 500 microlitros de CRS al segundo pocillo, pipete hacia arriba y hacia abajo para mezclarlo bien y transfiéralo al primer pocillo. Desde el primer pozo, agrupe la solución BMM enteroide CRS en el mismo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y repita este agrupamiento para los pozos restantes hasta que el contenido de todos los pocillos esté en CRS. Coloque los tubos de microcentrífuga que contienen la solución de CRS agrupada en un rotador durante una hora a cuatro grados centígrados.Luego centrifugar el tubo de microcentrífuga a 200 X g durante tres minutos a cuatro grados centígrados antes de retirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet enteroide en un mililitro de medio acondicionado al 50% LWRN. Transfiera suavemente 500 microlitros de la solución enteroide o medio resuspendido a cada pocillo de la placa de cultivo de tejido de 24 pocillos de fijación ultrabaja. Incubar la placa a 37 grados centígrados con 5% de CO2, durante tres días antes de la experimentación.Asegúrese de que los enteroides AO estén suspendidos durante al menos 72 horas antes de su uso. Transfiera suavemente todos los enteroides suspendidos en medios de cada pocillo a un tubo de microcentrífuga. Centrifugar a 300 X g durante tres minutos a temperatura ambiente y retirar el sobrenadante.Agregue 10 microlitros de cinco miligramos por mililitro de lipopolisacárido, o LPS a 500 microlitros de medios acondicionados al 50% LWRN por pocillo para preparar la mezcla maestra, y vuelva a suspender el pellet enteroide AO del grupo de tratamiento en 500 microlitros de LPS más 50% de medios acondicionados LWRN. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para mezclar bien. Alícuota 500 microlitros de suspensión en cada pocillo de una placa de fijación ultra baja de 24 pocillos.De manera similar, vuelva a suspender los enteroides AO del grupo de control no tratado en 500 microlitros de medios acondicionados LWRN al 50% por pocillo y alícuota 500 microlitros de esta suspensión en cada pocillo de una placa de fijación ultra baja separada de 24 pocillos. Inducir hipoxia en los enteroides AO tratados con LPS utilizando una cámara de incubadora modular con 1% de oxígeno, 5% de dióxido de carbono y 94% de nitrógeno, e incubar los enteroides con hipoxia y LPS durante 24 horas. Coloque los cultivos tratados sin tratar y LPS más hipoxia, en una incubadora de dióxido de carbono al 5% durante 24 horas.Para medir la permeabilidad paracelular usando Lucifer Yellow o LY, transfiera suavemente la suspensión enteroide o del medio de cada pocillo a un tubo de microcentrífuga. Caltione la solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco o DPBS, y los medios acondicionados al 50% de LWRN en un baño de agua de 37 grados centígrados. Centrifugar la suspensión a 300 X g durante tres minutos a temperatura ambiente.Retire el medio y lave el pellet enteroide con 500 microlitros de DPBS caliente antes de centrifugarlo a 300 X g durante tres minutos. Retire el sobrenadante con una micropipeta y repita el paso de lavado DPBS una vez más. Después de lavar el DPBS, agregue 450 microlitros de medios acondicionados calientes al 50% LWRN y agregue la suspensión a una placa de 24 pocillos.Luego agregue 50 microlitros de 2.5 miligramos por mililitro LY a cada pozo. Agite la placa suavemente para mezclar y colóquela en una incubadora de dióxido de carbono al 5% durante dos horas. Pipetear suavemente la suspensión enteroide de cada pocillo en un tubo de microcentrífuga.Centrifugarlo y retirar el sobrenadante dejando atrás el pellet enteroide. Lave el pellet con 500 microlitros de DPBS tibio y centrifugarlo. Retire el sobrenadante dejando atrás el pellet.Repita tres lavados del DPBS antes de volver a suspender el pellet con 1000 microlitros de DPBS frío, y disocie los enteroides mezclando vigorosamente con una pipeta. Para la curva estándar de Lucifer Yellow, prepare los estándares diluidos en DPBS como se describe en el texto. Pipetear 150 microlitros de cada muestra por pocillo por triplicado en una placa de 96 pocillos.Mida la fluorescencia a un pico de excitación de 428 nanómetros y un pico de emisión de 536 nanómetros en un lector de placas de fluorescencia. Calcule las concentraciones utilizando un software estadístico y una curva de cuatro parámetros interpolando la curva estándar. La tinción inmunofluorescente de los enteroides suspendidos en medios LWRN al 50% durante 72 horas mostró Zo-1 en la superficie apical externa del enteroide, mientras que la beta catenina se observa en la superficie basolateral.Indicó la inversión de polaridad esperada de enteroides confirmando una conformación AO de enteroides. Los enteroides basolaterales o BO tratados con LPS e hipoxia mostraron un aumento significativo de la permeabilidad que se demostró en un ensayo de amarillo de Lucifer o LY por la mayor absorción de colorante LY en la luz enteroide, en comparación con los controles no tratados. El ensayo de amarillo de Lucifer también demostró la mayor absorción de LY en el lumen de los enteroides AO tratados en comparación con los controles no tratados.Confirmó el aumento de la permeabilidad de los enteroides AO tratados con LPS e hipoxia, en comparación con los controles no tratados. Es importante lavar bien los pellets enteroides para asegurarse de que se elimine todo el LY extraluminal. Permite la cuantificación precisa del LY intraluminal restante en el cálculo de la permeabilidad.Para el análisis cualitativo, los enteroides se pueden visualizar a través de microscopía fluorescente para la absorción de LY en el lumen. Siguiendo la incubación LY y los pasos de lavado posteriores antes de disociar la lectura de microplacas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este protocolo describe el uso de preparaciones de tejido intestinal extirpado o "sacos intestinales" como modelo ex vivo de la función de barrera intestinal. Este modelo se puede utilizar para evaluar la integridad tanto de la barrera epitelial como de la capa de gel mucoso en sitios intestinales específicos en modelos animales de enfermedad digestiva.

Ex Vivo intestinal Sacs para evaluar la permeabilidad de la mucosa en modelos de enfermedad gastrointestinal

Aquí se presentan dos métodos para determinar la función de barrera intestinal. Un medidor epitelial (voltios/ohmios) se utiliza para la medición de la resistencia eléctrica transepitelial de epitelio cultivado directamente en los pocillos de cultivo de tejidos. En ratones, el método de sonda de FITC-los dextranos se utiliza para determinar la permeabilidad intestinal en vivo.

In Vitro e In Vivo métodos para determinar la permeabilidad de la célula epitelial Intestinal

Presentamos un ensayo de fluorescencia para demostrar que Lucifer Yellow (LY) es un marcador robusto para determinar la aparente permeabilidad paracelular de las monocapas celulares hCMEC/D3, un modelo in vitro de la barrera hematoencefálica humana. Usamos este ensayo para determinar la cinética de una formación monocapa confluente en células hCMEC/D3 cultivadas.

Lucifer Yellow - Un marcador de permeabilidad paracelular robusto en un modelo celular de la barrera hematoencefálica humana

Aquí describimos una técnica para cuantificar la integridad de la barrera de los pequeños organoides intestinales. El hecho de que el método se base en organoides vivos permite la investigación secuencial de diferentes sustancias moduladoras de la integridad de la barrera o combinaciones de las mismas de una manera resuelta en el tiempo.

Investigación de la ruptura de la barrera intestinal en los organoides vivos

Aprovechando la microscopía intravital, el método presentado aquí permite la visualización en tiempo real del desprendimiento de células epiteliales intestinales en animales vivos. Por lo tanto, la mucosa intestinal teñida tópicamente (acriflavina y rhodamineB-dextran) de ratones anestesiados se compara hasta una sola célula mediante microscopía confocal.

Un enfoque basado en microscopía intravital para evaluar la permeabilidad intestinal y el rendimiento del desprendimiento de células epiteliales

Aquí, describimos la preparación de monocapas epiteliales intestinales derivadas de organoides humanos para estudiar la función de barrera intestinal, la permeabilidad y el transporte. Como los organoides representan la respuesta original del tejido epitelial a los estímulos externos, estos modelos combinan las ventajas de la capacidad de expansión de las líneas celulares y la relevancia y complejidad del tejido primario.

Monocapa epitelial derivada de organoides: un modelo in vitro clínicamente relevante para la función de barrera intestinal

La función epitelial intestinal desregulada de la barrera y las inmunorespuestas son sellos de la enfermedad de intestino inflamatoria que siguen siendo investigados mal debido a una carencia de modelos fisiológicos. Aquí, se describe un modelo de asa intestinal de ratón que emplea un segmento intestinal bien vascularizado y exteriorizado para estudiar la permeabilidad de la mucosa y el reclutamiento de leucocitos in vivo.

Evaluación Funcional De La Permeabilidad Intestinal Y La Migración Transepitelial Neutrófilo En Ratones Usando Un Modelo De Bucle Intestinal Estandarizado

Este protocolo detalla el establecimiento de enteroides, un modelo intestinal tridimensional, a partir del tejido intestinal fetal. Se utilizaron imágenes inmunofluorescentes de biomarcadores epiteliales para la caracterización del modelo. La exposición apical de lipopolisacáridos, una endotoxina bacteriana, mediante la técnica de microinyección indujo la permeabilidad epitelial de una manera dependiente de la dosis medida por la fuga de dextrano fluorescente.

Prueba de permeabilidad epitelial en enteroides derivados de tejido fetal

Este estudio presenta un protocolo para la generación de monocapas 2D intestinales bovinas a partir de organoides, ofreciendo un mejor acceso para el estudio de las interacciones huésped-patógeno. Incluye métodos para evaluar la integridad y funcionalidad de la membrana, avanzando en modelos in vitro que imitan la fisiología gastrointestinal del ganado. Este enfoque promete importantes beneficios biomédicos y agrícolas, incluidas estrategias de tratamiento mejoradas.

Avances en la tecnología de organoides bovinos mediante interfaces monocapa de intestino delgado y grueso

Hemaglutinación es una forma de aglutinación de los anticuerpos se unen a los glóbulos rojos. Los glóbulos rojos están disponibles de inmediato y los resultados son fácilmente observables a simple vista. Este video muestra los pasos a seguir en un ensayo de hemaglutinación, la interpretación de los resultados y determinar el título.

La determinación de la reactividad y el título de suero utilizando un ensayo de hemaglutinación

Aprende a evaluar la permeabilidad intestinal usando amarillo de lucifer en enteroides apical-out. Esta técnica permite analizar vías paracelulares en modelos 3D para estudiar enfermedades intestinales como enterocolitis necrotizante.

Determinación de la permeabilidad intestinal usando amarillo de lucifer en un modelo enteroide apical-out

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