Larvas de pez cebra como modelo para evaluar posibles radiosensibilizadores o protectores
25 de agosto de 2022
El pez cebra ha sido explotado recientemente como modelo para validar posibles modificadores de radiación. El presente protocolo describe los pasos detallados para utilizar embriones de pez cebra para experimentos de detección basados en radiación y algunos enfoques observacionales para evaluar el efecto de diferentes tratamientos y radiación.
Este protocolo describe los pasos detallados para usar embriones de pez cebra para experimentos de detección basados en radiación y algunos enfoques observacionales para evaluar el tratamiento de diferentes medicamentos y radiación. Esto ayudará a los lectores a establecer un cribado de fármacos de semi-alto rendimiento que implique la exposición a rayos X utilizando embriones de pez cebra, lo que guiará en la evaluación de la radiotoxicidad y la eficacia de los diferentes fármacos utilizados. Este procedimiento se puede utilizar para cribar y validar o evaluar diferentes fármacos como potenciales radiosensibilizadores o protectores, que pueden ser explorados más a fondo o utilizados en el campo de la radioterapia o la radiobiología del cáncer.
Para comenzar, monitoree los embriones en crecimiento bajo el microscopio de disección. Identifique la etapa adecuada y elimine los embriones muertos o enfermos. Asegúrese de que la estadificación embrionaria sea adecuada para la radiación y que las dosis del fármaco se administren en una etapa particular de gastrulación.
Antes de comenzar el experimento, distribuya cuidadosamente los embriones sanos en las placas experimentales con la ayuda de una pipeta Pasteur. Para cada grupo experimental, tome de 15 a 20 embriones. Al organizar un experimento de radiación, incluya un grupo de control no irradiado y un grupo de solo radiación.
Distribuya los embriones en una placa de pocillos si los escudos de radiación pueden cubrir y proteger los pocillos adicionales de la radiación mientras los otros pocillos están expuestos a una dosis de radiación particular. De lo contrario, use placas o discos individuales para ver los embriones por dosis de radiación. Encienda la máquina del irradiador de rayos X e inicie la inicialización y el calentamiento de la máquina.
Coloque la placa experimental debajo del irradiador dentro de la máquina en el centro, asegurándose de que la placa esté directamente debajo de la fuente de rayos X. Y luego ajuste la dosis y comience la radiografía. Después de completar la irradiación, saque las placas, apague el programa de la máquina, apague la máquina y revise las placas bajo el microscopio inmediatamente después de la radiación.
Retire los embriones muertos y registre su número después de evaluarlos bajo el microscopio de disección. Regrese las placas a la incubadora a 28,5 grados centígrados. Recopile datos a intervalos de tiempo predeterminados después de administrar la radiación.
Registre todas las observaciones posibles, como la supervivencia, la eficiencia de la eclosión, la etapa de desarrollo, el recuento de latidos cardíacos, la curvatura del cuerpo y la cola, el edema pericárdico y la extensión del saco vitelino, la microcefalia, el desarrollo de la vejiga natatoria, la motilidad o actividad general, etc. Para capturar imágenes, elija embriones representativos en un portaobjetos limpio. Revisa los embriones bajo el microscopio, oriéntalos en una dirección particular.
La curva de supervivencia de los embriones irradiados a las seis horas después de la fecundación mostró que en el grupo control y en los embriones expuestos a 2 gray y 5 gray, no hubo muerte significativa en los embriones. El recuento de latidos cardíacos por minuto sugirió que la frecuencia cardíaca disminuyó enormemente con el aumento de las dosis de radiación de rayos X. En el grupo de control, en cada intervalo de 24 horas, se observó que la frecuencia cardíaca aumentaba.
Se sospecha una deformación cardiovascular severa en embriones expuestos a radiación de 15 gray y 20 gray a medida que los latidos del corazón disminuyeron enormemente. Se describen y evalúan diferentes defectos fenotípicos y de desarrollo para embriones expuestos a diferentes dosis de radiación en diferentes momentos. También se realizaron observaciones morfológicas de flexión de la columna vertebral o de la cola, malformación de la cabeza y microcefalia, defectos en el desarrollo, edema pericárdico, deformidades del saco vitelino, deformidades de la vejiga natatoria y cambios en la estructura ocular Para el protocolo que hemos demostrado, la elección de embriones sanos, la colocación adecuada de los embriones en el irradiador y la evaluación adecuada de las anomalías cruzadas son la clave de este procedimiento.
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Descripción general
Este protocolo describe el uso de embriones de pez cebra para experimentos de cribado basados en radiación. Describe enfoques observacionales para evaluar los efectos de diversos tratamientos y radiación.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Radiobiología
- Investigación del cáncer
- Tamizaje de fármacos
Antecedentes
- Los peces cebra son un modelo valioso para estudiar los efectos de la radiación.
- El protocolo ayuda a evaluar la radiotoxicidad y la eficacia de los fármacos.
- Apoya la exploración de radiosensibilizadores y protectores.
- La determinación de la etapa embrionaria es crucial para una dosificación precisa.
Objetivo del estudio
- Validar posibles modificadores de la radiación utilizando embriones de pez cebra.
- Establecer un método de cribado de fármacos semiacelerado.
- Orientar las evaluaciones en radioterapia del cáncer.
Métodos Utilizados
- Monitoreo de embriones de pez cebra bajo un microscopio estereoscópico.
- Identificación y eliminación de embriones no sanos.
- Administración de dosis de radiación y fármacos en etapas específicas de gastrulación.
- Realización de experimentos de cribado para evaluar los efectos de los fármacos.
Resultados principales
- Establecimiento de un protocolo para la selección de fármacos con pez cebra.
- Identificación de tratamientos eficaces contra la radiotoxicidad.
- Validación de posibles radiosensibilizadores y protectores.
- Orientación para futuras investigaciones en radioterapia del cáncer.
Conclusiones
- El modelo de pez cebra es efectivo para la validación de modificadores de radiación.
- Este protocolo puede mejorar las metodologías de cribado de fármacos.
- Los hallazgos podrían contribuir a avances en el tratamiento del cáncer.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Las larvas de pez cebra proporcionan una plataforma in vivo rápida y escalable para evaluar radiosensibilizadores y radioprotectores candidatos, abordando una necesidad crítica de cribado funcional en etapas tempranas en el descubrimiento de fármacos para radioterapia. Este modelo permite la evaluación cuantitativa de la radiotoxicidad y la eficacia del fármaco, apoyando la confianza predictiva y la reducción del riesgo mecanicista en el punto de inflexión de validación preclínica. La integración de ensayos basados en pez cebra en las líneas de descubrimiento mejora la selección de carteras y acelera la identificación de modificadores de radiación prometedores para aplicaciones en oncología.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la validación funcional de candidatos radiosensibilizadores y protectores en un sistema vertebrado.
- Apoya la reducción de riesgos mecanicistas al vincular la exposición al fármaco con resultados fenotípicos y del desarrollo tras la irradiación.
- Facilita la prueba rápida de hipótesis sobre efectos modificadores de la radiación en un contexto de organismo completo.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Proporciona una plataforma semiautomatizada de alto rendimiento para la selección de bibliotecas de compuestos con actividad radiomodificadora.
- Ofrece puntos finales cuantitativos y reproducibles, como la supervivencia, la frecuencia cardíaca y los fenotipos morfológicos.
- Permite condiciones de ensayo estandarizadas para la comparación cruzada de fármacos candidatos y controles.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Se alinea con puntos finales relevantes para la enfermedad al modelar la toxicidad inducida por radiación y la protección in vivo.
- Apoya la continuidad desde el descubrimiento inicial hasta la validación preclínica de modificadores de la radiación.
- Proporciona información para tomar decisiones de avance ajustadas al riesgo en carteras de fármacos oncológicos dirigidos a mejorar la radioterapia.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este ensayo con embriones de pez cebra sirve de puente entre el descubrimiento inicial y la validación preclínica, permitiendo la selección rápida y la evaluación funcional de modificadores de la radiación antes de los estudios en mamíferos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la prueba de hipótesis nulas para la modulación inducida por fármacos en la respuesta a la radiación.
- Tamizaje: Proporciona disponibilidad del ensayo con resultados fenotípicos cuantitativos y reproducibles.
- Analítica: Permite la comparación estadística de la supervivencia, el desarrollo y los parámetros fisiológicos entre grupos de tratamiento.
- Investigación Traducional: Modela la radiotoxicidad y la protección in vivo relevantes para las líneas de investigación en oncología.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma estandarizada y escalable para el tamizaje repetido de diversos conjuntos de compuestos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en el descubrimiento de modificadores de radiación.
- Valor operativo: Proporciona flujos de trabajo estandarizados, reproducibles y escalables para cribado in vivo.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital al permitir la reducción temprana de riesgos en fármacos candidatos.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización y el avance ajustados al riesgo de agentes modificadores de la radiación.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cría de pez cebra, estadiamiento de embriones y evaluación fenotípica.
- Necesita acceso a equipos de irradiación con rayos X e infraestructura de imágenes para el análisis final.
- Exige la estandarización entre equipos del montaje del ensayo, la dosificación y los criterios de puntuación.
- Puede requerir adaptaciones para clases específicas de compuestos o dosis de radiación.
- Las limitaciones prácticas incluyen restricciones en el rendimiento y la necesidad de un manejo cuidadoso de los grupos control.
