Name: Cuantificación de caspasa-9 inmunoteñida en tejido retiniano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 18 s
Description: Aprende a cuantificar caspasa-9 inmunoteñida en tejido retiniano mediante microscopía confocal. Este protocolo permite identificar funciones apoptóticas y no apoptóticas específicas por tipo celular en la retina.

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Este trabajo fue apoyado por el Programa de Becas de Investigación de Posgrado de la Fundación Nacional de Ciencias (NSF-GRFP) subvención DGE - 1644869 y el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (NINDS) de los Institutos Nacionales de Salud (NIH), número de premio F99NS124180 NIH NINDS Diversity Specialized F99 (a CKCO), el Instituto Nacional del Ojo (NEI) 5T32EY013933 (a AMP), el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (RO1 NS081333, R03 NS099920 a CMT), y el Departamento de Defensa del Ejército / Fuerza Aérea (DURIP a CMT).

Este protocolo sigue la declaración de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión. Los experimentos con roedores fueron aprobados y monitoreados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Columbia.
1. Preparación de tejido retiniano y criosección
<ol><li>Eutanasia a los animales mediante la administración de anestesia intraperitoneal (ketamina (80-100 mg/kg) y xilazina (5-10 mg/kg)), y perfundir a los ratones sometidos a RVO (ver8 para más detalles) con paraformaldehído al 4% (PFA) utilizando una bomba peristáltica. NOTA: Pellizque el dedo del pie al animal para confirmar la profundidad de la anestesia antes de proceder con la eutanasia y la perfusión. Los detalles sobre la perfusión se pueden encontrar en16.</li>
	<li>Cosechar los ojos mediante enucleación cuidadosa con fórceps y poner el globo en 1 ml de PFA al 4%. Dejar los ojos durante la noche a 4 °C. Lave los ojos tres veces durante 10 minutos, agregando 1 ml de 1x PBS y colocándolos en la coctelera.</li>
	<li>Sumerja los ojos en 1 ml de sacarosa al 30% durante 3 días, hasta que se asienten en el fondo del tubo, lo que indica la absorción de la sacarosa.</li>
	<li>Llene los ojos con un compuesto de temperatura de corte óptima con una jeringa de 30 G, hasta que el ojo tenga una apariencia redondeada (aproximadamente 50 μL).</li>
	<li>Incrustar los ojos en un criomold con un compuesto de temperatura de corte óptimo hasta que los ojos estén cubiertos y congelar a -80 °C hasta que estén listos para la criosección.</li>
	<li>La sección incrustó los ojos a 20 μm en portaobjetos de vidrio usando un criostato.<ol><li>Retire el bloque compuesto de temperatura de corte óptima del criomolde.</li>
		<li>Colóquelo en el mandril de criostato agregando un compuesto de temperatura de corte óptimo y colocando el bloque en el mandril. Déjelo dentro del criostato hasta que se congele.</li>
		<li>Proceda a cortar el bloque a 20 μm hasta que se vea el tejido retiniano. NOTA: Esto se puede confirmar con un microscopio óptico con un aumento de 30x (objetivo 3x, oculares 10x). Los tejidos se pueden distinguir de los medios OCT por color y forma.</li>
		<li>Recoja el tejido de la retina en portaobjetos de microscopio en una serie de cuatro secciones por portaobjetos. NOTA: Consulte la Figura 1A para la colocación sugerida de secciones retinianas.</li>
	</ol></li>
	<li>Etiquete las diapositivas con una identificación que desidentifique el tratamiento y el genotipo.</li>
	<li>Conservar los portaobjetos a -20 °C hasta que se tiñen.</li>
</ol>2. Inmunohistoquímica
NOTA: Utilice tejido criopreservado fijo para inmunohistoquímica para mantener la morfología celular. Seleccionar secciones que estén al nivel de las imágenes de tomografía de coherencia óptica (OCT) adquiridas in vivo7. Utilice las dos primeras series de portaobjetos recogidos del criostato o secciones de 150 μm en el tejido de la retina.
<ol><li>Coloque las guías en una cámara de corredera oscura y húmeda.</li>
	<li>Perpermeabilización y bloqueo: Lavar las secciones transversales de la retina con 300 μL de 1x PBS durante 5 min para eliminar la OCT y desechar después.</li>
	<li>Permeabilizar el tejido añadiendo 300 μL de 1x PBS con Triton X-100 al 0,1% durante 2 h a temperatura ambiente (RT) y desechar después.</li>
	<li>Bloquear el tejido añadiendo 300 μL de tampón de bloqueo (10% de suero normal de cabra (NGS), 1% de albúmina sérica bovina (BSA) en 1x PBS, filtrado) y dejar toda la noche a 4 °C.</li>
	<li>Anticuerpos primarios: diluyen los anticuerpos primarios en el tampón de bloqueo. Los anticuerpos primarios utilizados incluyen anti-cl-caspasa-9 en 1:800, anti-CD31 en 1:50 y anti-caspasa-7-488 (anticuerpo marcado directamente) en 1:150. NOTA: Siga las recomendaciones del fabricante para la dilución adecuada de anticuerpos primarios.<ol><li>Vierta las secciones del tampón de bloqueo y aplique 100 μL del cóctel de anticuerpos primarios a los portaobjetos de la retina.</li>
		<li>Incubar las secciones transversales durante la noche a 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Lave las secciones cuatro veces durante 5 min con 300 μL de 1x PBS. NOTA: Si las secciones de tejido son muy frágiles, los lavados deben eliminarse mediante acción capilar aplicando un pañuelo de papel en la esquina del portaobjetos para evitar el desplazamiento de las secciones de la retina.</li>
	<li>Para evitar el marcado cruzado de anticuerpos primarios criados en la misma especie huésped, complete la tinción con anticuerpos secundarios antes de aplicar los anticuerpos directamente marcados.</li>
	<li>Anticuerpos secundarios: diluir los anticuerpos secundarios en tampón de bloqueo a una concentración de 0.1%. Por ejemplo, para detectar anti-cl-caspasa-9, un anticuerpo criado en conejo, use cabra-anti-conejo-568 secundario.<ol><li>Aplicar 200 μL del cóctel de anticuerpos secundarios a las retinas.</li>
		<li>Incubar el tejido durante 2 h en RT.</li>
		<li>Lave las secciones cuatro veces durante 5 min con 300 μL de 1x PBS.</li>
		<li>Teñir los núcleos durante 5 min con 300 μL de DAPI a una dilución del 0,02%.</li>
	</ol></li>
	<li>Lavar una vez durante 5 min con 300 μL de 1x PBS.</li>
	<li>Coloque un cubreobjetos en las secciones de la retina utilizando 500 μL de medios fluoromount-G, que preservan la señal fluorescente, y coloque cuidadosamente el cubreobjetos en la parte superior del portaobjetos, evitando burbujas.</li>
</ol>3. Imágenes confocales
<ol><li>Adquirir imágenes de las secciones teñidas con microscopía confocal.<ol><li>Encienda el microscopio confocal.</li>
		<li>Coloque la diapositiva en el escenario.</li>
		<li>Ajuste el enfoque para ver claramente la sección retiniana. NOTA: Tome al menos cuatro imágenes por sección y la imagen cuatro secciones por retina. Consulte el esquema de imágenes de la retina para ver las áreas de imágenes sugeridas (Figura 1B, C).</li>
	</ol></li>
	<li>Imagen de tinción caspasa, vascular y nuclear utilizando un microscopio confocal que tiene adquisición de pila Z, utilizando un objetivo de 20x o 40x. NOTA: Los parámetros de imagen y la configuración del software deben ser constantes para todas las imágenes en un experimento. El objetivo 20x proporciona una visión general de las capas retinianas, que están bien definidas por la tinción nuclear. El objetivo 40x proporciona más detalles celulares.<ol><li>Establezca los tiempos de exposición e intensidad láser adecuados por canal haciendo clic en adquirir configuración.</li>
		<li>Configure la pila Z para visualizar toda la sección haciendo clic en la serie Z y configure parámetros hacia arriba y hacia abajo para cubrir la profundidad del tejido.</li>
	</ol></li>
	<li>Guarde las imágenes siguiendo el ID enmascarado asignado durante la criosección.</li>
</ol>4. Cuantificación de los niveles de caspasa
<ol><li>Arrastre archivos de imagen de 405, 470, 555 y 640 canales a la consola de FIJI.</li>
	<li>Haga clic en Imagen > Color > Combinar canales.</li>
	<li>Asigne colores a los archivos de la siguiente manera: rojo a 555, verde a 470, gris a 405, cian a 640.</li>
	<li>Comprima la pila Z haciendo clic en Imagen > Pila > Proyecto Z.</li>
	<li>Haga clic en Tipo de proyección: Intensidad máxima.</li>
	<li>Abra la interfaz de canales haciendo clic en Imagen > herramienta Canales de color.</li>
	<li>Abra la interfaz Brillo y contraste .</li>
	<li>Seleccione parámetros por canal.<ol><li>Ve a Canales y selecciona un canal.</li>
		<li>Coloque el cursor encima de la celda expresada en la caspasa y anote el valor del píxel.</li>
		<li>Coloque el cursor encima del fondo y anote el valor del píxel.</li>
	</ol></li>
	<li>Parámetros de prueba<ol><li>Vaya a la interfaz Brillo y contraste.</li>
		<li>Haga clic en Seleccionar.</li>
		<li>Introduzca el valor mínimo mostrado (valor de píxeles anotado de la celda expresada por la caspasa).</li>
		<li>Introduzca el valor máximo mostrado (valor de píxeles anotado del fondo).</li>
		<li>Haga clic en Aceptar.</li>
	</ol></li>
	<li>Repita los pasos 4.8-4.9 para todos los canales.</li>
	<li>Pruebe los parámetros eligiendo imágenes aleatorias de tejido cegado. NOTA: Edite los parámetros de brillo y contraste sólo si el valor de fondo no es adecuado para otras imágenes.</li>
	<li>Una vez establecidos los parámetros, abra los archivos de imagen y comprima la pila Z.</li>
	<li>Agregue los parámetros de brillo y contraste para el canal de caspasa y la isolectina, canal marcador vascular.</li>
	<li>Utilice la herramienta de puntos para cuantificar el número de áreas vasculares positivas utilizando la colocalización del marcador vascular con la expresión de caspasa como lectura de áreas positivas.</li>
	<li>Repita el paso 4.14 pero usando Hoechst como marcador de áreas neuronales positivas.</li>
	<li>Anota los valores de una hoja de cálculo por imagen.</li>
	<li>Promedie los valores por sección.</li>
	<li>Promedie los valores de la sección: esta será la lectura por ojo.</li>
</ol>5. Confirmación genética de la relevancia de la caspasa-9 de las células endoteliales
<ol><li>Utilice retinas obtenidas de los ratones Casp9FL/FL-VECad-CreERT2 que fueron sometidos a RVO7.</li>
	<li>Inmunoteñir las retinas para caspasa-9 (la caspasa eliminada), caspasa-7 (una caspasa efectora aguas abajo), marcadores vasculares y DAPI como se describe anteriormente en la sección 2.</li>
	<li>Imagen y cuantificación como se describe anteriormente en las secciones 3 y 4.</li>
</ol>6. Apuntando a la caspasa-9 en RVO
<ol><li>Obtener ojos de los ratones sometidos a RVO seguido de la aplicación del inhibidor de caspasa-9 Pen1-XBir3 tópicamente a los ojos como en7.</li>
	<li>Inmunoteñir las retinas para caspasa-7 (una caspasa efectora aguas abajo), marcadores vasculares y DAPI como se describe anteriormente en la sección 2.</li>
	<li>Imagen y cuantificación como se describe anteriormente en las secciones 3 y 4.</li>
</ol>

<ol><li>Van Opdenbosch, N., Lamkanfi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspases+in+cell+death%2C+inflammation%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Caspases in cell death, inflammation, and disease.</a> Immunity. 50 (6), 1352-1364 (2019).</li>
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<li>London, A., Benhar, I., Schwartz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retina+as+a+window+to+the+brain-from+eye+research+to+CNS+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders.</a> Nature Reviews Neurology. 9 (1), 44-53 (2013).</li>
<li>Song, P., Xu, Y., Zha, M., Zhang, Y., Rudan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+epidemiology+of+retinal+vein+occlusion%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis+of+prevalence%2C+incidence%2C+and+risk+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Global+Health%22%5BJournal%5D)">Global epidemiology of retinal vein occlusion: a systematic review and meta-analysis of prevalence, incidence, and risk factors.</a> Journal of Global Health. 9 (1), 010427(2019).</li>
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<li>McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overlapping+cleavage+motif+selectivity+of+caspases%3A+implications+for+analysis+of+apoptotic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways.</a> Cell Death & Differentiation. 15 (2), 322-331 (2007).</li>
<li>Kuida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+apoptosis+and+cytochrome+c-mediated+caspase+activation+in+mice+lacking+caspase+9%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reduced apoptosis and cytochrome c-mediated caspase activation in mice lacking caspase 9.</a> Cell. 94 (3), 325-337 (1998).</li>
<li>Troy, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Death+in+the+balance%3A+alternative+participation+of+the+caspase-2+and+-9+pathways+in+neuronal+death+induced+by+nerve+growth+factor+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Death in the balance: alternative participation of the caspase-2 and -9 pathways in neuronal death induced by nerve growth factor deprivation.</a> Journal of Neuroscience. 21 (14), 5007-5016 (2001).</li>
</ol>

Los autores declaran los siguientes intereses en conflicto: C.M.T. tiene las siguientes solicitudes de patente US20200164026, US20190142915 y US20150165061. C.M.T. y S.S. tienen una solicitud de patente US 20140024597. C.M.T., A.M.P. y M.I.A. tienen una solicitud de patente US2020058683. C.M.T. y Y.Y.J. tienen una solicitud de patente WO2018013519. M.I.A y C.M.T figuran como inventores en una solicitud de patente WO/2020/223212 por los fideicomisarios de la Universidad de Columbia en la ciudad de Nueva York. Los autores restantes declaran que no hay intereses contrapuestos.

Las caspasas son una familia de proteasas de varios miembros mejor estudiada por su papel en la muerte celular y la inflamación; Sin embargo, más recientemente se han descubierto una variedad de funciones no mortales para algunos miembros de la familia 4,5. Gran parte de nuestra comprensión de la función de la caspasa se deriva del trabajo en cultivo celular y de datos inferenciales de enfermedades humanas. Si bien se aprecia que hay inducción, activación o inact...

Las caspasas son una familia de proteasas que regulan la muerte celular del desarrollo, las respuestas inmunes y la muerte celular aberrante en la enfermedad 1,2. Si bien es bien sabido que los miembros de la familia de las caspasas son inducidos en una variedad de enfermedades neurodegenerativas, comprender qué caspasa impulsa la patología de la enfermedad es más difícil3. Tales estudios requieren herramientas para identificar, caracterizar y validar la función de los miembros individuales de la familia de caspasas. El análisis de las caspasas individuales relevantes es importante tanto desde un punto de vista mecanicista como terapéutico, ya que la literatura tiene múltiples estudios que proporcionan evidencia de los diversos roles de las caspasas 4,5. Por lo tanto, si el objetivo es apuntar a una caspasa en una enfermedad para obtener un beneficio terapéutico, es fundamental tener una orientación específica de los miembros relevantes de la familia. Las técnicas tradicionales para detectar los niveles de caspasa en el tejido incluyen Western blot y enfoques enzimáticos y fluorométricos 3,6. Sin embargo, ninguna de estas medidas permite la detección específica de células de los niveles de caspasas, y en algunos escenarios, las caspasas escindidas a menudo no pueden detectarse mediante las medidas tradicionales de análisis de proteínas. Se sabe que las caspasas pueden desempeñar diferentes funciones apoptóticas y no apoptóticas en el mismo tejido7, por lo tanto, se necesita una caracterización cuidadosa de los niveles de caspasa específicos de las células para una comprensión precisa de las vías de desarrollo y enfermedad.
Este estudio muestra la activación y función de la caspasa en un modelo de hipoxia-isquemia neurovascular - oclusión de la vena retiniana (OVR)7,8. En un tejido complejo como la retina, hay múltiples tipos de células que pueden verse afectadas por la hipoxia-isquemia inducida en la OVR, incluidas las células gliales, las neuronas y la vasculatura7. En la retina del ratón adulto, hay muy poca expresión de caspasas evidentes en el tejido sano, medida por inmunohistoquímica (IHC)7, pero ese no es el caso durante el desarrollo9 o en modelos de enfermedad retiniana10,11. IHQ es una técnica bien establecida en la investigación biomédica y ha permitido la validación de dianas patológicas y de enfermedades, la identificación de nuevos roles a través de la localización espacial y la cuantificación de proteínas. En los casos en que los productos de caspasa escindidos no puedan detectarse mediante Western blot o análisis fluorométrico, ni la ubicación celular específica de distintas caspasas o la interrogación de las vías de señalización de caspasas a través de la localización, entonces se debe usar IHQ.
Para determinar la(s) caspasa(s) funcional(es) relevante(s) en la RVO, se utilizó IHQ con anticuerpos validados para caspasas y marcadores celulares. Los estudios previos realizados en el laboratorio mostraron que la caspasa-9 se activó rápidamente en un modelo de accidente cerebrovascular isquémico e inhibición de caspasa-9 con un inhibidor altamente específico protegido de la disfunción neuronal y la muerte12. Debido a que la retina es parte del sistema nervioso central (SNC), sirve como un sistema modelo para consultar e investigar más a fondo el papel de la caspasa-9 en las lesiones neurovasculares13. Con este fin, se utilizó el modelo de ratón de RVO para estudiar la ubicación y distribución específica de la célula de la caspasa-9 y su implicación en la lesión neurovascular. La OVR es una causa común de ceguera en adultos en edad laboral que resulta de una lesión vascular14. Se encontró que la caspasa-9 se expresó de manera no apoptótica en las células endoteliales, pero no en las neuronas.
Como tejido, la retina tiene la ventaja de ser visualizada como un montaje plano, que permite la apreciación de las redes vasculares, o como secciones transversales, que resaltan las capas neuronales de la retina. La cuantificación de la expresión de la proteína caspasa en secciones transversales proporciona un contexto con respecto a qué caspasa es potencialmente crítica en la conectividad neuronal de la retina y la función de la visión mediante la identificación de la localización de la caspasa (s) en la retina. Después de la identificación y validación, la focalización de la caspasa de interés se logra mediante la deleción inducible específica de la célula de la caspasa identificada. Para posibles indagaciones terapéuticas, se probó la relevancia de las caspasas de interés utilizando herramientas específicas para inhibir la caspasa activada. Para la caspasa-9 se utilizó un inhibidor altamente selectivo 7,15 de la célula que significaba Pen1-XBIR3. Para este informe, se utilizó cepa C57BL/6J masculina de 2 meses de edad y cepa knockout endotelial 9 inducible por tamoxifeno (iEC Casp9KO) con antecedentes C57BL/6J. Estos animales fueron expuestos al modelo de ratón de RVO y C57BL / 6J fueron tratados con el inhibidor selectivo de caspasa-9, Pen1-XBir3. La metodología descrita puede ser aplicada a otros modelos de enfermedad en los sistemas central y periférico 7,15.

<table><tbody><tr><td>anti-Caspasa-7 488</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB-56529AF488</td><td>uso a 1:150</td></tr><tr><td>anti-cl-Caspasa-9</td><td>Cell Signaling</td><td>9505-S</td><td>uso a 1:800</td></tr><tr><td>anti-CD31</td><td>BD Pharmingen</td><td>553370</td><td>uso a 1:50</td></tr><tr><td>Microscopio de disco giratorio confocal</td><td>Biovision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI 2.3.0</td><td>código</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>abiertoPinza Fluormount G</td><td>Fisher</td><td>50-187-88</td><td></td></tr><tr><td>Roboz</td><td></td><td>RS-5015</td><td></td></tr><tr><td>iCasp9FL/FL X VECad-CreERT2</td> ratones <td>generados en</td><td></td> laboratorio <td>ver Avrutsky 2020</td></tr><tr><td>Isolectina (594, 649)</td><td>Vector</td><td>DL-1207</td><td>uso a 1:200</td></tr><tr><td>Clorhidrato de ketamina</td><td>Henry Schein</td><td>NDC: 11695-0702-1</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de perfusión&nbsp;</td><td>Masterflex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pen1-XBir3</td><td>generado en</td><td></td> laboratorio <td>ver Avrutsky 2020</td></tr><tr><td>Prism 9.1</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T.</td><td>Fisher</td><td>14-373-65</td><td></td></tr><tr><td>Vis-a-View 4.0</td><td>Visitron Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Akorn</td><td>NDCL 59399-110-20</td><td></td></tr></tbody></table>

cuantificación de caspasa-9 inmunoteñida en tejido retiniano

Quantification of Immunostained Caspase-9 in Retinal Tissue

Se sabe que la familia de caspasas media muchas vías celulares más allá de la muerte celular, incluida la diferenciación celular, la búsqueda de caminos axonales y la proliferación. Desde la identificación de la familia de proteasas de muerte celular, se han buscado herramientas para identificar y ampliar la función de miembros específicos de la familia en estados de desarrollo, salud y enfermedad. Sin embargo, muchas de las herramientas de caspasa disponibles comercialmente actualmente que se utilizan ampliamente no son específicas para la caspasa dirigida. En este informe, delineamos el enfoque que hemos utilizado para identificar, validar y atacar la caspasa-9 en el sistema nervioso utilizando un nuevo inhibidor y enfoques genéticos con lecturas inmunohistoquímicas. Específicamente, utilizamos el tejido neuronal retiniano como modelo para identificar y validar la presencia y función de las caspasas. Este enfoque permite la interrogación de las funciones apoptóticas y no apoptóticas específicas de tipo celular caspasa-9 y se puede aplicar a otros tejidos complejos y caspasas de interés. Comprender las funciones de las caspasas puede ayudar a ampliar el conocimiento actual en biología celular, y también puede ser ventajoso para identificar posibles objetivos terapéuticos debido a su participación en la enfermedad.

El protocolo descrito permite al usuario analizar y cuantificar los niveles de caspasa-9 en el tejido retiniano. Además, presenta herramientas para identificar, validar y apuntar específicamente a la caspasa-9 y los sustratos aguas abajo. Los pasos resumidos permiten un análisis cuantificable de los niveles de caspasa y la especificidad celular en fotomicrografías fluorescentes. Todas las figuras muestran fotomicrografías representativas y cuantificación de los niveles indicados de caspasa en la retina total, las células...

Aquí se presenta un protocolo detallado de inmunohistoquímica para identificar, validar y apuntar a caspasas funcionalmente relevantes en tejidos complejos.

Cuantificación de caspasa-9 inmunoteñida en tejido retiniano

The family of caspases is known to mediate many cellular pathways beyond cell death, including cell differentiation, axonal pathfinding, and ...

Este protocolo proporciona un método inmunohistoquímico detallado para identificar, validar y atacar caspasas funcionalmente relevantes en tejidos complejos. La principal ventaja de esta técnica es que permite interrogar las funciones específicas de caspasa-9 apoptóticas y no apoptóticas de tipo celular y se puede aplicar a otros tejidos complejos y caspasas de interés. Comprender las funciones de las caspasas puede ayudar a ampliar el conocimiento actual en biología celular y también puede ser ventajoso para identificar posibles objetivos terapéuticos debido a su participación en la enfermedad.Comience a cuantificar los niveles de caspasa utilizando imágenes de microscopía confocal de secciones retinianas teñidas. Para ello, arrastre los archivos de imagen de los canales 405, 470, 555 y 640 a la consola de Fiji. Haga clic en las pestañas Imagen, Color y Combinar canales para asignar colores a los archivos.A continuación, comprima la pila Z haciendo clic en la pila de imágenes y el proyecto Z. Seleccione el tipo de proyección como intensidad máxima. Abra la interfaz del canal haciendo clic en la imagen seguida de la herramienta del canal de color.A continuación, abra la interfaz de brillo y contraste. Para seleccionar los parámetros por canal, vaya a la pestaña del canal y elija un canal. Coloque el cursor encima del fondo y anote el valor del píxel.Luego coloque el cursor en la celda expresada por la caspasa y anote el valor del píxel. Para probar los parámetros, vaya a la interfaz de brillo y contraste y haga clic en seleccionar. Introduzca el valor mínimo mostrado o el valor de píxeles de la celda expresada por la caspasa.A continuación, introduzca el valor máximo mostrado o el valor del píxel de fondo antes de hacer clic en Aceptar. Elija las imágenes aleatorias del tejido cegado y repita la selección de parámetros por canal para probar los parámetros de todos los canales. Una vez establecidos los parámetros, abra los archivos de imagen y comprima la pila Z.Agregue los parámetros de brillo y contraste para el canal de caspasa y la isolectina para el canal marcador vascular. Utilice la herramienta de puntos y cuantifique el número de áreas vasculares positivas utilizando la colocalización del marcador vascular con expresión de caspasa como lectura de áreas positivas. Luego, utilizando ganchos como marcador de áreas neuronales positivas, cuantificar el número de áreas vasculares positivas.Anote los valores de una hoja de cálculo por imagen y promedie los valores por sección. Promedie los valores de sección, que serán la lectura por ojo. El protocolo identificó la localización celular de las caspasas y las capas neuronales de la retina en las que se expresan las caspasas.La sección transversal retiniana permitió la visualización de los núcleos retinianos en la capa ganglionar retiniana o RGL, capa internuclear o INL, y la capa nuclear externa o ONL cuando se tiñe con ganchos. En la sección transversal, los vasos sanguíneos retinianos aparecieron desconectados y separados suministrando las capas plexiformes entre la RGL y la INL y entre la INL y la ONL. Las secciones transversales de la retina también identificaron la caspasa-9 altamente regulada, un día después de la oclusión de la vena retiniana.La inhibición de la caspasa-9 fue más efectiva para reducir la expresión neuronal de caspasa-7 en ratones knockout de células endoteliales, lo que validó la relevancia funcional de la caspasa-9 endotelial. El análisis representativo mostró que la inhibición de la actividad de la caspasa-9 bloqueó farmacológicamente la expresión de caspasa-7 después de la oclusión de la vena retiniana. El éxito de la técnica se basa en la preparación cuidadosa del tejido, así como en la IHQ y las imágenes microscópicas para garantizar la consistencia, validez y confiabilidad de los datos.Este método podría combinarse con el análisis western blotting para la comparación semicuantitativa de la señalización de caspasas. La técnica proporcionó los pasos para interrogar la eficacia de un enfoque terapéutico dirigido a la caspasa-9 activa en la OVR. Este enfoque también se puede aplicar a otros tejidos, incluido el cerebro.

quantification-of-immunostained-caspase-9-in-retinal-tissue

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

La catarata es la principal causa de ceguera en el mundo. Radiación solar ultravioleta (UVR) es el principal factor de riesgo para el desarrollo de cataratas. Un modelo animal de lejos catarata inducida por UVR-B fue desarrollado. En este artículo se describen los métodos para la investigación de la formación de cataratas: La exposición a los rayos UV, cuantitativos RT-PCR e inmunohistoquímica.

Caracterización de los mecanismos moleculares de la<em&gt; En vivo</em&gt; Catarata inducida por RUV

Fuente: Lani-Louzada, R., et al. Cauterización de círculo completo del plexo vascular limbal para el glaucoma inducido quirúrgicamente en roedores. J. Vis. Exp. (2022). Este video demuestra la cuantificación de células ganglionares de la retina de retinas de rata fijadas químicamente y sometidas a la cauterización de círculo completo del plexo vascular limbal. El proceso incluye permeabilización, tinción de anticuerpos y contratinción nuclear, seguida de la visualización bajo un microscopio de...

Cuantificación de los somas de células ganglionares de la retina después de la hipertensión ocular inducida por cauterización 

El protocolo descrito aquí es para la evaluación estructural de una preparación de retina de montaje completo. Esto incluye descripciones de la disección de tejidos, el montaje en un inserto de membrana de politetrafluoroetileno (PTFE) hidrofilizado, la carga en bolo con marcadores fluorescentes y una comparación de la fijación con carbodiimida y paraformaldehído para el análisis inmunohistoquímico de componentes celulares y sinápticos.

Protocolo optimizado para Retina Preparación Wholemount de la Imagen y la inmunohistoquímica

El infarto de miocardio (IM) no solo va seguido de un deterioro de la función cardíaca, sino también de una apoptosis en la amígdala, una región del cerebro implicada en las consecuencias conductuales del IM. Este protocolo describe cómo inducir el infarto de miocardio, recolectar tejido de la amígdala y medir la actividad de la caspasa-3, un marcador de apoptosis.

Caspasa-3 La actividad en la amígdala de rata Medido por espectrofluorometría Después de Infarto de Miocardio

Este protocolo describe el flujo de trabajo para obtener macrófagos derivados de monocitos (MDM) a partir de muestras de sangre humana, un método simple para introducir eficientemente reporteros de complementación de fluorescencia bimolecular de caspasa inflamatoria (BiFC) en MDM humanos sin comprometer la viabilidad y el comportamiento celular, y un enfoque basado en imágenes para medir la activación de la caspasa inflamatoria en células vivas.

Visualización de la proximidad inducida por caspasas inflamatorias en macrófagos derivados de monocitos humanos

Este protocolo describe un método integral para evaluar la activación de caspasas (caspasa-1, caspasa-3, caspasa-7, caspasa-8, caspasa-9 y caspasa-11) en respuesta a modelos de infección, insultos estériles y cáncer tanto in vitro como in vivo (en ratones) para determinar el inicio de vías de muerte celular, como piroptosis, apoptosis, necroptosis y PANoptosis.

Evaluación de la activación de la caspasa para evaluar la muerte celular inmune innata

El presente protocolo describe dos métodos para medir la actividad de las caspasas a través de un sustrato fluorogénico utilizando citometría de flujo o un espectrofluorómetro.

Medición de la actividad de las caspasas mediante un ensayo fluorométrico o citometría de flujo

Se desarrolló un ensayo de protección para monitorizar la resistencia de la vasculatura de la retina a la muerte por lesiones relacionadas con la diabetes/retinopatía diabética, como el estrés oxidativo y las citocinas.

Un ensayo para detectar la protección de la vasculatura de la retina frente a la muerte relacionada con la diabetes en ratones

Se describe un protocolo para preparar criosecciones de retina en ratones y realizar inmunotinción en fotorreceptores. Este artículo permite a los investigadores producir de forma consistente secciones congeladas de retina de ratón con una morfología bien conservada y resultados de inmunotinción de alta calidad.

Criosección e inmunotinción de retina de ratón

La transfección de células de ratón del ganglio de la retina por In vivo La electroporación

Aprende a cuantificar caspasa-9 inmunoteñida en tejido retiniano mediante microscopía confocal. Este protocolo permite identificar funciones apoptóticas y no apoptóticas específicas por tipo celular en la retina.

Cuantificación de caspasa-9 inmunoteñida en tejido retiniano

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