Uso de imágenes in vivo para detectar fenotipos de morfogénesis en cepas mutantes de Candida albicans durante la infección activa en un huésped mamífero

La morfogénesis de Candida albicans se desencadena por una miríada de señales ambientales. Al estudiar la morfogénesis in vivo, estamos determinando cómo el organismo se integra y responde a todas estas señales ambientales. La principal ventaja de esta técnica es que nos permite estudiar la morfogénesis en ausencia de sesgos o artefactos que puedan introducirse utilizando sistemas de modelos in vitro.

Muy pocas personas tienen experiencia con inyecciones intradérmicas. Recomiendo encarecidamente que alguien nuevo en esta técnica se ponga en contacto con su veterinario de recursos animales para obtener ayuda para aprenderla. Demostrando el procedimiento estará Rohan Wakade, becario postdoctoral de nuestro grupo de laboratorio.

Comience preparando al animal para la inoculación alimentando a la comida sin clorofila durante al menos siete días antes de la inoculación. Un día antes de la inyección, tome un poco de células albicans de Canadá de una colonia con un palillo de dientes. Inocular 25 mililitros de YPD y repetir este proceso varias veces para obtener células de varias colonias diferentes.

Incubar el cultivo durante la noche a 30 grados centígrados en una incubadora de agitador orbital a 175 RPM. Centrifugar un mililitro de cultivo durante dos minutos a 500 x g, luego lavar la levadura tres veces con un mililitro de DPBS estéril. Resuspender el pellet en un mililitro de DPBS estéril y diluir el cultivo de 1 a 100.

Cuente las células con un hemocitómetro y, en consecuencia, ajuste la densidad celular. A continuación, cree el inóculo para inyección mezclando volúmenes iguales de la cepa referenciada y experimental. Usando un hisopo con punta de algodón, aplique una crema depilatoria de venta libre generosamente en la superficie interna y externa de ambas orejas de un animal anestesiado.

Después de dos o tres minutos, limpie suavemente la oreja con una gasa seca seguida de gasas saturadas en agua estéril para eliminar completamente los residuos de crema depilatoria. Después de esterilizar la superficie de las orejas con etanol al 70%, mezcle bien el inóculo invirtiendo el vial varias veces o vórticelo. Extraiga de 20 a 30 microlitros de inóculo en una jeringa de insulina.

Sostenga la aguja en posición vertical y golpee suavemente la jeringa para asegurarse de que el aire en el barril esté en la parte superior. Expulse cuidadosamente el aire y el exceso de inóculo de nuevo en el tubo de inóculo o en un tubo de residuos para que el émbolo esté en la marca de 10 microlitros. Aplique sobre el mostrador cinta adhesiva de doble cara a un pequeño tubo de plástico cónico o de fondo redondo y coloque la oreja a través de la cinta, evitando desalojar el cono nasal de anestesia.

Manteniendo la aguja de la jeringa casi paralela a la piel y evitando las venas grandes, inserte la punta de la aguja en la capa más externa de la piel hasta que el bisel esté cubierto e inyecte lentamente el inóculo por vía intradérmica. Una buena inyección intradérmica levantará una pequeña burbuja en la piel. Mantenga la aguja en su lugar durante 15 a 20 segundos antes de retirarla del oído para minimizar las fugas.

Siguiendo los protocolos institucionales, marque la jaula con etiquetas de riesgo biológico que indiquen que los animales en la jaula están infectados con Candida albicans. Usando los mismos cultivos lavados que se usaron para preparar el inóculo, cree una dilución de 1 a 50 de células en RPMI 1640, complementada con 10% de calor y suero bovino fetal activado e incube a 37 grados centígrados con volteo durante cuatro horas. Examine la muestra con un microscopio.

Contar al menos 100 células, registrando el número de levaduras y células filamentosas para cada cepa. Gire el objetivo de larga distancia de trabajo en su lugar y coloque una gota de líquido de inmersión en la lente. Baje la lente para evitar posibles daños al colocar el cubreobjetos.

Coloque el deslizamiento de la cubierta número 1.5 sobre la abertura del escenario y péguelo en su lugar. Levante el objetivo para que el fluido de inmersión esté en contacto tanto con la lente del objetivo como con el cubreobjetos. Asegure un cono nasal de anestesia en la etapa del microscopio de tal manera que cubra completamente la nariz del animal cuando esté en posición para la obtención de imágenes.

Coloque la nariz de un ratón anestesiado en el cono de la nariz. Coloque una gota de agua estéril en el cubreobjetos sobre la lente del objetivo. Ajuste el cono de la nariz de anestesia y coloque el ratón de tal manera que la oreja del ratón esté por encima de la gota de agua.

Tome otro cubreobjetos y coloque el borde del cubrebocado paralelo al cuerpo del ratón con el borde tocando el ratón donde la oreja se encuentra con la cabeza. Con un movimiento de bisagra, baje el borde libre del deslizamiento de la cubierta hasta la etapa del microscopio. A medida que el deslizamiento de la cubierta viene contra la etapa del microscopio, aplanará la oreja.

Pegue con cinta adhesiva el deslizamiento de la cubierta superior de forma segura para mantener la presión suficiente para mantener la oreja plana y evitar atrapar el pelo o los bigotes del ratón en la cinta. A menos que se use un microscopio con una cámara ambiental, cubra holgadamente el cuerpo del ratón con una cortina estéril para mantener un ambiente térmico normal. Usando luz blanca, imágenes de campo amplio, ajuste el plano de enfoque en el tejido del oído y concéntrese en los glóbulos rojos que se mueven en los vasos sanguíneos.

Para obtener una relación señal/ruido lo suficientemente fuerte como para que se pueda determinar la morfología de todas las células en el campo de visión, ajuste la potencia del láser o la velocidad de imagen. Para evitar daños en los tejidos, utilice la menor potencia láser posible. Elija un campo de visión con una formación clara de filamentos en la cepa referenciada y donde la mayoría de los organismos estén lo suficientemente dispersos como para que se pueda determinar su morfología.

Establezca los planos superior e inferior de enfoque para una pila Z. No es necesario cubrir toda la profundidad del área infectada, pero tenga en cuenta que los organismos en la parte superior o inferior del volumen de la imagen generalmente se excluyen del análisis. Adquiera imágenes Z-stack, pseudo coloree cada canal para distinguir cada cepa y superponga los canales.

Guarde las imágenes. Utilice software de imágenes para realizar una proyección máxima de la pila Z en una imagen bidimensional. Contar cada organismo visto en las imágenes de proyección máxima por tipo de cepa y morfología.

La cepa referenciada forma rápidamente filamentos in vitro. Mientras que el EFG1 Null no pudo formar los filamentos. El EFG1 Null también exhibe un defecto de filamentación significativo in vivo.

Aproximadamente el 9% de las células nulas EFG1 crecieron como filamentos in vivo. Del mismo modo, la cepa mutante CYR1 Null mostró un defecto de filamentación in vitro en comparación con la cepa referenciada. En contraste, el 53% de las células mutantes nulas CYR1 crecieron como filamentos in vivo.

Los filamentos formados por el mutante CYR1 Null eran más cortos que la cepa referenciada. Es fundamental mantener la aguja paralela a la piel durante la inoculación. El objetivo es colocar el inóculo justo debajo de la capa externa de la piel.

Esta técnica también se puede utilizar con cepas de ratón que expresan una proteína fluorescente en células huésped de interés, lo que nos permite estudiar las interacciones del patógeno del huésped in vivo.