Cuantificación experimental de las interacciones entre los sistemas de administración de fármacos y las células in vitro: una guía para la evaluación preclínica de nanomedicina

Este protocolo proporciona datos cuantitativos sobre cómo los sistemas portadores interactúan con las células. Los datos cuantitativos son clave para la ingeniería y la optimización. Nos permite pasar de preguntas biológicas de sí o no, a cuántas preguntas.

Esta técnica es útil para convertir los resultados del rendimiento preclínico del portador del fármaco, que fueron cualitativos, en resultados cuantitativos. Y esto funciona incluso cuando caracterizas a tu portador en un sistema diferente al que caracterizas tus células. Puede tomar algunas iteraciones encontrar la dilución portadora óptima que caiga dentro de los rangos lineales o cuantitativos del lado nano.

Tómese su tiempo para encontrar las condiciones adecuadas. Para comenzar, monte la celda de flujo en el módulo láser. Enjuague lentamente la celda de flujo a una velocidad de 0.1 mililitros por segundo con un mililitro de agua destilada.

Si se forman burbujas dentro de la celda de flujo, retraiga parcialmente la suspensión para fusionar la burbuja con la interfaz aire-líquido antes de continuar. Luego bloquee todo el módulo láser en su lugar dentro del instrumento. Inicie la cámara aproximadamente a la mitad del enjuague.

Asegúrese de confirmar que los residuos del portador se hayan lavado. Seleccione captura para abrir la pestaña Configuración de captura y haga clic en iniciar cámara. Impulse el sistema con un mililitro de aire.

Si hay portadores estáticos visibles en la pantalla, limpie la celda de flujo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Prepare los portadores para el análisis de seguimiento de nanopartículas, asegurándose de que los portadores estén bien suspendidos mediante sonicación o vórtice, dependiendo del sistema portador involucrado. Diluir los portadores en agua para preparar al menos 0.6 a un mililitro de cada muestra con una concentración de portador entre 1x10 a la séptima y 1x10 a la novena portadora por mililitro.

Saque el módulo láser y colóquelo en posición vertical. Coloque la primera muestra portadora en una jeringa de un mililitro y conecte la jeringa a la entrada del tubo. Luego cargue cuidadosamente la muestra en la celda de flujo.

Si se forman burbujas dentro de la celda de flujo, retraiga la suspensión parcialmente para fusionar la burbuja con la interfaz aire-líquido antes de continuar. Asegúrese de que toda la celda de flujo esté llena de líquido, luego detenga la carga. Ajuste el enfoque de la cámara si es necesario para visualizar portadores individuales.

Realice ajustes de enfoque grueso con la perilla giratoria en el lado derecho del instrumento. Realice ajustes más finos seleccionando la pestaña de hardware. Cambie el enfoque ajustando el control deslizante de enfoque.

Para asegurarse de que no haya sobresaturación, seleccione el nivel óptimo de la cámara ajustando el control deslizante dentro de la pestaña de captura. Si el instrumento está equipado con este accesorio, cargue la jeringa que contiene la muestra portadora en la bomba de la jeringa. En la pestaña SOP, seleccione la medición estándar para realizar cinco capturas de 30 segundos cada una.

Ingrese el nombre del archivo base y, si lo desea, agregue información de muestra adicional haciendo clic en el botón avanzado que abrirá un diálogo modal con varias opciones. Presione crear y ejecutar script y espere a que aparezca una ventana emergente que le pida que avance la muestra. Si utiliza la bomba de jeringa, seleccione la pestaña de hardware y, a continuación, la pestaña de bomba de jeringa.

Ajuste la velocidad de infusión deseada y presione la infusión. Si no está utilizando la bomba de jeringa, avance manualmente la muestra. En la ventana emergente, seleccione Aceptar para comenzar a capturar.

Después de cada una de las cinco capturas, cuando vuelva a aparecer la muestra avanzada por favor, compruebe que la muestra sigue moviéndose a través de la celda de flujo. A continuación, seleccione Aceptar para continuar con la siguiente captura. En la pestaña de proceso, ajuste el control deslizante del umbral de detección entre cuatro y ocho para identificar correctamente los distintos portadores visibles en la pantalla.

Puede ajustar la ganancia de la pantalla para ayudar a la visualización, no afectará el análisis posterior. En la ventana emergente, presione OK para iniciar el análisis de seguimiento. Supervise el progreso del análisis haciendo clic en el análisis en la pestaña de análisis único.

Una vez finalizado el análisis, busque que aparezca un mensaje de configuración de exportación. Confirme que la opción incluir PDF e incluir resumen del experimento está seleccionada. Seleccione cualquier otro formato de exportación que desee.

En la sección de resultados de la exportación de datos PDF, para asegurarse de que la concentración medida es fiable, verifique que la concentración portadora medida esté entre 1x10 a la séptima y 1x10 a la novena portadora por mililitro y compruebe si hay mensajes de error o mensajes de precaución debajo del resultado de la medición de concentración. Repita el procedimiento dos o más veces con diferentes diluciones de la cepa, y asegúrese de que la concentración de cada muestra caiga dentro del rango lineal del instrumento. Calcule la concentración de portadores de existencias como se describe en el texto manuscrito.

Prepare la solución de fluorocromo libre o conjugada con anticuerpos como se describe en el texto manuscrito. Calcule la concentración de la solución madre a partir de la concentración, el peso molecular y el número de Avogadro como se muestra en la ecuación. Luego realice una dilución en serie del tinte en el diluyente portador para generar muestras de curva estándar.

Luego agregue la muestra portadora a la placa de medición y mida la fluorescencia usando un lector de microplacas. Genere la curva estándar como se describe en el texto manuscrito. Calcule la intensidad absoluta de fluorescencia por portador dividiendo la fluorescencia a granel por la concentración de portador.

Configure el citómetro de flujo para el experimento final de la celda portadora determinando los ajustes óptimos de voltaje PMT en los canales relevantes. Ejecute una muestra de control negativo donde las células no se incuben con portadores para determinar la fluorescencia de fondo. Preparar y volver a suspender las perlas de cuantificación de citometría de flujo.

Utilice el mismo búfer que se utiliza para las muestras de células. Si las poblaciones de cuentas se proporcionan por separado, juntelas juntas. Ejecute el cordón de cuantificación de citometría de flujo y las muestras de células portadoras para determinar la intensidad de fluorescencia por célula.

Ejecute las perlas de cuantificación del citómetro de flujo para generar una curva estándar, convirtiendo la intensidad fluorescente absoluta en MFI. Utilice esto para calcular la IMF teórica de los portadores como se describe en el texto manuscrito. Ejecute las muestras de portadores celulares para determinar la intensidad fluorescente por celda de cada muestra.

Finalmente, calcule el número de portadores por celda para cada muestra restando la fluorescencia de fondo de la fluorescencia medida de la muestra y luego dividiendo por la fluorescencia por partícula. Para partículas de núcleo de ácido polimetacrílico de 633 nanómetros, la concentración y la intensidad fluorescente por portador se cuantificaron directamente utilizando la corriente del citómetro. En contraste, las nanopartículas de óxido de hierro súper paramagnético de 100 nanómetros eran demasiado pequeñas para detectarlas individualmente y se analizaron utilizando la corriente a granel.

Las perlas de cuantificación etiquetadas se utilizaron en varios días para generar curvas estándar en un citómetro de flujo. La correlación entre la IMF medida y el valor MESF de las perlas de cuantificación fue lineal y ampliamente similar entre las fechas medidas. Los experimentos de curso de tiempo utilizando células HeLa marcadas con fluorescencia con cápsulas de ácido polimetacrílico de 235 nanómetros de cero a 24 horas mostraron un aumento en la MFI con el tiempo, lo que indica que las cápsulas se asociaban con células HeLa.

La diferencia en la respuesta celular aparente a los portadores fue marcada, dependiendo de la cuantificación relativa o absoluta. La cuantificación absoluta fue independiente de la intensidad del etiquetado y, por lo tanto, más comparable. Estas técnicas son la base para un análisis más profundo y una comparación del rendimiento de las partículas.

Estamos entusiasmados con el uso de estas técnicas para parametrizar modelos matemáticos que nos permitirán caracterizar el rendimiento de las partículas independientemente de cualquier experimento en particular.