Name: Aplicaciones técnicas de la matriz de microelectrodos y los registros de pinza de parche en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Aprenda a evaluar la contractilidad y electrofisiología de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC-CM) para la seguridad cardíaca en desarrollo de fármacos.

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Agradecemos a Blake Wu por corregir el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978 y NASA NNX16A069A (JCW), y AHA Postdoctoral Fellowship 872244 (GMP).

1. Preparación de medios y soluciones
<ol><li>Prepare el medio de mantenimiento hiPSC-CM mezclando un frasco de 10 ml de suplemento 50x B27 y 500 ml de medio RPMI 1640. Conservar el medio a 4 °C y utilizarlo en el plazo de un mes. Equilibre el medio a la temperatura ambiente (RT) antes de usarlo.</li>
	<li>Preparar el medio de siembra hiPSC-CM mezclando 20 ml de reemplazo sérico y 180 ml de medio de mantenimiento hiPSC-CM (dilución al 10%, v/v). Si bien se prefiere el medio de siembra recién preparado, se puede almacenar a 4 ° C durante no más de 2 semanas. Equilibre el medio a RT antes de usarlo.</li>
	<li>Preparar la solución de recubrimiento de matriz extracelular descongelando un frasco (10 ml) de matriz de membrana basal a 4 °C durante la noche y alícuota 500 μL de matriz de membrana basal en tubos estériles de 1,5 ml. Conservar a -20 °C para su uso posterior. Mezcle 500 μL de matriz de membrana basal y 100 ml de medio DMEM/F12 helado (dilución 1:200, v/v) para hacer una solución de recubrimiento de matriz de membrana basal.</li>
	<li>Prepare 50 ml de solución de Tyrode que contenga 135 mM de NaCl, 5,4 mM de KCl, 1 mM de MgCl 2, 1,8 mM de CaCl2, 5 mM de glucosa y 10 mM de HEPES. Ajuste el pH a 7.4 con NaOH. Prepare la solución fresca de Tyrode el día del experimento.</li>
	<li>Preparar 50 ml de solución de pipeta intracelular que contenga 120 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 10 mM de EGTA y 10 mM de HEPES. Ajuste el pH a 7.2 con KOH. Alícuota la solución de pipeta intracelular en tubos estériles de 5 ml y almacénela a -20 °C. El día del experimento, agregue MgATP a la solución para lograr una concentración final de 3 mM.</li>
	<li>Preparar 1 ml de solución de carga de Fura-2 AM que contenga 2 μM de Fura-2 AM y 0,1% de Pluronic F-127. Prepare una solución de carga fresca el día del experimento y protéjala de la luz.</li>
</ol>2. Medición del movimiento de contracción hiPSC-CM
<ol><li>Prepare placas recubiertas de matriz de membrana basal agregando 100 μL de solución de recubrimiento de matriz extracelular a cada pocillo de placas de 96 pocillos. Incubar las placas de 96 pocillos en una incubadora de cultivo celular humidificado a 37 °C, 5% deCO2 durante la noche.</li>
	<li>Disociación enzimática de hiPSC-CMs<ol><li>Solicite hiPSCs al Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank (http://med.stanford.edu/scvibiobank.html). Generar hiPSC-CMs según las publicaciones anteriores 8,9. Observe los hiPSC-CM cultivados en placas de seis pocillos bajo un microscopio con un aumento de 10x. NOTA: No disocie las células cuando todavía son proliferativas. De lo contrario, las células crecerán demasiado en los pocillos después del rechapado y conducirán a resultados inexactos de los ensayos funcionales. Por lo general, los hiPSC-CM detienen la proliferación en los días 18-23.</li>
		<li>Asegúrese de que los hiPSC-CM laten con fuerza y tengan una pureza superior al 95%. Evaluar la pureza mediante inmunotinción contra troponina T cardíaca, un marcador específico de cardiomiocitos 8,9.</li>
		<li>Aspirar el medio de mantenimiento y lavar las células con 1x DPBS dos veces. Añadir 1 ml de solución de desprendimiento celular a cada pocillo de las placas de seis pocillos e incubar durante 10 min a 37 °C. NOTA: La duración de la incubación debe ser monitoreada regularmente. Asegúrese de no digerir demasiado las células, ya que reducirá la viabilidad celular.</li>
		<li>Pipete suavemente hiPSC-CMs hacia arriba y hacia abajo varias veces usando una pipeta de 5 ml para generar una suspensión de una sola celda. Agregue un volumen igual de medio de siembra hiPSC-CM para neutralizar la solución de desprendimiento celular.</li>
		<li>Centrifugar hiPSC-CMs a 300 x g durante 3 min a RT. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 1-2 mL de medio de siembra hiPSC-CM.</li>
		<li>Cuantificar la densidad celular y la viabilidad utilizando un método de exclusión de azul de tripano. Brevemente, mezcle 10 μL de suspensión celular con un volumen igual de azul de tripano, transfiéralo a un portaobjetos de conteo de células y luego cuente con un contador de celdas, como se describió anteriormente21.</li>
	</ol></li>
	<li>Siembra de hiPSC-CMs<ol><li>Retire la solución de recubrimiento de matriz extracelular de las placas de 96 pocillos.</li>
		<li>Sembrar 50.000 células por pocillo en 100 μL de medio de siembra hiPSC-CM y colocar las placas de 96 pocillos en una incubadora de cultivo celular humidificado a 37 °C, 5% deCO2 durante la noche.</li>
		<li>Reemplace el medio de siembra hiPSC-CM con 100 μL de medio de mantenimiento hiPSC-CM 1 día después del recubrimiento. Cambie el medio de mantenimiento hiPSC-CM cada 2 días hasta la grabación.</li>
	</ol></li>
	<li>Adquisición de datos<ol><li>Mida el movimiento de contracción de hiPSC-CM al menos 10 días después de la colocación (recomendado).</li>
		<li>Encienda el controlador de temperatura y ajuste 37 °C como temperatura preferida. Encienda el microscopio, la cámara y el suministro deCO2 .</li>
		<li>Llene la camisa de agua del soporte de la placa con una cantidad adecuada de agua desionizada estéril (Figura 2A). Coloque la placa de 96 pocillos en el soporte de la placa y permita que las celdas se aclimaten durante al menos 5 minutos.</li>
		<li>Abra el software de visualización, ajuste la velocidad de fotogramas de la cámara a 75 fotogramas por segundo (fps) y la resolución de vídeo/imagen a 1024 × 1024 píxeles. Aplique las funciones de enfoque automático y brillo automático. Grabe videos e imágenes de hiPSC-CMs. NOTA: Evite la vibración de la mesa del microscopio durante la grabación.</li>
		<li>Abra el software del analizador para el análisis automático.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Medición del potencial de campo hiPSC-CM
<ol><li>Preparación de placas recubiertas de matriz de membrana basal<ol><li>Coloque cuidadosamente una gota de 8 μL de solución de recubrimiento de matriz extracelular sobre el área del electrodo de registro de cada pocillo de las placas de matriz de microelectrodos (MEA) de 48 pocillos. Consulte la Figura 3A para conocer el área de electrodo adecuada para la colocación de gotas. Este paso es crítico para mantener la monocapa hiPSC-CM concentrada en los electrodos. Evite tocar los electrodos en cualquier circunstancia.</li>
		<li>Agregue 3 ml de agua desionizada estéril al área que rodea los pozos (Figura 3A) de las placas MEA de 48 pocillos para evitar la evaporación de la solución de recubrimiento. Incubar placas MEA de 48 pocillos en una incubadora de cultivo celular humidificado a 37 °C, 5% deCO2 durante 45-60 min. NOTA: No incubar durante demasiado tiempo para evitar que la matriz de la membrana basal se seque.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar la disociación enzimática de hiPSC-CMs como se describe en el paso 2.2.</li>
	<li>Siembra de hiPSC-CMs<ol><li>Retire la mayor parte del medio de la matriz extracelular de la superficie del pozo sin tocar los electrodos utilizando una punta de pipeta de 200 μL dentro de la misma fila o columna.</li>
		<li>Sembrar 50.000 células por pocillo en una gota de 8 μL de medio de siembra hiPSC-CM sobre el área del electrodo de registro de cada pocillo de la misma fila o columna.</li>
		<li>Repita los dos últimos pasos hasta que todos los pocillos hayan sido chapados con celdas. Verifique bajo el microscopio que todos los pozos tengan la suspensión hiPSC-CM. Para la densidad deseada, consulte la figura 3B. NOTA: La unión de hiPSC-CM se verá comprometida si la matriz de la membrana basal está completamente seca, lo que hace que la unión celular sea subóptima.</li>
		<li>Incubar las placas MEA de 48 pocillos en una incubadora de cultivo celular humidificado a 37 °C, 5% deCO2 durante 60 min.</li>
		<li>Agregue lenta y suavemente 150 μL de medio de siembra hiPSC-CM a cada pocillo de las placas MEA de 48 pocillos. Para añadir medio sin dispersar hiPSC-CM previamente sembrados, sostenga la placa en un ángulo de 45°, apoye la punta de la pipeta contra la pared de cada pocillo y suelte el medio lentamente. NOTA: Agregar medio demasiado rápido o con alta presión desalojará los cardiomiocitos adheridos. Evite el contacto directo con la suspensión de caída hiPSC-CM.</li>
		<li>Incubar las placas MEA de 48 pocillos en una incubadora de cultivo celular humidificado a 37 °C, 5% deCO2 durante la noche.</li>
		<li>Refresque el medio de siembra hiPSC-CM con 300 μL de medio de mantenimiento hiPSC-CM 1 día después del recubrimiento. Cambie el medio de mantenimiento hiPSC-CM cada 2 días antes de grabar.</li>
	</ol></li>
	<li>Adquisición de datos<ol><li>Realice la medición de MEA al menos 10 días después del recubrimiento (recomendado). En el día 10 después del recubrimiento, verifique la densidad de la monocapa hiPSC-CM de batido espontáneo bajo un microscopio con un aumento de 10x, que debe ser como se muestra en la Figura 3C.</li>
		<li>Coloque la placa MEA de 48 pocillos en el instrumento de grabación. La pantalla táctil permite observar el estado de temperatura (37 °C) y CO2 (5%).</li>
		<li>Abra el software del navegador. En la ventana de configuración experimental, seleccione Configuración cardíaca en tiempo real y Registros de potencial de campo. Aplicar configuraciones de batido espontáneas o de ritmo.</li>
		<li>En los parámetros de detección de latidos, establezca el umbral de detección en 300 μV, el período de latido mínimo en 250 ms y el período máximo de latido en 5 s. Seleccione Regresión polinómica para el cálculo de la duración potencial de campo (FPD).</li>
		<li>Compruebe si la señal de actividad eléctrica de referencia está madura y estable. NOTA: Las formas de onda maduras registradas por cada electrodo de la placa MEA de pocillos múltiples deben reflejar el potencial del campo cardíaco con características fácilmente identificables que coincidan con el pico de despolarización cardíaca y la fase de repolarización, como se muestra en la Figura 3D-F.</li>
		<li>Adquirir las actividades cardíacas basales durante 1-3 min. Si se necesita tratamiento farmacológico, agregue compuestos a los pocillos después del registro inicial. Coloque la placa en una incubadora durante al menos 30 minutos antes de la siguiente grabación.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Medición del potencial de acción de hiPSC-CM
<ol><li>Prepare platos recubiertos con matriz de membrana basal colocando 500 μL de solución de recubrimiento de matriz extracelular en la parte inferior de vidrio de platos de 35 mm (Figura 4A). Incubar los platos de 35 mm en una incubadora de cultivo celular humidificado a 37 °C, 5% deCO2 durante la noche.</li>
	<li>Realizar la disociación enzimática de hiPSC-CMs como se describe en el paso 2.2.</li>
	<li>Siembra de hiPSC-CMs<ol><li>Retire la solución de recubrimiento de matriz extracelular de las placas de 35 mm. Sembrar 50.000 células por pocillo en 500 μL de medio de siembra hiPSC-CM en la parte inferior de vidrio de platos de 35 mm.</li>
		<li>Incubar los platos de 35 mm en una incubadora de cultivo celular humidificado a 37 °C, 5% deCO2 durante la noche. Retire el medio de siembra hiPSC-CM y agregue 2 ml de medio de mantenimiento hiPSC-CM a los platos de 35 mm. NOTA: Se recomienda colocar una punta no filtrada de 200 μL sobre la pipeta de aspiración de 2 ml para eliminar el medio gastado y evitar tocar las células.</li>
		<li>Cambie el medio de cultivo hiPSC-CM cada 2 días antes de grabar.</li>
	</ol></li>
	<li>Adquisición de datos<ol><li>Realice la medición del potencial de acción al menos 10 días después del recubrimiento (recomendado). Prepare la solución fresca de Tyrode como se describe en el paso 1.4. Descongelar una alícuota de solución de pipeta intracelular y añadir MgATP a una concentración final de 3 mM.</li>
		<li>Extraiga las micropipetas de los capilares de vidrio de borosilicato utilizando un extractor de micropipetas. NOTA: Se prefiere una resistencia de 2-5 MΩ de las micropipetas.</li>
		<li>Reemplace el medio de mantenimiento hiPSC-CM con la solución de Tyrode y permita que las células se aclimaten a la solución de Tyrode durante 15 minutos (figura 4C). Inserte los sensores de temperatura en la cámara, coloque el plato de 35 mm en la cámara como se muestra en la Figura 4C y ajuste la temperatura a 37 °C (Figura 4D).</li>
		<li>Llene las micropipetas con solución intracelular e insértelas en el soporte conectado al cabezal del amplificador de abrazadera de conexión (Figura 4E). Abra el software de estimulación/adquisición, cargue el protocolo de grabación del potencial de acción y seleccione la configuración de pinza de voltaje.</li>
		<li>Inserte la micropipeta en la solución de baño, seleccione las hiPSC-CM individuales adecuadas y ajuste y baje la posición de la micropipeta junto a la célula seleccionada utilizando un micromanipulador. Cuando se inserte la punta de la pipeta en la solución de baño, compruebe la resistencia de la pipeta que se puede observar en el monitor del osciloscopio.</li>
		<li>Coloque la pipeta cerca de la celda y los pulsos de corriente disminuirán ligeramente para reflejar la creciente resistencia del sellado. Aplique una succión suave con presión negativa para aumentar la resistencia, que formará un gigasellado. Aplique la función Sellado .</li>
		<li>Aplique succión adicional para romper la membrana y obtener una configuración de grabación de celda completa. Una vez que la porción de membrana dentro del área de la pipeta se rompe por succión, la solución interna está en equilibrio con el citoplasma celular. En este punto, cambie del modo de abrazadera de voltaje (abrazadera en V) al modo de abrazadera de corriente o sin inyección de corriente (abrazadera C) utilizando el cuadro de diálogo del amplificador. Pulse el botón Grabar para generar y guardar los archivos de grabación de acción potencial. NOTA: El cambio de modo proporciona un registro continuo de los potenciales de acción espontánea de los hiPSC-CM a través de un protocolo de grabación sin disparador ni estimulación, que se puede monitorear en la salida V-mon del amplificador patch-clamp.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Medición del transitorio hiPSC-CM Ca2+
<ol><li>Consulte el protocolo anterior para preparar cámaras celulares personalizadas para imágenes de Ca2+ 21. Para la preparación de la cámara celular recubierta de matriz de la membrana basal, coloque 200 μL de solución de recubrimiento de matriz extracelular en las cámaras celulares. Incubar las cámaras celulares en una incubadora de cultivo celular humidificado a 37 °C, 5% deCO2 durante la noche.</li>
	<li>Realizar la disociación enzimática de hiPSC-CMs como se describe en el paso 2.2.</li>
	<li>Siembra de hiPSC-CMs<ol><li>Retire la solución de recubrimiento de matriz extracelular de las cámaras celulares. Sembrar 20.000 células por pocillo en 200 μL de medio de siembra hiPSC-CM.</li>
		<li>Reemplace el medio de siembra hiPSC-CM con 200 μL de medio de mantenimiento hiPSC-CM 1 día después del recubrimiento. Cambie el medio de mantenimiento hiPSC-CM cada 2 días antes de grabar.</li>
	</ol></li>
	<li>Adquisición de datos<ol><li>Realice la medición transitoria de Ca2+ al menos 10 días después del recubrimiento (recomendado). Prepare la solución fresca de Tyrode como se describe en el paso 1.4. Prepare una solución de carga Fura-2 AM fresca como se describe en el paso 1.6.</li>
		<li>Aspirar el medio de mantenimiento hiPSC-CM y lavar dos veces con la solución de Tyrode. Aplicar 100 μL de solución de carga Fura-2 AM e incubar durante 10 min a RT.</li>
		<li>Reemplace la solución de carga Fura-2 AM con la solución de Tyrode y espere al menos 5 minutos para la desesterificación completa de Fura-2 AM.</li>
		<li>Agregue una gota de aceite de inmersión en el objetivo 40x de un microscopio de epifluorescencia invertido equipado con un objetivo de inmersión en aceite 40x (0.95 NA). Coloque la cámara celular en el adaptador de etapa del microscopio (Figura 5A).</li>
		<li>Instale los cables del controlador de temperatura en la cámara de baño y configúrela a 37 °C. Instale los electrodos de estimulación del campo eléctrico y ajuste los pulsos a 0,5 Hz con una duración de 20 ms.</li>
		<li>Encienda la fuente de luz de conmutación de longitud de onda de ultra alta velocidad y configúrela en el modo de conmutación rápida de 340 nm y 380 nm de acuerdo con las instrucciones del instrumento.</li>
		<li>Aplique un tiempo de exposición de 20 ms para ambas longitudes de onda y un tiempo de grabación de 20 s en el software. Grabe el video reflejando los cambios en tiempo real de Ca2+ transitorio en hiPSC-CMs. Exporte los datos a una hoja de cálculo y analice los datos como se describió anteriormente23.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Li, W., Luo, X., Ulbricht, Y., Guan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blebbistatin+protects+iPSC-CMs+from+hypercontraction+and+facilitates+automated+patch-clamp+based+electrophysiological+study%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Blebbistatin protects iPSC-CMs from hypercontraction and facilitates automated patch-clamp based electrophysiological study.</a> Stem Cell Research. 56, 102565(2021).</li>
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</ol>

J.C.W. es cofundador de Greenstone Biosciences, pero no tiene intereses en competencia, ya que el trabajo presentado aquí es completamente independiente. Los otros autores declaran que no hay intereses en conflicto.

La tecnología iPSC humana se ha convertido en una plataforma poderosa para el modelado de enfermedades y la detección de medicamentos. Aquí, describimos un protocolo detallado para medir la contractilidad de hiPSC-CM, el potencial de campo, el potencial de acción y el transitorio Ca2+. Este protocolo proporciona una caracterización integral de la contractilidad y electrofisiología de hiPSC-CM. Estos ensayos funcionales han sido aplicados en múltiples publicaciones de nuestro grupo 12,13,18,24,25,26,27.<sup cla...

El desarrollo de fármacos es un proceso largo y costoso. Un estudio de nuevos medicamentos terapéuticos aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) entre 2009 y 2018 informó que el costo medio estimado de la investigación capitalizada y los ensayos clínicos fue de $ 985 millones por producto1. La cardiotoxicidad inducida por fármacos es la principal causa de desgaste y retirada del mercado2. En particular, la cardiotoxicidad es reportada entre múltiples clases de fármacos terapéuticos3. Por lo tanto, la evaluación de la seguridad cardíaca es un componente crucial durante el proceso de desarrollo del fármaco. El paradigma actual para la evaluación de la seguridad cardíaca sigue dependiendo en gran medida de los modelos animales. Sin embargo, las diferencias de especies con respecto al uso de modelos animales son cada vez más reconocidas como una causa primaria de predicciones inexactas para la cardiotoxicidad inducida por fármacos en pacientes humanos4. Por ejemplo, la morfología del potencial de acción cardíaca difiere sustancialmente entre humanos y ratones debido a las contribuciones de diferentes corrientes de repolarización5. Además, las isoformas diferenciales de miosina cardíaca y ARN circulares que pueden afectar la fisiología cardíaca han sido bien documentadas entre las especies 6,7. Para cerrar estas brechas, es imperativo establecer un modelo confiable, eficiente y basado en humanos para la evaluación preclínica de la seguridad cardíaca.
La innovadora invención de la tecnología de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) ha generado plataformas sin precedentes de detección de fármacos y modelado de enfermedades. Durante la última década, los métodos para generar cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos (hiPSC-CM) sehan establecido bien 8,9. Los hiPSC-CM han atraído un gran interés en sus aplicaciones potenciales en el modelado de enfermedades, la detección de cardiotoxicidad inducida por fármacos y la medicina de precisión. Por ejemplo, los hiPSC-CM se han utilizado para modelar los fenotipos patológicos de las enfermedades cardíacas causadas por la herencia genética, como el síndrome de QT largo10, la miocardiopatía hipertrófica 11,12 y la miocardiopatía dilatada13,14,15. En consecuencia, se han identificado vías de señalización clave implicadas en la patogénesis de las enfermedades cardíacas, que pueden arrojar luz sobre posibles estrategias terapéuticas para un tratamiento efectivo. Además, los hiPSC-CM se han utilizado para detectar cardiotoxicidad inducida por fármacos asociada con agentes anticancerosos, incluyendo doxorrubicina, trastuzumab e inhibidores de la tirosina cinasa16,17,18; Se están investigando estrategias para mitigar la cardiotoxicidad resultante. Finalmente, la información genética retenida en los hiPSC-CMs permite el tamizaje y la predicción de la cardiotoxicidad inducida por fármacos tanto a nivel individual como poblacional19,20. En conjunto, los hiPSC-CM han demostrado ser una herramienta invaluable para la predicción personalizada de la seguridad cardíaca.
El objetivo general de este protocolo es establecer metodologías para investigar de manera integral y eficiente las características funcionales de las hiPSC-CM, que son de gran importancia en la aplicación de hiPSC-CM hacia el modelado de enfermedades, la detección de cardiotoxicidad inducida por medicamentos y la medicina de precisión. Aquí, detallamos una serie de ensayos funcionales para evaluar las propiedades funcionales de los hiPSC-CM, incluida la medición de la contractilidad, el potencial de campo, el potencial de acción y el manejo del calcio (Ca2+) (Figura 1).

<table><tbody><tr><td>Plato con fondo de vidrio de 35 mm con micropocillo de 20 mm #1.5 cubreobjetos</td><td>Cellvis</td><td>D35-20-1.5-N</td><td>Pinza de parche</td></tr><tr><td>50x B27 suplementos</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>hiPSC-CM medio</td></tr><tr><td>de cultivo placa de cultivo de 6 pocillos</td><td>E & K Scientific</td><td>EK-27160</td><td>hiPSC-CM Cultivo</td></tr><tr><td>de 96 pocillos, fondo transparente, poliestireno negro, microplacas tratadas con TC</td><td>Corning</td><td>3603</td><td>Medición del movimiento de contracción</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964</td><td>Disociación enzimática</td></tr><tr><td>Axion's Integrated Studio (AxIS)</td><td>Software de navegación</td>de <td>Axion Biosystems</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidrio de borosilicato</td><td>Aparato Harvard</td><td>BF 100-50-10,Abrazadera</td> de <td>parche</td></tr><tr><td>CaCl2 1 M en H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21115</td><td>Tyrode' s solución</td></tr><tr><td>Portaobjetos de cámara de recuento de células</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10228</td><td>Recuento</td></tr><tr><td>de células CytoView Placas MEA de 48 pocillos</td><td>Axion Biosystems</td><td>M768-tMEA-48B</td><td>MEA</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>12634028</td><td>Medio de matriz extracelular</td></tr><tr><td>DPBS, sin calcio, sin magnesio</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-190-250</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td>Solución de pipeta intracelular</td></tr><tr><td>EPC 10 USB&nbsp; amplificador de pinza de parche</td><td>Warner Instruments</td><td>89-5000</td><td>pinza de parche</td></tr><tr><td>Fura-2, AM, permeant de célula</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F1221</td><td>Ca2+ medición de transitorios</td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>Tyrode' s solución</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Tyrode' s solución</td></tr><tr><td>hiPSCs</td><td>Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>529552</td><td>Tyrode' s solution KnockOut</td></tr><tr><td>Serum Replacement</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10828-028</td><td>hiPSC-CM medio de siembra</td></tr><tr><td>KOH 8&nbsp; M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4494</td><td>Solución de pipeta intracelular</td></tr><tr><td>Lambda DG 4</td><td>Sutter Instrument Company</td><td></td><td>Ca2+ medición transitoria; fuente de luz de conmutación de longitud de onda de ultra alta velocidad</td></tr><tr><td>Luna-FL contador de células de fluorescencia automatizado</td><td>WISBIOMED</td><td>LB-L20001</td><td>Recuento de células</td></tr><tr><td>Maestro Pro&nbsp; Sistema MEA</td><td>Axion Biosystems</td><td></td><td>MEA</td></tr><tr><td>Matrigel Factor de crecimiento reducido (GFR) Matriz de membrana basal</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Medio de matriz extracelular</td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td>Solución de pipeta intracelular</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>Tyrode' s solución</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>Tyrode' s solución</td></tr><tr><td>NaOH 10&nbsp; M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72068</td><td>Tyrode' s solución</td></tr><tr><td>NIS Elements AR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 (solución al 20% en DMSO)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3000MP</td><td>Ca2+ medición transitoria</td></tr><tr><td>Medio RPMI 1640 Life</td><td>Technologies</td><td>11875-119</td><td>hiPSC-CM</td></tr><tr><td>medio de cultivo Sony SI8000 Cell Motion Imaging System</td><td>Sony Biotechnology</td><td></td><td>Contraction motion measurement</td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas Sutter</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td>Pinza de parche</td></tr><tr><td>Tinción azul de tripano</td><td>Life Technologies</td><td>T10282</td><td>Recuento de células</td></tr></tbody></table>

aplicaciones técnicas de la matriz de microelectrodos y los registros de pinza de parche en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos

Technical Applications of Microelectrode Array and Patch Clamp Recordings on Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

La cardiotoxicidad inducida por fármacos es la principal causa de desgaste y retirada del mercado. Por lo tanto, el uso de modelos preclínicos apropiados de evaluación de seguridad cardíaca es un paso crítico durante el desarrollo de fármacos. Actualmente, la evaluación de la seguridad cardíaca sigue dependiendo en gran medida de los estudios en animales. Sin embargo, los modelos animales están plagados de poca especificidad traslacional para los humanos debido a las diferencias específicas de la especie, particularmente en términos de características electrofisiológicas cardíacas. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar un modelo confiable, eficiente y basado en humanos para la evaluación preclínica de la seguridad cardíaca. Los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos (hiPSC-CM) se han convertido en un modelo in vitro invaluable para la detección de cardiotoxicidad inducida por fármacos y el modelado de enfermedades. Los hiPSC-CM se pueden obtener de individuos con diversos antecedentes genéticos y diversas afecciones enfermas, lo que los convierte en un sustituto ideal para evaluar individualmente la cardiotoxicidad inducida por fármacos. Por lo tanto, es necesario establecer metodologías para investigar exhaustivamente las características funcionales de las hiPSC-CM. En este protocolo, detallamos varios ensayos funcionales que pueden evaluarse en hiPSC-CM, incluida la medición de contractilidad, potencial de campo, potencial de acción y manejo de calcio. En general, la incorporación de hiPSC-CM en la evaluación preclínica de la seguridad cardíaca tiene el potencial de revolucionar el desarrollo de fármacos.

Este protocolo describe cómo medir el movimiento de contracción, el potencial de campo, el potencial de acción y el transitorio Ca2+ de hiPSC-CM. En la Figura 1 se muestra un diagrama esquemático que incluye la digestión enzimática, la siembra celular, el mantenimiento y la conducción funcional del ensayo. La formación de la monocapa hiPSC-CM es necesaria para la medición del movimiento de contracción (Figura 2B). Un rastro representativo del movimien...

Los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos (hiPSC-CM) se han convertido en un modelo in vitro prometedor para la detección de cardiotoxicidad inducida por fármacos y el modelado de enfermedades. Aquí, detallamos un protocolo para medir la contractilidad y electrofisiología de hiPSC-CMs.

Aplicaciones técnicas de la matriz de microelectrodos y los registros de pinza de parche en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos

Drug-induced cardiotoxicity is the leading cause of drug attrition and withdrawal from the market. Therefore, using appropriate preclinical cardiac safety ...

La evaluación de la seguridad cardíaca es un componente crucial durante el proceso de desarrollo del fármaco. Los cardiomiocitos derivados de iPSC humanos han demostrado ser un modelo confiable, eficiente y basado en humanos para la evaluación preclínica de la seguridad cardíaca. Hemos establecido metodologías para investigar exhaustivamente las características funcionales de los cardiomiocitos humanos derivados de iPSC, que son de modelado de enfermedades realmente importantes, detección de toxicidad cardiovascular inducida por fármacos y medicina de precisión.La creciente incorporación de cardiomiocitos humanos derivados de iPSC en el proceso estándar de evaluaciones de seguridad preclínicas tiene el potencial de mejorar la precisión de la predicción de toxicidad de los compuestos de un candidato. Comience cultivando los cardiomiocitos humanos derivados de iPSC durante al menos 10 días antes de tomar la medición. Encienda el controlador de temperatura y configúrelo a 37 grados centígrados.Encienda el microscopio, la cámara y el suministro de dióxido de carbono. Llene la camisa de agua del soporte de la placa con una cantidad adecuada de agua desionizada estéril. Coloque la placa de 96 pocillos en el soporte de la placa e incube las células durante al menos cinco minutos.Abra el software de visualización y, a continuación, ajuste la velocidad de fotogramas de la cámara a 75 fotogramas por segundo y la resolución de vídeo o imagen a 1024 x 1024 píxeles. Aplique las funciones de enfoque automático y brillo automático, grabe videos e imágenes de cardiomiocitos humanos derivados de iPSC. Coloque cuidadosamente una gota de ocho microlitros de solución de recubrimiento de matriz extracelular sobre el área del electrodo de registro de cada pocillo de las placas de matriz de microelectrodos de 48 pocillos.Luego agregue tres mililitros de agua desionizada estéril al área que rodea los pozos para evitar la evaporación de la solución de recubrimiento. Con una punta de pipeta de 200 microlitros, retire la mayor parte del medio de matriz extracelular de la superficie del pozo dentro de la misma fila o columna sin tocar los electrodos. Semilla 50, 000 células por pocillo en una gota de ocho microlitros de medio de siembra sobre el área del electrodo de registro.Repita hasta que todos los pocillos hayan sido chapados con células. Luego incube las placas de matriz de microelectrodos en una incubadora de cultivo celular humidificada. Agregue lentamente 150 microlitros de medio de siembra a cada pocillo de las placas de matriz de microelectrodos.En el día 10 después del recubrimiento, verifique la densidad de la monocapa humana iPSC CM de batido espontáneo bajo un microscopio. Coloque la placa de matriz de microelectrodos de 48 pocillos en el instrumento de grabación. Asegúrese de que la temperatura sea de 37 grados centígrados y que el dióxido de carbono sea del 5%Abra el software del navegador.En la ventana de configuración experimental, seleccione la configuración cardíaca en tiempo real y los registros de potencial de campo. Aplicar configuraciones de batido espontáneas o pegadas. En los parámetros de detección de latidos, establezca el umbral de detección en 300 microvoltios, el período de batido mínimo en 250 milisegundos y el período máximo de latido en cinco segundos.Seleccione la regresión polinómica para el cálculo de la duración del potencial de campo. Compruebe si la señal de actividad eléctrica basal está madura y estable, y adquiera las actividades cardíacas basales durante uno a tres minutos. Realizar la grabación 10 días después del chapado.Reemplace el medio de mantenimiento iPSC CM humano con la solución de tyrode y permita que las células se aclimaten durante 15 minutos. Inserte los sensores de temperatura en la cámara y coloque el plato de 35 milímetros dentro. Ajuste la temperatura a 37 grados centígrados.Extraiga las micropipetas de los capilares de vidrio de borosilicato utilizando un extractor de micropipetas. Llene las micropipetas con la solución intracelular e insértelas en el soporte conectado a la etapa de cabeza del amplificador de abrazadera de parche. Abra el software de adquisición, cargue el protocolo de grabación de potencial de acción y seleccione la configuración de abrazadera de voltaje.Inserte la micropipeta en la solución de baño y seleccione los CM iPSC humanos individuales apropiados. Ajuste y baje la posición de la micropipeta junto a la celda seleccionada utilizando un micromanipulador. Cuando se inserte la punta de la pipeta en la solución de baño, compruebe la resistencia de la pipeta en el monitor del osciloscopio.Coloque la pipeta cerca de la celda y los pulsos de corriente disminuirán ligeramente para reflejar la creciente resistencia del sellado. Aplique una succión suave con presión negativa para aumentar la resistencia. Esto formará un gigaseal.A continuación, aplique la función de sello. Aplique succión adicional para romper la membrana para obtener una configuración de registro de células completas. En este punto, cambie del modo de abrazadera de voltaje al modo de abrazadera de corriente, o sin inyección de corriente usando el diálogo del amplificador.Presione el botón de grabación para generar y guardar los archivos de grabación potenciales de acción. Realice la medición transitoria de calcio al menos 10 días después del recubrimiento. Prepare la solución fresca de Tyrode y la solución de carga Fura-2 AM.Aspirar el medio de mantenimiento iPSC CM humano y lavar las cámaras con la solución de Tyrode dos veces. Aplique 100 microlitros de solución de carga Fura-2 AM e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente. Reemplace la solución de carga Fura-2 AM con la solución de Tyrode e incube durante al menos cinco minutos para la desesterificación completa de Fura-2 AM. Agregue una gota de aceite de inmersión en el objetivo de inmersión en aceite 40x de un microscopio de epifluorescencia invertida.Coloque la cámara celular en el adaptador de etapa del microscopio. Instale los cables del controlador de temperatura en la cámara de baño y configúrela a 37 grados centígrados. Instale los electrodos de estimulación del campo eléctrico y ajuste los pulsos a 0,5 hercios con una duración de 20 milisegundos.Encienda la fuente de luz de conmutación de longitud de onda de ultra alta velocidad y configúrela en modo de conmutación rápida de 340 nanómetros y 380 nanómetros. Aplique un tiempo de exposición de 20 milisegundos para ambas longitudes de onda y un tiempo de grabación de 20 segundos. Grabe el video que refleja los cambios en tiempo real del calcio transitorio, exporte los datos a una hoja de cálculo para su análisis.Se utilizaron cardiomiocitos monocapa derivados de iPSC humana para la medición del movimiento de contracción. El análisis de un rastro del movimiento de relajación de la contracción utilizando el software analizador detectó el inicio de las contracciones, el pico de contracción, el final de la contracción, el pico de relajación y el final de la relajación. Se observó una cobertura completa de la monocapa de cardiomiocitos derivados de iPSC humana en todos los electrodos dentro de las placas de matriz de microelectrodos.Las formas de onda maduras registradas por cada electrodo reflejaban el potencial del campo cardíaco con características identificables. Después del análisis, se obtuvieron el período de latido, la duración del potencial de campo y la amplitud del pico. Los registros de pinza de parche de células enteras en el modo de pinzamiento actual registraron los potenciales de acción espontánea de cardiomiocitos individuales.Después del análisis, se obtuvieron varios parámetros, incluyendo la amplitud, el potencial diastólico máximo y la duración del potencial de acción. Después del análisis de las imágenes de calcio, se obtuvo la relación F340 por F380 a lo largo del tiempo, y se trazaron trazas crudas de transitorios de calcio estimulados. Además, se obtuvieron parámetros como amplitud, calcio diastólico y desintegración cálcica tau.Es importante utilizar los cardiomiocitos humanos derivados de iPSC que se encuentran en buenas condiciones de latido, así como para garantizar la alta pureza de los cardiomiocitos humanos derivados de iPSC. Este protocolo incluye cuatro técnicas específicas para estudiar la funcionalidad de los cardiomiocitos derivados de iPSC humanas, otra configuración o automática, si se deben estudiar las corrientes iónicas cardíacas que desempeñan un papel crucial en el

technical-applications-microelectrode-array-patch-clamp-recordings-on

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

La caracterización electrofisiológica de los cardiomiocitos derivados de las células madre pluripotentes humanas (hPSC-CMs) es crucial para el modelado de la enfermedad cardiaca y para la determinación de las respuestas de los fármacos. Este protocolo proporciona la información necesaria para disociar y planificar hPSC-CM en arrays de múltiples electrodos, medir su potencial de campo, y un método para analizar intervalos QT y RR.

Análisis Electrofisiológico de Cardiomiocitos Pluripotentes Humanos Pluripotentes (hPSC-CMs) Usando Matrices Multi-Electrodo (MEAs)

Aquí presentamos un método de imagen ópticamente potenciales de la acción, específicamente en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas como ventricular. El método se basa en la expresión de una proteína fluorescente sensible al voltaje impulsado por el promotor.

Potencial de acción óptica específica de subtipo grabaciones en humanos inducida por cardiomiocitos ventriculares derivadas de células madre pluripotentes

Este artículo contiene un conjunto de protocolos para el desarrollo de redes de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por el hombre (hiPSC-CM) cultivadas en placas MEA multipocillos para electroportar la membrana celular de forma reversible para mediciones potenciales de acción. Las grabaciones de alto rendimiento se obtienen de los mismos sitios de celda repetidamente durante días.

Redes de cardiomiocitos derivados de iPSC humanos en matrices de microelectrodos multipolos para grabaciones potenciales de acción recurrente

Aquí describimos la adquisición óptica y la caracterización de potenciales de acción de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas utilizando un sistema de fotometría modular de alta velocidad.

Medición del potencial de acción óptica unicelular en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos

El análisis de los cambios en la función contráctil y la integridad celular de los cardiomiocitos humanos derivados de iPSC es de inmensa importancia para el desarrollo de fármacos no clínicos. Un sistema híbrido de análisis celular de 96 pocillos aborda ambos parámetros en tiempo real y de manera fisiológica para obtener resultados confiables y relevantes para el ser humano, necesarios para una transición segura a las etapas clínicas.

Sistema de análisis de células híbridas para evaluar cambios estructurales y contráctiles de cardiomiocitos humanos derivados de iPSC para la evaluación preclínica del riesgo cardíaco

La combinación de poración láser y matrices de microelectrodos (MEA) permite registros similares al potencial de acción de cardiomiocitos primarios y derivados de células madre cultivados. La forma de onda proporciona una visión superior del modo de acción de los compuestos de prueba que las grabaciones estándar. Vincula patch-clamp y lectura MEA para optimizar aún más la investigación de seguridad cardiovascular en el futuro.

Mediciones similares a un potencial de acción inducida por láser de cardiomiocitos en matrices de microelectrodos para una mayor predictividad de la farmacología de seguridad

Aquí, demostramos un método no invasivo de evaluación de contractilidad de dispositivos médicos cardíacos utilizando monocapas 2D de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC-CM), chapadas en un sustrato flexible, junto con microscopía basada en video. Esta herramienta será útil para la evaluación in vitro de las propiedades contráctiles de los dispositivos de electrofisiología cardíaca.

Evaluación de la terapia de modulación de la contractilidad cardíaca en cardiomiocitos derivados de células madre humanas 2D

Aquí, se describe un método establecido para realizar mediciones de contractilidad y calcio en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas utilizando una plataforma basada en óptica. Esta plataforma permite a los investigadores estudiar el efecto de las mutaciones y la respuesta a diversos estímulos de forma rápida y reproducible.

Mediciones en tiempo real de parámetros de calcio y contractilidad en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas

Para desentrañar los mecanismos moleculares que subyacen a la próstata primeros sistemas innovadores modelos humanos y enfoques cáncer de iniciación, la novela y se necesitan desesperadamente. El potencial de pre-prostática seno urogenital mesénquima (UGSM) para inducir a las poblaciones de células madre pluripotentes para formar el epitelio de próstata humano es una poderosa herramienta experimental en la investigación de próstata.

La formación del epitelio prostático humano utilizando tejido recombinación de roedores Urogenital mesénquima seno y células madre humanas

Los conocimientos actuales sobre las bases celulares de las enfermedades cardiacas se basa principalmente en estudios sobre modelos animales. Aquí describimos y validar un nuevo método para obtener cardiomiocitos viables individuales de pequeñas muestras quirúrgicas de miocardio ventricular humano. Miocitos ventriculares humanos pueden ser utilizados para estudios electrofisiológicos y las pruebas de drogas.

Aislamiento y caracterización funcional de Human ventricular cardiomiocitos a partir de muestras quirúrgicas recientes

Aprenda a evaluar la contractilidad y electrofisiología de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC-CM) para la seguridad cardíaca en desarrollo de fármacos.

Aplicaciones técnicas de la matriz de microelectrodos y los registros de pinza de parche en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos (Video) | JoVE Journal

Aplicaciones técnicas de la matriz de microelectrodos y los registros de pinza de parche en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos

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