Name: Edición eficiente del genoma de ratones mediante electroporación CRISPR de cigotos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-16T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Aprende la técnica CRISPR-EZ para editar el genoma de ratones mediante electroporación de cigotos con eficiencia cercana al 100%. Este método facilita la creación de modelos animales para investigación genética y estudios de desarrollo embrionario temprano.

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A.J.M. creó el concepto original que condujo al desarrollo de CRISPR-EZ y produjo las figuras. C.K.D. compiló y adaptó los protocolos internos y publicados para este manuscrito actual. A.J.M. es compatible con NIH (R00HD096108).

<ol><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+determinants+of+improved+CRISPR+sgRNA+design%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design.</a> Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).</li>
<li>Lin, S., Staahl, B., Alla, R. K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+homology-directed+human+genome+engineering+by+controlled+timing+of+CRISPR%2FCas9+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery.</a> eLife. 3, 04766(2014).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+CRISPR%2FHDR-mediated+knock-in+for+mouse+embryonic+stem+cells+and+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes.</a> Biotechniques. 59 (4), 201-208 (2015).</li>
<li>Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+genetically+modified+mice+using+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Nature Protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).</li>
<li>Fujii, W., Onuma, A., Sugiura, K., Naito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+phenotype-expressing+triple-knockout+mice+with+heritable+mutated+alleles+by+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">One-step generation of phenotype-expressing triple-knockout mice with heritable mutated alleles by the CRISPR/Cas9 system.</a> Journal of Reproduction and Development. 60 (4), 324-327 (2014).</li>
<li>Kaneko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+genome+editing+of+rodent+intact+embryos+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation.</a> PLoS One. 10 (11), 0142755(2015).</li>
<li>Mehravar, M., Shirazi, A., Nazari, M., Banan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaicism+in+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mosaicism in CRISPR/Cas9-mediated genome editing.</a> Developmental Biology. 445 (2), 156-162 (2019).</li>
<li>Modzelewski, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+mouse+genome+engineering+by+CRISPR-EZ+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology.</a> Nature Protocols. 13 (6), 1253-1274 (2018).</li>
<li>Gurumurthy, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+CRISPR-based+germline-genome-engineered+mice+without+ex+vivo+handling+of+zygotes+by+i-GONAD%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Creation of CRISPR-based germline-genome-engineered mice without ex vivo handling of zygotes by i-GONAD.</a> Nature Protocols. 14 (8), 2452-2482 (2019).</li>
<li>Hur, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+in+mice+by+electroporation+of+Cpf1+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins.</a> Nature Biotechnology. 34 (8), 807-808 (2016).</li>
<li>Tröder, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+electroporation+approach+for+efficient+CRISPR%2FCas9+genome+editing+in+murine+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An optimized electroporation approach for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in murine zygotes.</a> PLoS One. 13 (5), 0196891(2018).</li>
<li>Qin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+CRISPR%2Fcas9-mediated+genome+editing+in+mice+by+zygote+electroporation+of+nuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Efficient CRISPR/cas9-mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease.</a> Genetics. 200 (2), 423-430 (2015).</li>
<li>Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+Cas9+protein%2FsgRNA+into+early+pronuclear+zygotes+generates+non-mosaic+mutants+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse.</a> Developmental Biology. 418 (1), 1-9 (2016).</li>
<li>Teixeira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+mice+zygotes+with+dual+guide+RNA%2FCas9+complexes+for+simple+and+efficient+cloning-free+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing.</a> Scientific Reports. 8, 474(2018).</li>
<li>Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. -F., Modzelewski, A. J., He, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+mouse+genome+editing+by+CRISPR+ribonucleoprotein+electroporation+of+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+Cas9+protein+into+mouse+zygotes+through+a+series+of+electroporation+dramatically+increased+the+efficiency+of+model+creation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increased the efficiency of model creation.</a> Journal of Genetics and Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).</li>
<li>Mizuno, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-embryo+gene+cassette+knockin+by+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing+with+adeno-associated+viral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/Cas9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector.</a> iScience. 9, 286-297 (2018).</li>
<li>Remy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+gene-edited+rats+by+delivery+of+CRISPR%2FCas9+protein+and+donor+DNA+into+intact+zygotes+using+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of gene-edited rats by delivery of CRISPR/Cas9 protein and donor DNA into intact zygotes using electroporation.</a> Scientific Reports. 7, 16554(2017).</li>
<li>Tanihara, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+PDX-1+mutant+porcine+blastocysts+by+introducing+CRISPR%2FCas9-system+into+porcine+zygotes+via+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Science+Journal%22%5BJournal%5D)">Generation of PDX-1 mutant porcine blastocysts by introducing CRISPR/Cas9-system into porcine zygotes via electroporation.</a> Animal Science Journal. 90 (1), 55-61 (2019).</li>
<li>Zhou, X., Guo, H., Chen, K., Cheng, H., Zhou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+chromosomal+mapping+and+conserved+synteny+of+porcine+Argonaute+family+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetica%22%5BJournal%5D)">Identification, chromosomal mapping and conserved synteny of porcine Argonaute family of genes.</a> Genetica. 138 (7), 805-812 (2010).</li>
<li>Nishio, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+voltage+strength+during+electroporation+on+the+development+and+quality+of+in+vitro-produced+porcine+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction+in+Domestic+Animals%22%5BJournal%5D)">Effects of voltage strength during electroporation on the development and quality of in vitro-produced porcine embryos.</a> Reproduction in Domestic Animals. 53 (2), 313-318 (2018).</li>
<li>Camargo, L. S. A., Owen, J. R., van Eenennaam, A. L., Ross, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+one-step+knockout+by+electroporation+of+ribonucleoproteins+into+zona-intact+bovine+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Efficient one-step knockout by electroporation of ribonucleoproteins into zona-intact bovine embryos.</a> Frontiers in Genetics. 11, 570069(2020).</li>
<li>Escoffre, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+%28still+not%29+known+of+the+mechanism+by+which+electroporation+mediates+gene+transfer+and+expression+in+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">What is (still not) known of the mechanism by which electroporation mediates gene transfer and expression in cells and tissues.</a> Molecular Biotechnology. 41 (3), 286-295 (2009).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-READI%3A+Efficient+generation+of+knockin+mice+by+CRISPR+RNP+electroporation+and+AAV+donor+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">CRISPR-READI: Efficient generation of knockin mice by CRISPR RNP electroporation and AAV donor infection.</a> Cell Reports. 27 (13), 3780-3789 (2019).</li>
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<li>Modzelewski, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse-specific+retrotransposon+drives+a+conserved+Cdk2ap1+isoform+essential+for+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A mouse-specific retrotransposon drives a conserved Cdk2ap1 isoform essential for development.</a> Cell. 184 (22), 5541-5558 (2021).</li>
<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+determinants+of+improved+CRISPR+sgRNA+design%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design.</a> Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).</li>
<li>Sanson, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+libraries+for+CRISPR-Cas9+genetic+screens+with+multiple+modalities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities.</a> Nature Communications. 9 (1), 5416(2018).</li>
<li>Okamoto, S., Amaishi, Y., Maki, I., Enoki, T., Mineno, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+genome+editing+for+single-base+substitutions+using+optimized+ssODNs+with+Cas9-RNPs%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs.</a> Scientific Reports. 9, 14811(2019).</li>
<li>Duselis, A. R., Vrana, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrieval+of+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Retrieval of mouse oocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (3), e185(2007).</li>
<li>Takahashi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GONAD%3A+Genome-editing+via+oviductal+nucleic+acids+delivery+system%3A+A+novel+microinjection+independent+genome+engineering+method+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">GONAD: Genome-editing via oviductal nucleic acids delivery system: A novel microinjection independent genome engineering method in mice.</a> Scientific Reports. 5, 11406(2015).</li>
<li>Tu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoting+Cas9+degradation+reduces+mosaic+mutations+in+non-human+primate+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Promoting Cas9 degradation reduces mosaic mutations in non-human primate embryos.</a> Scientific Reports. 7, 42081(2017).</li>
<li>Aida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning-free+CRISPR%2FCas+system+facilitates+functional+cassette+knock-in+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice.</a> Genome Biology. 16 (1), 87(2015).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+exon-intron+architecture+variation+of+genes+in+eukaryotic+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Patterns of exon-intron architecture variation of genes in eukaryotic genomes.</a> BMC Genomics. 10, 47(2009).</li>
<li>Quadros, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easi-CRISPR%3A+a+robust+method+for+one-step+generation+of+mice+carrying+conditional+and+insertion+alleles+using+long+ssDNA+donors+and+CRISPR+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins.</a> Genome Biology. 18, 92(2017).</li>
<li>Gurumurthy, C. B., Saunders, T. L., Ohtsuka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+and+generating+a+mouse+model%3A+frequently+asked+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Research%22%5BJournal%5D)">Designing and generating a mouse model: frequently asked questions.</a> Journal of Biomedical Research. 35 (2), 76-90 (2021).</li>
<li>Nakajima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exome+sequencing+in+the+knockin+mice+generated+using+the+CRISPR%2F+Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Exome sequencing in the knockin mice generated using the CRISPR/ Cas system.</a> Scientific Reports. 6, 34703(2016).</li>
<li>Iyer, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-target+mutations+are+rare+in+Cas9-modified+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice.</a> Nature Methods. 12 (6), 479(2015).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153 (4), 910-918 (2013).</li>
</ol>

No hay declaraciones financieras pertinentes de los autores.

Aquí se presenta una tecnología de edición del genoma del ratón sencilla y altamente eficiente. La electroporación se puede utilizar para generar embriones modificados en 1-2 semanas (Figura 1) y puede producir ratones editados dentro de las 6 semanas9. En comparación con los protocolos basados en electroporación desarrollados contemporáneamente que entregan RNP 7,10,11,12,13,14,15,17,32, el método descrito aquí es conceptualmente similar y ofrece eficiencias en el mi...

La edición del genoma en ratones vivos se ha simplificado considerablemente y se ha vuelto accesible y más asequible desde la aparición de la edición CRISPR 1,2,3. Los intentos iniciales de edición en animales utilizaron microinyección para administrar ARNm/sgRNA de CRISPR Cas9 en embriones en estadio pronuclear 4,5,6. Si bien la microinyección es bastante efectiva, la cantidad de práctica requerida para dominarla completamente podría no ser apropiada para aprendices y estudiantes y también requiere equipos costosos que un laboratorio modestamente financiado no puede pagar. La microinyección normalmente es realizada por técnicos expertos en instalaciones transgénicas con horarios y precios de servicio que limitan la velocidad para muchos investigadores. Un enfoque más accesible es el de la electroporación, que ha demostrado ser bastante eficaz para la entrega de ARNm/sgRNA de CRISPR Cas9 en embriones en estadio pronuclear7. Otras mejoras en las estrategias de edición y entrega del genoma CRISPR sugirieron que las RNP preensambladas que ya están comprometidas con sgRNAs pueden ser un medio eficaz para reducir el mosaicismo8.
La razón detrás del desarrollo y uso de este protocolo fue evitar muchas de las limitaciones y obstáculos asociados con la microinyección. Como su nombre lo indica, un método fácil, interno y rentable que pudiera determinar rápidamente si valdría la pena usar diseños de sgRNA no probados durante un experimento de microinyección sería un paso de control de calidad de primer paso muy conveniente (Figura 1). Si bien este método no puede reemplazar la microinyección para estrategias más complejas, como la introducción de secuencias largas de ADN del donante para resultados basados en la recombinación, es ideal para estrategias menos complejas como pequeñas deleciones o inserciones y etiquetado de genes. Este método es apropiado para investigadores con habilidades básicas de manipulación de embriones que tienen necesidades de edición simples, les gustaría probar su hipótesis dentro del marco de tiempo del desarrollo preimplantacional, o prefieren probar sgRNAs en embriones antes de programar una cita con un especialista en microinyección. Aquí, los reactivos de edición se administran transitoriamente en embriones en etapa pronuclear como RNP Cas9 / sgRNA a través de electroporación (una serie de pulsos eléctricos) para maximizar la eficiencia y disminuir el mosaicismo8. Utilizando un método de genotipado de embriones, los resultados de edición están disponibles en aproximadamente 1 semana9, lo que reduce la necesidad de varias aplicaciones de microinyección a un costo significativamente reducido.
La efectividad de este método alcanza su punto máximo en la etapa embrionaria pronuclear, cuando el embrión aún no ha fusionado los pronúcleos materno y paterno o no ha entrado en fase S (Figura 2). La superovulación se utiliza para maximizar el número de cigotos, pero produce cigotos pronucleares y óvulos no fertilizados. Los cigotos sanos también se pueden preseleccionar antes de la electroporación para aumentar la eficiencia general. Como otros protocolos de electroporación han editado eficientemente cigotos sin necesidad de incluir un paso similar 7,10,11,12,13,14,15, un paso opcional de este protocolo es la ligera erosión de la zona pelúcida (ZP). La ZP es una capa de glicoproteína que ayuda a la unión de los espermatozoides, la respuesta acrosómica y la fertilización que rodea a los embriones en etapa pronuclear. En nuestra experiencia, encontramos que una suave erosión a base de ácido de la ZP proporciona una entrega confiable de electroporación Cas9 RNP con solo un impacto marginal en la viabilidad.
Hemos observado tasas de entrega de RNP de hasta 100% de eficiencia a través de electroporación en cepas de ratón que se utilizan comúnmente en investigaciones como C57BL / 6J y C57BL / 6N 9,16. Grupos independientes también han desarrollado procedimientos basados en electroporación con eficiencias mayores o equivalentes a la microinyección 11,12,13,14,15,17, con protocolos de electroporación que funcionan bien en rata18,19, cerdo 20,21,22 y vaca 23 , por lo que sugerimos que los lectores comparen los protocolos para encontrar las condiciones que mejor se adapten a sus necesidades experimentales y de equipo. El sistema descrito aquí utiliza materiales y equipos comunes, que requieren solo habilidades básicas de manipulación de embriones. Esta técnica es efectiva para una variedad de estrategias de edición, lo que hace que este método sea ampliamente accesible para la comunidad de investigación.
El diseño de ARN guía pequeños ideales (sgRNAs) es esencial para una edición eficiente. Recomendamos cribar de dos a tres estrategias de sgRNA por sitio objetivo directamente en embriones de ratón, especialmente si se desea la generación de línea de ratón. Una vez diseñados, se recomiendan métodos libres de clonación como la transcripción in vitro (IVT) para producir sgRNAs de alta calidad3. Los RNPs y sgRNAs se mezclan con 30-50 embriones procesados en estadio pronuclear y se exponen a una serie de pulsos eléctricos para permeabilizar primero temporalmente la ZP y la membrana celular, con pulsos posteriores para mantener los poros abiertos y electrophorese los RNPs a través del cigoto24. Después de la optimización, encontramos que seis pulsos de 3 ms a 30 V para embriones a granel (~ 50) fueron óptimos para la efectividad y viabilidad de la edición, proporcionando una entrega de Cas9 / sgRNA RNP altamente eficiente 9,16,25. Los eventos de edición en mórulas individuales de ratón pueden confirmarse utilizando una variedad de estrategias de validación comunes para la edición CRISPR, como el polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP), la digestión de endonucleasas T7 y la secuenciación de Sanger de la región de interés26.
El método actual es más apropiado para esquemas de edición simples (Figura 3), como inserciones/deleciones (indeles), deleciones de tamaño de exón del orden de 500-2000 pb, y la entrega de mutaciones puntuales e inserciones pequeñas como etiquetas C- o N-Terminal (por ejemplo, FLAG, HA o V5)9,16,27. El potencial para la edición compleja del genoma, como grandes inserciones de etiquetas fluorescentes o alelos condicionales, sigue siendo incierto y es el foco actual de las próximas mejoras.
Este método se domina fácilmente y se puede utilizar para probar rápidamente sgRNAs en embriones de ratón cultivados en 1 semana9 (Figura 1). En este trabajo se presenta un protocolo de seis pasos, que incluye 1) diseño de sgRNA; 2) síntesis de sgRNA; 3) superovulación y apareamiento; 4) cultivo, recolección y procesamiento de embriones; 5) montaje y electroporación de RNP; 6) cultivo embrionario y genotipado. Se proporciona información sobre todos los materiales utilizados (Tabla de materiales). Como control positivo, los reactivos para editar el locus 9,16 de la tirosinasa (Tyr) se han incluido en la Tabla suplementaria 1.

<table><tbody><tr><td>Cubeta de electroporación con espacio de 0,1 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>n.º de cat. 1652089</td><td>Electroporación</td></tr><tr><td>26-G, aguja de 1/2 pulgada</td><td>BD</td><td>n.º de cat. 305111</td><td>Superovulación</td></tr><tr><td>3&ndash; Ratones machos de 8 meses y ratones hembra de 3 a 5 semanas de edad</td><td>JAX</td><td>n.º de cat. 000664</td><td>Superovulación</td></tr><tr><td>35 mm Placa de cultivo de tejidos</td><td>Greiner Bio-One,cat</td><td>. n.º 627-160 Cultivo de</td><td>embriones</td></tr><tr><td>60 mm Placa de cultivo de tejidos</td><td>Greiner Bio-One,cat</td><td>. n.º 628-160 Procesamiento de</td><td>embriones</td></tr><tr>6<td>veces el colorante de carga</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>n.º de cat. R0611</td><td>Síntesis y genotipado de sgRNA</td></tr><tr><td>Solución ácida de Tyrode (AT), grado de cultivo embrionario</td><td>Sigma-Aldrich,</td> <td>n.º de cat. T1788</td><td>Procesamiento</td>de</tr><tr><td>embriones BSA, grado de cultivo de embriones</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>n.º de cat. A3311</td><td>Procesamiento y cultivo de embriones</td></tr><tr><td>Proteína Cas9</td><td>Alt-R S.p. Cas9 nucleasa 3NLS</td><td>n.º de cat. 1074181</td><td>Electroporación</td></tr><tr><td>DNasa I, libre de ARNasa</td><td>New England BioLabs,</td> <td>n.º de cat. M0303</td><td>Síntesis de sgRNA</td></tr><tr><td>DPBS (libre de calcio y magnesio)</td><td>Gibco</td><td>n.º de cat. 14190-144 Procesamiento de</td><td>embriones</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>NEB</td><td>n.º de cat. R3101S</td><td>Genotipado</td></tr><tr><td>EDTA, anhidro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>n.º de cat. EDS-100G</td><td>Tampón RNP</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Koptec</td><td>cat. no. V1016</td><td>sgRNA Síntesis Gelatina</td></tr><tr><td>(polvo) tipo B, grado de laboratorio</td><td>Fisher,cat</td><td>. no. G7-500</td><td>Tampón de lisis</td></tr><tr><td>glicerol,&nbsp; grado de biología molecular</td><td>Fisher</td><td>cat. nº. BP229</td><td>RNP Tampón</td></tr><tr><td>Taq Polimerasa</td><td>Promega</td><td>n.º de cat. M712</td><td>Genotipado</td></tr><tr><td>HEPES, grado de cultivo celular</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat. n.º H4034</td><td>Tampón RNP</td></tr><tr><td>HinfI (10.000 U/mL)</td><td>NEB</td><td>n.º de cat. R0155S</td><td>Genotipado</td></tr><tr><td>HiScribe T7 Kit de síntesis de ARN de alto rendimiento</td><td>New England BioLabs,</td> <td>n.º de cat. E2040</td><td>Síntesis</td></tr> <tr><td>de sgRNAGonadotropina de corion humano, liofilizada&nbsp; (hCG)</td><td>Millipore</td><td>cat. n.º 230734</td><td>Superovulación</td></tr><tr><td>Hialuronidasa/M2</td><td>Millipore</td><td>cat. n.º. MR-051-F</td><td>Procesamiento de embriones</td></tr><tr><td>KSOMaa Medio Evolve (medio optimizado para símplex suplementado con potasio más aminoácidos)</td><td>Zenith Biotech</td><td>n.º de cat. ZEKS-050 Cultivo de</td><td>embriones</td></tr><tr><td>LE agarosa, grado analítico</td><td>BioExpress</td><td>n.º cat. E-3120-500</td><td>Síntesis y genotipado de sgRNA</td></tr><tr><td>M2 medio</td><td>Zenith Biotech</td><td>n.º de cat. ZFM2-050 Procesamiento de</td><td>embriones</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio, anhidro (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>n.º de cat. M8266</td><td>RNP y tampón de lisis</td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>Millipore</td><td>n.º de cat. ES-005C</td><td>Cultivo de embriones</td></tr><tr><td>Nonidet P-40, sustituto (NP-40)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>n.º de cat. 74385</td><td>Tampón de lisis</td></tr><tr><td>Agua sin nucleasas, grado de biología molecular</td><td>Ambion</td><td>n.º de cat. AM9937</td><td>Síntesis y genotipado de sgRNA</td></tr><tr><td>Oligótidos para la síntesis de sgRNA, óligo de donantes y cebadores de PCR para el genotipado</td><td>Tecnologías de ADN integradas</td><td>Pedidos personalizados</td><td>Diseño de sgRNA</td></tr><tr><td>Medio sérico reducido</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>cat. n.º 31985062</td><td>Cultivo de embriones</td></tr><tr><td>ADN polimerasa de alta fidelidad</td><td>New England BioLabs,n.º</td> <td>de cat. M0530</td><td>Síntesis</td></tr> <tr><td>de sgRNACloruro de potasiogrado de biología molecular (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat. no. P9333</td><td>RNP y tampón de lisis</td></tr><tr><td>Yegua preñada suero gonadotropina liofilizada ((PMSG)</td><td>ProspecBio</td><td>cat. no. HOR-272</td><td>Superovulación</td></tr><tr><td>Proteinasa K, grado de biología molecular</td><td>Fisher</td><td>cat. no. BP1700-100</td><td>Tampón de lisis</td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga de 1,5 ml sin ARNasa</td><td></td><td>N.º de cat. 20170-333</td><td>Síntesis y genotipado de sgRNA</td></tr><tr><td>Tubos de tira de PCR de ocho pocillos sin ARNasa</td><td>N.º de cat. 82006-606</td><td>sgRNA Síntesis y genotipado</td><td></td></tr><tr><td>Perlas de purificación magnéticas</td><td>GE Healthcare</td><td>n.º de cat. 65152105050250</td><td>Síntesis de sgRNA Tris</td></tr><tr><td>(2-carboxietil) fosfina clorhidrato (TCEP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>n.º de cat. C4706</td><td>Tampón RNP</td></tr><tr><td>Solución de Tris-HCl, pH 8,5 grado de biología molecular</td><td>Teknova</td><td>n.º de cat. T1085</td><td>Tampón de lisis</td></tr><tr><td>Tween 20 grado de biología molecular</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>n.º de cat. P7949-500</td><td>Tampón de lisis</td></tr></tbody></table>

edición eficiente del genoma de ratones mediante electroporación crispr de cigotos

Efficient Genome Editing of Mice by CRISPR Electroporation of Zygotes

Con una eficiencia, precisión y facilidad excepcionales, el sistema CRISPR / Cas9 ha mejorado significativamente la edición del genoma en cultivos celulares y experimentos con animales de laboratorio. Al generar modelos animales, la electroporación de cigotos ofrece una mayor eficiencia, simplicidad, costo y rendimiento como alternativa al método estándar de microinyección. La electroporación también es más suave, con mayor viabilidad, y suministra de manera confiable ribonucleoproteínas (RNP) Cas9 / ARN de guía única (sgRNA) en los cigotos de cepas comunes de ratones de laboratorio (por ejemplo, C57BL / 6J y C57BL / 6N) que se acerca al 100% de eficiencia de entrega. Esta técnica permite mutaciones de inserción/deleción (indeles), mutaciones puntuales, la deleción de genes enteros o exones, e inserciones pequeñas en el rango de 100-200 pb para insertar LoxP o etiquetas cortas como FLAG, HA o V5. Aunque se mejora constantemente, aquí presentamos el estado actual de CRISPR-EZ en un protocolo que incluye la producción de sgRNA a través de la transcripción in vitro , el procesamiento de embriones, el ensamblaje de RNP, la electroporación y el genotipado de embriones preimplantacionales. Un investigador de posgrado con experiencia mínima en la manipulación de embriones puede obtener embriones genéticamente editados en menos de 1 semana utilizando este protocolo. Aquí, ofrecemos un método sencillo, de bajo costo, eficiente y de alta capacidad que podría usarse con embriones de ratón.

Este método genera más de 100 μg de sgRNA (20 μL a &gt;concentración de 6,000 ng / L) para un ensamblaje eficiente de Cas9 / sgRNA RNP. El método de superovulación de rutina descrito aquí produce típicamente 10-20 embriones viables por hembra tapada. Debido a los errores de manejo y las pérdidas típicas asociadas con la manipulación embrionaria, se espera que el 80% de los embriones sean fertilizados, viables y en excelentes condiciones después de la electroporación. Para ayudar a los investigadores a ejecutar un experim...

Aquí, describimos una técnica simple destinada a la generación eficiente de ratones genéticamente modificados llamada CRISPR RNP Electroporación de Cigotos (CRISPR-EZ). Este método proporciona reactivos de edición por electroporación en embriones con una eficiencia cercana al 100%. Este protocolo es efectivo para mutaciones puntuales, pequeñas inserciones genómicas y deleciones en embriones de mamíferos.

Edición eficiente del genoma de ratones mediante electroporación CRISPR de cigotos

With exceptional efficiency, accuracy, and ease, the CRISPR/Cas9 system has significantly improved genome editing in cell culture and lab animal ...

Este método podría verificar los ARN guía en embriones, probar preguntas tempranas del desarrollo o crear ratones editados. Cualquier avance en CRISPR Cas9 podría usarse con este método. La principal ventaja de este método es que es fácil de aprender y utiliza reactivos que están disponibles para los laboratorios que tienen acceso a ratones.En el futuro, esta técnica sería útil para corregir una enfermedad o mutación en la descendencia de un animal de compañía o animal importante para la agricultura. Este método es el más adecuado para generar modelos de ratón. En nuestro laboratorio, hemos estado utilizando variaciones de este método para investigar los eventos que rodean la fertilización y el desarrollo temprano de la preimplantación, específicamente, la regulación génica en la potencia embrionaria.La parte más desafiante es usar la aguja de vidrio para mover embriones de una placa a otra. Demostrando este procedimiento estará Chantal Diallo, especialista en investigación en mi laboratorio. Para comenzar la recolección y el procesamiento de embriones, coloque el ratón hembra sacrificado en su espalda y rocíe etanol al 70% en el abdomen para abrirlo quirúrgicamente.Para abrir la c

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Nucleasas de diseñadores como nucleasas de dedos de zinc (ZFNs) y transcripción nucleasas efectoras del tipo activador (Talens) se pueden utilizar para modificar el genoma de preimplantación de embriones de ratones mediante la activación de ambos al final no homóloga (NHEJ) y recombinación homóloga (HR) itinerarios. Estos avances permiten la rápida generación de ratones con modificaciones genéticas precisas.

Del genoma del ratón Ingeniería Utilizando Nucleasas Designer

La microinyección de ovocitos de ratón se utiliza comúnmente tanto para la transgénesis clásica ( es decir, la integración aleatoria de transgenes) como para la orientación de genes mediados por CRISPR. Este protocolo revisa los últimos avances en microinyección, con especial énfasis en el control de calidad y las estrategias de genotipificación.

Generación de ratones modificados genéticamente a través de la microinyección de ovocitos

El cluster regularmente otro proteínas cortas repeticiones palindrómico/CRISPR asociado 9 (CRISPR/Cas9) sistema proporciona una herramienta prometedora para la ingeniería genética y abre la posibilidad de integración dirigida de los transgenes. Describimos una mediada por homología se terminan uniendo (HMEJ)-estrategia por turnos para ADN eficiente objetivo integración en vivo y dirigida terapias genéticas usando CRISPR/Cas9.

Integración dirigida CRISPR/Cas9-mediada In Vivo mediante una estrategia basada en unirse a final mediada por homología

Estudios convencionales de pérdida de función de genes knockout animales han sido a menudo costoso y desperdiciador de tiempo. Basada en la electroporación CRISPR-mediada mutagénesis somática es una poderosa herramienta para entender gen funciona en vivo. Aquí, Divulgamos un método para analizar los fenotipos de nocaut en la proliferación de las células del cerebelo.

Mediada por CRISPR pérdida de función análisis en gránulo cerebeloso células usando en el útero electroporación basado en la transferencia de genes

Aquí, presentamos un método modificado para la criopreservación de embriones unicelulares, así como un protocolo que combina el uso de embriones de congelación descongelado y electroporación para la generación eficiente de ratones modificados genéticamente.

Uso de embriones congelados descongelados para la producción de alta eficiencia de ratones modificados genéticamente

El presente protocolo describe la microinyección de cigoto de CRISPR-Cas9 y ADN de donantes para producir eficientemente ratones knock-in y floxed de casetes de genes.

Microinyección de cigoto para la creación de alelos de genes de casete knock-in y flox en ratones

Aquí presentamos un protocolo para desarrollar modelos de ratón modificados genéticamente utilizando células madre embrionarias, especialmente para ADN grande knock-in (KI). Este protocolo se ajusta utilizando la edición del genoma CRISPR / Cas9, lo que resulta en una eficiencia de KI significativamente mejorada en comparación con el método convencional de orientación de ADN linealizado mediado por recombinación homóloga.

Focalización génica altamente eficiente mediada por CRISPR/Cas9 en células madre embrionarias para desarrollar modelos de ratón manipulados genéticamente

Este protocolo describe la microinyección y la electroporación in vivo para la edición del genoma mediada por CRISPR restringida regionalmente en el oviducto de ratón.

Modelos de ratón de ingeniería genómica somática utilizando microinyección in vivo y electroporación

Este protocolo presenta un enfoque optimizado para la producción de modelos de ratas modificadas genéticamente. El virus adenoasociado (AAV) se utiliza para administrar una plantilla de reparación de ADN, y la electroporación se utiliza para administrar reactivos CRISPR-Cas9 para completar el proceso de edición del genoma en un embrión de 2 células.

Edición del genoma CRISPR-Cas9 de embriones de rata mediante virus adenoasociados (AAV) y electroporación de embriones de 2 células

La eficiencia del método de edición mejorada del genoma mediante la administración de ácidos nucleicos oviductales (I-GONAD) es comparable a la microinyección tradicional, que requiere la recolección de cigotos de hembras donantes y la transferencia a hembras pseudoembarazadas. Este protocolo demuestra su eficacia mediante la introducción de mutaciones inducidas por CRISPR/Cas9 en el locus ROSA26 en el cromosoma 6.

Edición mejorada del genoma a través de la técnica de electroporación in vivo basada en la administración de ácidos nucleicos oviductales para la generación de ratones knockout

La entrega de editores genómicos como ARN es un medio particularmente potente para modificar los genomas de las células y líneas celulares primarias de mamíferos. El objetivo de este protocolo es entregar editores genómicos como ARNm a células y líneas celulares primarias de mamíferos, seguido de secuenciación y análisis dirigidos de Illumina para cuantificar los resultados de edición.

Edición genómica en células primarias de mamíferos mediante electroporación del ARN editor

Aprende la técnica CRISPR-EZ para editar el genoma de ratones mediante electroporación de cigotos con eficiencia cercana al 100%. Este método facilita la creación de modelos animales para investigación genética y estudios de desarrollo embrionario temprano.

Edición eficiente del genoma de ratones mediante electroporación CRISPR de cigotos

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