Name: Evaluación de la activación de la caspasa para evaluar la muerte celular inmune innata (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Aprende a evaluar la activación de caspasas para estudiar la muerte celular inmune innata en macrófagos de médula ósea. Este método permite analizar múltiples vías de muerte celular y sus mecanismos moleculares en enfermedades.

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Agradecemos a los miembros del laboratorio de Kanneganti por sus comentarios y sugerencias, y agradecemos a J. Gullett, PhD, por el apoyo de edición científica. El trabajo en nuestro laboratorio está respaldado por las subvenciones AI101935, AI124346, AI160179, AR056296 y CA253095 (a T.-D.K.) y por las Caridades Asociadas Libanesas Sirias Americanas (a T.-D.K.). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

T.-D.K. es consultor de Pfizer.

El monitoreo de la escisión y activación de la caspasa proporciona una de las imágenes más completas de la activación innata de PCD inmune como parte de la respuesta inmune innata. El protocolo descrito aquí demuestra una estrategia para monitorizar la activación de caspasas en respuesta a infecciones por IAV, HSV1 y F. novicida y el desencadenante estéril LPS+ATP, pero muchos otros estímulos pueden inducir PCD y podrían ser utilizados en este método, como se ha demostrado en varias publicaciones 44,48,49,50,51,...

El sistema inmune innato actúa como la primera línea de defensa durante la infección y en respuesta a estímulos estériles, como lesiones tisulares y alteraciones en la homeostasis. Los sensores inmunes innatos en la superficie celular y en el citoplasma responden a patrones moleculares asociados a patógenos o daños (PAMP o DAMP, respectivamente) para desencadenar vías de señalización inflamatoria y respuestas celulares. Uno de los procesos clave de la respuesta inmune innata es la inducción de la muerte celular para eliminar las células infectadas o dañadas e impulsar más respuestas inmunes innatas y adaptativas. La muerte celular programada (PCD) es un proceso altamente conservado en todas las especies, destacando su importancia evolutiva como mecanismo inmune innato.
Hay varias vías innatas inmunes de PCD que pueden activarse en todos los tipos de células. Las caspasas son una familia clave de proteasas altamente conservadas, intracelulares y dependientes de cisteína que son críticas en muchas vías de PCD, incluida la vía de apoptosis tradicionalmente no inflamatoria, así como las vías inflamatorias de PCD como piroptosis, necroptosis y PANoptosis 1,2,3,4,5 . Hay 11 caspasas humanas y 10 murinas que están bien definidas, así como pseudo-caspasas que pueden ser funcionales, y la mayoría se expresan constitutivamente como pro-caspasas monoméricas o diméricas inactivas que requieren escisión para la activación 6,7. Las caspasas también contienen dominios importantes para el reclutamiento y la formación de complejos multiproteicos. Estos incluyen el dominio de activación y reclutamiento de caspasas (CARD), que se puede encontrar en caspasa-1, caspasa-2, caspasa-4, caspasa-5, caspasa-9 y caspasa-11, o el dominio efector de muerte (DED), que se encuentra en caspasa-8 y caspasa-10. A través de su actividad proteolítica y su capacidad para formar complejos multiproteicos, las caspasas son impulsores críticos de la PCD inmune innata.
El papel de las caspasas en la PCD inmune innata se identificó por primera vez en la apoptosis, donde las caspasas iniciadoras, caspasa-2, caspasa-8, caspasa-9 y caspasa-10, activan las caspasas verdugo, caspasa-3, caspasa-6 y caspasa-7, para conducir a la muerte celular 8,9,10,11,12. Las caspasas del iniciador pueden activarse mediante diversas cascadas de señalización; La vía extrínseca activa la caspasa-8 a través de la señalización del receptor de muerte inducida por ligandos extracelulares, y la vía intrínseca activa la caspasa-9 a través de la interrupción de la integridad mitocondrial13. Las caspasas iniciadoras activadas escinden el enlazador separando las subunidades catalíticas grandes y pequeñas de las caspasas ejecutoras para producir sus formas activas. Las caspasas verdugos luego escinden sus sustratos para desmontar la célula, lo que resulta en la degradación del ADN, el blebbing de la membrana, la fragmentación nuclear y la liberación de cuerpos apoptóticos14,15. Este proceso típicamente termina en una forma no lítica y no inflamatoria de muerte celular cuando se combina con la eliminación inmediata de las células moribundas por eferocitosis16. Sin embargo, los defectos en la eferocitosis o la falta de células fagocíticas pueden conducir a la acumulación de células apoptóticas, que luego sufren la muerte celular lítica e inflamatoria17,18.
Se ha descubierto que las caspasas inflamatorias, incluidas la caspasa-1 (humana y ratón), la caspasa-4 y la caspasa-5 (humana) y la caspasa-11 (ratón), se activan durante una forma de PCD INMUNE INNATA INFLAMATORIA (III-PCD) llamada piroptosis. La activación de la caspasa-1 se asocia con la formación de inflamasomas, que son complejos multiproteicos que contienen un sensor inmune innato citosólico, una molécula adaptadora (proteína moteada asociada a la apoptosis que contiene una CARD [ASC]) y caspasa-1. La formación de este complejo permite que la caspasa-1 se someta a una autoproteólisis mediada por proximidad para liberar su forma activa, que puede escindir sustratos diana incluyendo las citoquinas proinflamatorias interleucina (IL)-1β e IL-18 y la molécula formadora de poros gasdermina D (GSDMD)19,20,21,22,23 . La caspasa-11, la caspasa-4 y la caspasa-5 también pueden activar la GSDMD sin la formación aguas arriba del inflamasoma después de detectar PAMPs como el lipopolisacárido (LPS)19,20. Estas caspasas sufren dimerización seguida de oligomerización y autoescisión para la activación al unirse a LPS citosólico, lo que conduce a la activación no canónica del inflamasoma 24,25,26 y la activación de la caspasa-1 de manera intrínseca celular para inducir la maduración de IL-1β e IL-18 20. La maduración y liberación de estas citoquinas proinflamatorias caracterizan a estas caspasas como "inflamatorias". Además, se ha encontrado que la caspasa-8 apoptótica se localiza en el inflamasoma, proporcionando un vínculo entre los procesos apoptóticos y piroptóticos. Los estudios han encontrado que la caspasa-8 apoptótica también es crítica para regular otra forma de PCD llamada necroptosis. La pérdida de caspasa-8 da como resultado la activación espontánea de la serina-treonina quinasa 3 (RIPK3) mediada por el receptor de serina-treonina quinasa 3 (RIPK3) mediada por la pseudoquinasa de linaje mixto (MLKL) para impulsar la vía III-PCD de necroptosis 27,28,29,30,31,32,33,34,35.
Mientras que las caspasas han sido históricamente clasificadas como "apoptóticas" o "inflamatorias" en función del tipo de muerte celular que inician, la creciente evidencia sugiere que existe una amplia diafonía entre las vías innatas inmunes de PCD a través de caspasas 3,4. Por ejemplo, la caspasa-1 inflamatoria de los inflamasomas escinde la caspasa-7 apoptótica en su sitio de activación canónica34. La activación de la caspasa-1 también puede conducir a la escisión de sustratos apoptóticos como la poli(ADP-ribosa) polimerasa 1 (PARP1)36. En las células que carecen de GSDMD, la caspasa-1 también puede escindir la caspasa-337,38. Además, la caspasa-3 canónicamente apoptótica puede escindir la gasdermina E (GSDME) para inducir PCD17,18 y también procesa GSDMD en una forma inactiva40. Además, se ha observado el reclutamiento de caspasa-8 para el complejo inflamasoma 39,40,41,42,43,44,45, y la caspasa-8 es un regulador clave de la activación del inflamasoma canónico y no canónico 39. También hay roles superpuestos y redundantes para la caspasa-8 y la caspasa-1 en muchas condiciones inflamatorias, y la PCD inmune innata caracterizada por la activación de componentes piroptóticos, apoptóticos y necroptóticos ocurre en todo el espectro de la enfermedad 39,46,47,48,49,50.
Sobre la base de esta diafonía entre las caspasas inflamatorias y apoptóticas, se identificó una brecha clave en la comprensión mecanicista de la inmunidad innata y la PCD, lo que llevó al descubrimiento de la PANoptosis. PANoptosis es una forma única de III-PCD que se activa en respuesta a patógenos, PAMP, DAMP y alteraciones en la homeostasis y está regulada por PANoptosomas, complejos macromoleculares multifacéticos que integran componentes de otras vías de muerte celular 44,50,51,52,53,54,55 . La totalidad de los efectos biológicos en la PANoptosis no pueden explicarse individualmente por piroptosis, apoptosis o necroptosis solas 3,4,35,36,39,46,47,48, ya que la PANoptosis se caracteriza por la activación de múltiples caspasas, incluyendo caspasa-1, caspasa-11, caspasa-8, caspasa-9, caspasa-3 y/o caspasa-7, dependiendo del contexto 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,59,60,61,62 . La PANoptosis ha sido cada vez más implicada en enfermedades infecciosas e inflamatorias, así como en cánceres y terapias contra el cáncer 3,4,35,36,39,44,46,47,48,49,50,51,52,53 ,54,56 ,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66.
Dado el papel esencial de las caspasas a través de las vías de muerte celular, incluso en la apoptosis, la piroptosis, la necroptosis y la PANoptosis, es importante desarrollar técnicas para caracterizar su activación y comprender toda la complejidad de las vías de PCD. El protocolo aquí detalla un método para estimular las células y medir la activación posterior de las caspasas (Figura 1). Este método aprovecha la escisión proteolítica de las caspasas, que generalmente se requiere para su activación, como un medio para estudiarlas. A través de Western blotting, se pueden determinar los tamaños de las proteínas, lo que permite la visualización clara y la diferenciación de las pro-caspasas inactivas y sus formas activadas y escindidas.
Las principales ventajas de este protocolo son 1) su capacidad para evaluar la activación de múltiples caspasas en paralelo de una sola población de células endógenas para determinar con mayor precisión la activación de PCD y 2) el uso de técnicas de laboratorio relativamente simples que no requieren una capacitación extensa o equipos costosos. Los protocolos anteriores han utilizado Western blotting, reporteros fluorescentes o tinción de anticuerpos para monitorear la activación de caspasas en sobrenadantes de cultivo, lisados celulares y tisulares, células enteras mediante microscopía e in vivo 67,68,69,70,71, pero estas técnicas generalmente solo monitorean una o dos caspasas en una muestra. Además, mientras que los sustratos peptídicos sintéticos que contienen sitios de escisión de caspasa que fluorescen sobre la escisión se han utilizado para monitorear la activación de caspasas en lisados celulares o tisulares69, estos sustratos a menudo pueden ser escindidos por más de una caspasa, lo que dificulta determinar la activación específica de caspasas individuales en este sistema. Además, el uso de Western blot en lugar del uso de reporteros fluorescentes u otros métodos basados en etiquetas permite a los investigadores usar células endógenas en lugar de crear líneas celulares específicas con genes reporteros. El uso de células endógenas tiene múltiples ventajas, incluido el hecho de que muchas líneas celulares inmortalizadas son deficientes en moléculas clave de muerte celular72,73, lo que podría afectar los resultados. Además, el uso de células endógenas permite la evaluación de diversos tipos de células, como macrófagos, células epiteliales y células endoteliales, en lugar de un solo linaje. Western blot también es una técnica relativamente simple y rentable que se puede llevar a cabo en laboratorios de todo el mundo sin la necesidad de equipos grandes y costosos o configuraciones complicadas.
Este protocolo es ampliamente aplicable en toda la biología para comprender las funciones dependientes de la muerte celular e independientes de la muerte celular de las caspasas, incluidas sus funciones de andamiaje y funciones en otras vías de señalización inflamatoria74. La aplicación de este método permite un enfoque unificado en el estudio de las vías innatas inmunes de PCD y la señalización inflamatoria a través de enfermedades y afecciones, y este protocolo se puede utilizar para identificar procesos regulatorios críticos y conexiones mecanicistas que informarán el desarrollo de futuras estrategias terapéuticas.

<table><tbody><tr><td>0,45 &mu; m filter</td><td>Millipore</td><td>SCHVU05RE</td><td></td></tr><tr><td>jeringa de 10 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>gel de poliacrilamida al 12% con 10 pocillos&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>4561043</td><td></td></tr><tr><td>placa de 12 pocillos&nbsp;</td><td>Corning</td><td>07-200-82</td><td></td></tr><tr><td>aguja de 18 G&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>aguja de 25 G&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>tubo de 50 mL&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-809-218</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; Filtro de células M&nbsp;</td><td>Corning</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>placas de cultivo de tejidos de 150 mm</td><td>Corning</td><td>430597</td><td></td></tr><tr><td>matraz de cultivo de tejidos de 182 cm2</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-211</td><td></td></tr><tr><td>Accesorio bandeja trans blanca</td><td>Cytiva</td><td>29-0834-18</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash; anticuerpo caspasa-1</td><td>AdipoGen</td><td>AG-20B-0042-C100</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash; anticuerpo caspasa-11</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB120-10454</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash; anticuerpo caspasa-3</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>9662</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash; anticuerpo caspasa-7</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>9492</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash; anticuerpo caspasa-8</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>4927</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash; anticuerpo caspasa-9</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>9504</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash; anticuerpo de caspasa-3 escindido&nbsp;</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>9661</td><td></td></tr><tr><td>anti&ndash; anticuerpo caspasa-7 escindido&nbsp;</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>9491</td><td></td></tr><tr><td>anti&ndash; anticuerpo caspasa-8 escindido&nbsp;</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>8592</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario conjugado con HRP de ratón&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>315-035-047</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario conjugado con HRP anti-conejo &nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>111-035-047</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario conjugado con HRP anti-rata&nbsp;</td><td>Laboratorios de Investigación Inmunológica Jackson</td><td>112-035-003</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash; &beta;-Anticuerpo de actina (C4) HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-47778 HRP</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-atpl</td><td></td></tr><tr><td>BBL Tripticasa Caldo de soja</td><td>BD Biosciences</td><td>211768</td><td></td></tr><tr><td>Bead</td> bath <td>Chemglass Life Sciences</td><td>CLS-4598-009</td><td></td></tr><tr><td>Biofotómetro D30</td><td>Eppendorf</td><td>6133000010</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>BO126</td><td></td></tr><tr><td>Raspadores de células</td><td>CellTreat Scientific Products</td><td>229315</td><td></td></tr><tr><td>Generador de imágenes de quimioluminiscencia (Amersham 600)&nbsp;</td><td>Cytiva</td><td>29083461</td><td></td></tr><tr><td>CO2&nbsp; cámara</td><td>VetEquip</td><td>901703</td><td></td></tr><tr><td>Cubetas</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-129</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de disección</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>221S</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>Aparato de eelectroforesis&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1658004</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Pharmco 111000200</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino&nbsp;</td><td>Biowest</td><td>S1620</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>Bio-Rad</td> Pinzas <td>de 1703965</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>22-327379</td><td></td></tr><tr><td>Francisella novicida (cepa U112)</td><td>BEI Resources</td><td>NR-13</td><td></td></tr><tr><td>Liberador de gel&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1653320</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Gibco 15750060</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G7893</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>H9892</td><td></td></tr><tr><td>Bloque de calor</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-043-160</td><td></td></tr><tr><td>Virus del herpes simple 1 (cepa HF)</td><td>ATCC</td><td>VR-260</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa alta DMEM&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D6171</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash humano; anticuerpo caspasa-1</td><td>R& D Sistemas</td><td>MAB6215</td><td></td></tr><tr><td>anti&ndash humano anticuerpo caspasa-8</td><td>Enzo</td><td>ALX-804-242</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora humidificada&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51026282</td><td></td></tr><tr><td>Software de análisis de imágenes</td><td>ImageJ</td><td>v1.53a</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12440-053</td><td></td></tr><tr><td>Virus de la influenza A (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8])&nbsp;</td><td>construido por Hoffmann et al.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Células L929</td><td>ATCC</td><td>Línea celular CCL-1</td><td>para la creación de L-cisteína de medios condicionados L929</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP376-100</td><td></td></tr><tr><td>Luminata Forte Sustrato HRP occidental</td><td>Millipore</td><td>WBLUF0500</td><td>sustrato HRP de sensibilidad estándar</td></tr><tr><td>Celdas MDCK Línea</td> celular <td>ATCC</td><td>CCL-34</td><td>para determinar el título viral de IAV</td></tr><tr><td>Microcentrífuga de metanol</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>75002401</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos no esenciales&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Leche en polvo descremada</td><td>Kroger</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NP-40 solución&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>492016</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina y estreptomicina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-202-011</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>Roche</td><td>PHOSS-RO</td><td></td></tr><tr><td>Fuente de alimentación&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5052</td><td></td></tr><tr><td>Comprimido inhibidor de la proteasa</td><td>Sigma</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de PVDF&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Agitador oscilante</td><td>Labnet</td><td>S2035-E</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Desoxicolato de sodio</td><td>Sigma</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Sigma</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri cuadrada</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875711A</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de extracción</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21059</td><td></td></tr><tr><td>Super Signal Femto Sustrato HRP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34580</td><td>de alta sensibilidad</td></tr><tr><td>Centrífuga de sobremesa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004524</td><td></td></tr><tr><td>Sistema semiseco Trans-Blot&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3940</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>TRIS-RO</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisacárido ultrapuro (LPS) de E. coli 0111:B4</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-3pelps</td><td></td></tr><tr><td>Línea</td> celular <td>Vero ATCC</td><td>CCL-81</td><td>para determinar el título viral de HSV1</td></tr></tbody></table>

evaluación de la activación de la caspasa para evaluar la muerte celular inmune innata

Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death

La inmunidad innata proporciona la primera línea crítica de defensa en respuesta a patógenos e insultos estériles. Un componente mecanicista clave de esta respuesta es el inicio de la muerte celular programada inmune innata (PCD) para eliminar las células infectadas o dañadas y propagar las respuestas inmunes. Sin embargo, el exceso de PCD se asocia con inflamación y patología. Por lo tanto, comprender la activación y regulación de la PCD es un aspecto central de la caracterización de las respuestas inmunes innatas y la identificación de nuevos objetivos terapéuticos en todo el espectro de la enfermedad.
Este protocolo proporciona métodos para caracterizar la activación innata de PCD inmune mediante el monitoreo de caspasas, una familia de proteasas dependientes de cisteína que a menudo se asocian con diversas vías de PCD, incluyendo apoptosis, piroptosis, necroptosis y PANoptosis. Los informes iniciales caracterizaron la caspasa-2, la caspasa-8, la caspasa-9 y la caspasa-10 como caspasas iniciadoras y la caspasa-3, caspasa-6 y caspasa-7 como caspasas efectoras en la apoptosis, mientras que estudios posteriores encontraron que las caspasas inflamatorias, caspasa-1, caspasa-4, caspasa-5 y caspasa-11, impulsan la piroptosis. Ahora se sabe que existe una amplia diafonía entre las caspasas y otras moléculas innatas inmunes y de muerte celular a través de las vías de PCD previamente definidas, identificando una brecha de conocimiento clave en la comprensión mecanicista de la inmunidad innata y PCD y conduciendo a la caracterización de PANoptosis. PANoptosis es una vía PCD inflamatoria inmune innata única regulada por complejos PANoptosomas, que integran componentes, incluidas las caspasas, de otras vías de muerte celular.
Aquí, se proporcionan métodos para evaluar la activación de las caspasas en respuesta a diversos estímulos. Estos métodos permiten la caracterización de las vías de PCD tanto in vitro como in vivo, ya que las caspasas activadas experimentan una escisión proteolítica que puede visualizarse mediante western blot utilizando anticuerpos óptimos y condiciones de blotting. Se ha establecido un protocolo y un flujo de trabajo de western blotting que permiten evaluar la activación de múltiples caspasas de la misma población celular, proporcionando una caracterización integral de los procesos de PCD. Este método se puede aplicar en todas las áreas de investigación en desarrollo, homeostasis, infección, inflamación y cáncer para evaluar las vías de PCD a lo largo de los procesos celulares en la salud y la enfermedad.

La PANoptosis se ha observado en respuesta a numerosas infecciones bacterianas, virales y fúngicas y otros estímulos inflamatorios, así como en células cancerosas 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,60,61,62 <sup c...

Este protocolo describe un método integral para evaluar la activación de caspasas (caspasa-1, caspasa-3, caspasa-7, caspasa-8, caspasa-9 y caspasa-11) en respuesta a modelos de infección, insultos estériles y cáncer tanto in vitro como in vivo (en ratones) para determinar el inicio de vías de muerte celular, como piroptosis, apoptosis, necroptosis y PANoptosis.

Evaluación de la activación de la caspasa para evaluar la muerte celular inmune innata

Innate immunity provides the critical first line of defense in response to pathogens and sterile insults. A key mechanistic component of this response is ...

Este protocolo proporciona una comprensión multifacética de la activación de los procesos de muerte celular, que puede proporcionar información crítica sobre los mecanismos de la enfermedad e informar estrategias terapéuticas. Este protocolo se basa en el uso de una técnica más sencilla y para acceder a la activación de múltiples caspasas imperativo de una sola población de células endógenas para determinar en gran medida la activación. La muerte celular inmune innata se ha implicado en todo el espectro de la enfermedad, desde infecciones hasta enfermedades inflamatorias y cánceres.Comprender los mecanismos moleculares de la muerte celular a través de la activación de caspasas puede proporcionar información crítica sobre los procesos de la enfermedad. Julieann, investigadora postdoctoral asociada de un laboratorio, demostrará el procedimiento. Después de aislar la médula ósea y diferenciar las DMO, infectar las células con el virus de la gripe A.Calcule el volumen de virus necesario en una multiplicidad de infección de 20 unidades formadoras de placa. Retire los medios de los BMDM y lave las células una vez con 500 microlitros de PBS. Agregue 450 microlitros del virus de la influen

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video demuestra la activación de proteínas caspasas en macrófagos humanos utilizando proteínas reporteras de complementación de fluorescencia bimolecular. Los prodominios de la caspasa-1 se fusionan con fragmentos no fluorescentes de las proteínas de Venus, que se reclutan para los complejos de inflamasoma. La proximidad de los inflamasomas induce el repliegue y la fluorescencia de los fragmentos de Venus, lo que confirma la activación de las caspasas en los macrófagos.

Visualización de la activación de caspasas en macrófagos derivados de monocitos humanos

Este video muestra la evaluación de múltiples activaciones de caspasas en macrófagos derivados de la médula ósea a través de la estimulación con el virus de la influenza. Tras la lisis de macrófagos, la inactivación térmica del lisado y la centrifugación, se recogen caspasas intracelulares para su posterior análisis inmunológico.

Evaluación de la activación de múltiples caspasas en macrófagos

Ensayos multiplex pueden proporcionar información útil para los mecanismos celulares básicos y eliminar los residuos de los reactivos y experimentos repetitivos innecesarios. Se describe aquí un múltiplex de la caspasa-3/7 ensayo de actividad, utilizando métodos fluorescentes y luminiscentes basados ​​en, para determinar la viabilidad celular en un modelo hipotalámico in vitro después de desafío oxidativo con ácido palmítico.

El uso de una Multiplexación Ensayo de la caspasa para determinar la apoptosis en un modelo de célula hipotalámica

Para detectar las células sanas en animales enteros que contienen niveles bajos de actividad caspasa, el biosensor altamente sensible designado CaspaseTracker se generó para Drosophila. se detecta actividad biosensor dependiente de caspasa en las células sanas de larga vida a través de los órganos internos de los animales adultos criados en condiciones optimizadas en ausencia de estímulos de muerte.

En Vivo biosensor Pistas de apoptosis no caspasa actividad en Drosophila

Describimos la detección de la activación de inflammasome NLRP3 en bases celulares mediante microscopía de fluorescencia y la coloración para activa caspasas-1 y el adaptador, ASC. Un ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa se presenta para detectar lisis pyroptotic sobre una base de población. Estas técnicas se pueden adaptar para estudiar muchos aspectos de la biología de inflammasome.

Detección de Inflammasome activación y muerte celular Pyroptotic en macrófagos derivados de médula ósea murinas

Aquí, se presenta un flujo de trabajo experimental que permite la detección del procesamiento de caspasa-8 directamente en el complejo de señalización inductor de muerte (DISC) y determina la composición de este complejo. Esta metodología tiene amplias aplicaciones, desde desentrañar los mecanismos moleculares de las vías de muerte celular hasta el modelado dinámico de las redes de apoptosis.

Medición de la composición del complejo de señalización inductor de muerte CD95 y procesamiento de la procaspasa-8 en este complejo

Este protocolo describe el flujo de trabajo para obtener macrófagos derivados de monocitos (MDM) a partir de muestras de sangre humana, un método simple para introducir eficientemente reporteros de complementación de fluorescencia bimolecular de caspasa inflamatoria (BiFC) en MDM humanos sin comprometer la viabilidad y el comportamiento celular, y un enfoque basado en imágenes para medir la activación de la caspasa inflamatoria en células vivas.

Visualización de la proximidad inducida por caspasas inflamatorias en macrófagos derivados de monocitos humanos

La infección por el virus de la influenza A (IAV) activa las caspasas que escinden las proteínas del huésped y virales, que, a su vez, tienen funciones pro y antivirales. Mediante el empleo de inhibidores, interferencia de ARN, mutagénesis dirigida al sitio y técnicas de Western blotting y RT-qPCR, se identificaron caspasas en células de mamíferos infectadas que escinden cortactina del huésped e histonas desacetilasas.

Identificación de caspasas y sus motivos que escinden proteínas durante la infección por el virus de la influenza A

El presente protocolo describe dos métodos para medir la actividad de las caspasas a través de un sustrato fluorogénico utilizando citometría de flujo o un espectrofluorómetro.

Medición de la actividad de las caspasas mediante un ensayo fluorométrico o citometría de flujo

Mediadas por células linfocitotoxicidad (LMC) los ensayos se pueden utilizar para evaluar las respuestas autorreactivas y los mecanismos de estudio de la muerte celular in vitro. Sin embargo, utilizando células vivas, las técnicas de microscopía confocal microscópicos con tintes fluorescentes, el tipo y la cinética de muerte celular, así como las rutas utilizadas se pueden estudiar con mayor detalle.

Métodos para evaluar la Beta mediada por la muerte celular por linfocitos T citotóxicos

Aprende a evaluar la activación de caspasas para estudiar la muerte celular inmune innata en macrófagos de médula ósea. Este método permite analizar múltiples vías de muerte celular y sus mecanismos moleculares en enfermedades.

Evaluación de la activación de la caspasa para evaluar la muerte celular inmune innata

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