Name: Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Aprende a diferenciar células iPSC en microglía humana y realizar ensayos de fagocitosis con sinaptosomas humanos mediante imagen de células vivas. Este protocolo optimiza la viabilidad celular y la pureza para estudiar neuroinflamación.

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Los autores agradecen a Michael Ward por proporcionar la línea WTC11 hNIL iPSC para la diferenciación de neuronas motoras y a Jackson Laboratories por suministrar la línea KOLF2.1J WT clon B03 iPSC utilizada para la diferenciación de microglía. También agradecemos a Dorothy Schafer por su apoyo durante la implementación de los protocolos, a Anthony Giampetruzzi y John Landers por su ayuda con el sistema de imágenes de células vivas, así como a Hayden Gadd por sus contribuciones técnicas durante las revisiones y a Jonathan Jung por su colaboración en este estudio. Este trabajo fue apoyado por el Fondo Dan y Diane Riccio para la Neurociencia de la Escuela de Medicina UMASS Chan y el Angel Fund, Inc.

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<li>Wilgenburg, B. v, Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient%2C+long+term+production+of+monocyte-derived+macrophages+from+human+pluripotent+stem+cells+under+partly-defined+and+fully-defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions.</a> PloS One. 8 (8), 71098(2013).</li>
<li>Hoeffel, G., Ginhoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+tissue-resident+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of tissue-resident macrophages.</a> Frontiers in Immunology. 6, 486(2015).</li>
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<li>Nau, R., Ribes, S., Djukic, M., Eiffert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+to+increase+the+activity+of+microglia+as+efficient+protectors+of+the+brain+against+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Strategies to increase the activity of microglia as efficient protectors of the brain against infections.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 138(2014).</li>
<li>Fernandopulle, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor-mediated+differentiation+of+human+iPSCs+into+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons.</a> Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51(2018).</li>
<li>Gutbier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+production+of+human+IPSC-derived+macrophages+for+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Large-scale production of human IPSC-derived macrophages for drug screening.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (13), 4808(2020).</li>
<li>Sellgren, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+models+of+microglia-mediated+engulfment+of+synapses+and+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Patient-specific models of microglia-mediated engulfment of synapses and neural progenitors.</a> Molecular Psychiatry. 22 (2), 170-177 (2017).</li>
<li>Schmidt, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALS-linked+PFN1+variants+exhibit+loss+and+gain+of+functions+in+the+context+of+formin-induced+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">ALS-linked PFN1 variants exhibit loss and gain of functions in the context of formin-induced actin polymerization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (23), (2021).</li>
<li>Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+to+determine+the+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

El protocolo de diferenciación descrito aquí proporciona un método eficiente para obtener células similares a la microglía derivadas de iPSC en ~ 6-8 semanas con alta pureza y en un rendimiento suficiente para realizar experimentos de inmunofluorescencia y otros ensayos que requieren un mayor número de células. Este protocolo ha producido hasta 1 × 106 iMGs en 1 semana, lo que permite la extracción de proteínas y ARN y los correspondientes análisis posteriores (por ejemplo, RNASeq, qRT-PCR, western blot, espec...

La microglía son las células inmunes residentes en el sistema nervioso central (SNC) y desempeñan un papel crucial en el desarrollo del SNC. La microglía también es importante en el cerebro adulto para mantener la homeostasis y responder activamente a los procesos de trauma y enfermedad. La evidencia acumulada muestra que la microglía es un contribuyente clave para la patogénesis de múltiples enfermedades neurodegenerativas y del desarrollo neurológico 1,2. Aunque el conocimiento actual sobre la biología microglial se ha derivado predominantemente de modelos de ratón, estudios recientes han dilucidado diferencias importantes entre la microglía murina y humana, subrayando la necesidad de desarrollar tecnologías para estudiar la genética y las funciones biológicas de la microglía humana 3,4. El aislamiento de la microglía del tejido primario disecado puede modificar gravemente las propiedades de la microglía5, lo que podría confundir los resultados adquiridos con tales células. El objetivo general de este método es diferenciar las iPSC humanas en iMG, proporcionando así un sistema de cultivo celular para estudiar la microglía humana en condiciones basales. Además, aquí se incluye un ensayo de fagocitosis utilizando un sistema modelo totalmente humano como un medio para estudiar la funcionalidad de los iMG, tanto como medida de control de calidad como para evaluar la disfunción de la MGI en el contexto de la enfermedad.
Múltiples protocolos para la diferenciación de microglia de iPSCs han surgido recientemente en la literatura 6,7,8,9,10. Las desventajas potenciales de algunos protocolos incluyen períodos prolongados o largos de diferenciación, la adición de múltiples factores de crecimiento y/o procedimientos experimentales complejos 6,9,10. Aquí, se demuestra un método de diferenciación "fácil de usar" que recapitula aspectos de la ontogenia de la microglía a través de la diferenciación de iPSCs en células precursoras denominadas precursoras primitivas de macrófagos (PMPs)7,11. Los PMP se generan como se describió anteriormente, con algunas optimizaciones presentadas aquí en12. Los PMP imitan a los macrófagos derivados del saco vitelino independientes de MYB, que dan lugar a la microglía durante el desarrollo embrionario al invadir el cerebro antes del cierre de la barrera hematoencefálica13. Para diferenciar terminalmente las PMP en MGI, utilizamos un método de monocultivo rápido y simplificado basado en los protocolos de Haenseler et al. y Brownjohn et al., con algunas modificaciones para generar un método eficiente de diferenciación de microglia en el que los iMG expresan robustamente marcadores enriquecidos con microglía 7,8. Este método de diferenciación se puede reproducir en laboratorios con experiencia en el cultivo de iPSCs y con objetivos de investigación destinados a estudiar la biología de la microglía utilizando un sistema modelo humano.
La microglía derivada de iPSC representa una fuente biológicamente relevante de microglía humana para la experimentación in vitro y es una herramienta importante para investigar las funciones canónicas microgliales, incluida la fagocitosis. La microglía son los fagocitos profesionales del cerebro y el SNC, donde limpian los desechos celulares, agregan proteínas y degradan la mielina14. La microglía también funciona en la remodelación sináptica por envolver sinapsis y en la defensa contra infecciones externas a través de fagocitosis de patógenos15,16. En este protocolo, la fagocitosis por iMGs se evalúa utilizando sinaptosomas humanos como material para la absorción de iMG. Con este fin, se describe una descripción para aislar sinaptosomas derivados de LMNs humanos i3. Los sinaptosomas humanos derivados de i3LMN están marcados con un colorante sensible al pH que permite la cuantificación de sinaptosomas localizados dentro de compartimentos ácidos durante el procesamiento del fagosoma y la degradación in vitro. Se muestra un ensayo de fagocitosis utilizando microscopía de células vivas para monitorear el proceso dinámico de envolvimiento de microglia en tiempo real. Este ensayo funcional establece una base para investigar posibles defectos en la fagocitosis microglial en la salud y la enfermedad utilizando un sistema humano completo.

<table><tbody><tr><td><Anticuerpos fuertes> para el análisis de inmunofluorescencia</</td>anti-IBA1 fuerte anticuerpo > <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>conejo</td><td>Wako Chemical USA</td><td>NC9288364</td><td>dilución 1:350</td></tr><tr><td>anticuerpo anti-P2RY12 para conejos</td><td>Sigma-Aldrich HPA014518</td><td></td><td>dilución 1:50</td></tr><tr><td>anticuerpo anti-TMEM119 conejo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA051870</td><td>dilución</td></tr> <tr><td>1:100<Anticuerpos fuertes > para el análisis de Western blot</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-&beta;-Tubulina anticuerpo de conejo</td><td>Abcam</td><td>ab6046</td><td>Dilución 1:500</td></tr><tr><td>anti-Sinaptofisina (SYP) anticuerpo de conejo</td><td>Abclonal</td><td>A6344</td><td>Dilución 1:1.000</td></tr><tr><td>anticuerpo anti-PSD95 para ratones</td><td>Millipore</td><td>MAB1596</td><td>1:500</td></tr> <tr><td>tampón < >borato fuerte componentes</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico (100 mM)</td><td>Sigma</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio (NaHCO3) BioXtra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297-250G</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (75 mM)</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; S7653</td><td></td></tr><tr><td>Tetraborato de sodio (25 mM)</td><td>Sigma</td><td>221732</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Materiales de cultivo celular</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>placas de 6 pocillos</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m Filtros de celdas</td><td>&nbsp; Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 20 mm Cultivo de Tejidos Tratado, CELLTREAT</td><td></td><td>229620</td><td></td></tr><tr><td>Elevador de Células, Doble Extremo, Hoja Plana & Cuchilla estrecha, estéril</td><td>CELLTREAT</td><td>229305</td><td></td></tr><tr><td>de baja adherencia Placa de 96 pocillos de fondo redondo</td><td>Corning</td><td>7007</td><td></td></tr><tr><td>Primaria 24 pocillos de superficie de fondo plano Placa de cultivo celular modificada</td><td>de múltiples pocillos Corning</td><td>353847,Primaria</td><td></td></tr> <tr><td>6-pocillos Cell Clear Flat Plate Placa de cultivo multipocillo modificada en superficie</td><td>Corning</td><td>353846</td><td></td></tr><tr><td>Primaria 96-pocillos Clear Flat Microplaca inferior</td><td>Corning</td><td>353872</td><td></td></tr><tr><td><reactivos > disociación celular</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>&nbsp; Reactivos de</td> disociación Corning <td>25058CI</td><td>utilizados para la diferenciación de neuronas motoras inferiores</td></tr><tr><td>Reactivo TrypLE</td><td>Life Technologies</td><td>12-605-010</td><td>reactivos de disociación utilizados para la diferenciación de microglía</td></tr><tr><td>UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Reactivos de recubrimiento para cultivo celular</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel GFR Matriz de membranas Corning</td><td>&trade;</td><td>354230</td><td>Referido a reactivo de recubrimiento de matriz extracelular</td></tr><tr><td>CellAdhere Laminin-521</td><td>STEMCELL Technology</td><td>77004</td><td>Referido a laminina 521</td></tr><tr><td>Poly-D-Lisine</td><td>Sigma</td><td>P7405</td><td>Reconstituir a 0,1 mg/mL en tampón de borato</td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithine</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; P3655</td><td>Reconstituir a 1 mg/mL en tampón de borato</td></tr><tr><td><fuerte>Componentes de medios iPSC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Kit mTeSR Plus Tecnología</td><td>STEMCELL</td><td>100-0276</td><td>Para preparar medios iPSC mezclado los componentes a 1x</td></tr><tr><td>Components of EB media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BMP-4</td><td>Fisher Scientific PHC9534</td><td></td><td>concentración final 50 ng/mL</td></tr><tr><td>iPSC media</td><td></td><td></td><td>concentración final 1x</td></tr><tr><td>Inhibidor de ROCK Y27632</td><td>Fisher Scientific</td><td>BD 562822</td><td>concentración final 10 &micro; M</td></tr><tr><td>SCF</td><td>PeproTech</td><td>300-07</td><td>concentración final 20 ng/mL</td></tr><tr><td>VEGF</td><td>PeproTech</td><td>100-20A</td><td>concentración final 50 ng/mL</td></tr><tr><td><fuerte>Componentes de medios base PMP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>concentración final 1x</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>concentración final 100 U/mL</td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>Lonza</td><td>12001-988</td><td>concentración final 1x</td></tr><tr><td>Componentes de medios completos PMP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>55 mM 2-mercaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>concentración final 55 &micro; M</td></tr><tr><td>IL-3</td><td>PeproTech</td><td>200-03</td><td>concentración final 25 ng/mL</td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-25</td><td>concentración final 100 ng/mL</td></tr><tr><td>PMP medios base</td><td></td><td></td>concentración <td>final 1x</td></tr><tr><td>Componentes de medios base iMG</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634010</td><td>concentración final 1x</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>concentración final 1x</td></tr><tr><td>suplemento de N2, 100x</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>concentración final 1x</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>concentración final 100 U/mL</td></tr><tr><td><fuerte>Componentes de medios completos iMG</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>55 mM 2-mercaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>concentración final 55 &micro; M</td></tr><tr><td>IL-34</td><td>PeproTech o Biologend</td><td>200-34 o 577904</td><td>concentración final 100 ng/mL</td></tr><tr><td>iMG medios base</td><td></td><td></td><td>concentración final 1x</td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-25</td><td>concentración final 5 ng/mL</td></tr><tr><td>TGF-&beta;</td><td>PeproTech</td><td>100-21</td><td>concentración final 50 ng/mL</td></tr><tr><td>Componentes de medios base de inducción</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 con concentración final de 11330032 HEPES</td><td>Gibco</td><td></td><td>1x</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>concentración final 1x</td></tr><tr><td>suplemento de N2, 100x</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>final concentración 1x</td></tr><tr><td>Aminoácidos no esenciales (NEAA), 100x</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>concentración final 1x</td></tr><tr><td>Componentes de Medios de inducción completos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Compuesto E</td><td>Calbiochem</td><td>565790</td><td>concentración final 0,2 &mu; M y reconstituir el reactivo madre a 2 mM en etanol 1:1 y DMSO</td></tr><tr><td>Doxiciclina</td><td>Sigma</td><td>D9891</td><td>concentración final 2 &mu; g/mL y reconstituya el reactivo madre a 2 mg/mL en DPBS</td></tr><<tr><td>em>Medios base de inducción</td><td>concentración final 1x</td>Inhibidor de <td></td><td></td></tr><tr><td>ROCK Y27632</td><td>Fisher Scientific</td><td>BD 562822</td><td>concentración final 10 &mu; M</td></tr><tr><td>Componentes de Neuron media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B-27 Plus Sistema de cultivo neuronal</td><td>Gibco</td><td>A3653401</td><td>concentración final 1x para medios y suministro</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>concentración final 1x</td></tr><tr><td>Suplemento de N2, 100x</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>concentración final 1x</td></tr><tr><td>Aminoácidos no esenciales (NEAA), 100x</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>concentración final 1x</td></tr><tr><td>iPSC líneas utilizadas en este estudio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KOLF2.1J: clon WT B03</td><td>The Jackson Laboratories</td> WTC11 hNIL National Institute <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>reactivos de aislamiento de sinaptosomas</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensayo de proteínas BCA</td><td>Thermo Scientific Pierce</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Syn-PER Reactivo de extracción de proteínas sináptico</td><td>Thermo Scientific</td><td>87793</td><td>Referido al reactivo de lisis celular para el aislamiento de sinaptosomas</td></tr><tr><td><fuerte>Colorantes de ensayo de fagocitosis</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reactivo NucBlue Live Ready</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; R37605</td><td></td></tr><tr><td>pHrodo Rojo, éster de succinimidilo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&nbsp; P36600</td><td>Referido a colorantes sensibles al pH</td></tr><tr><td><fuerte>Otros reactivos de cultivo celular</Azul > tripano fuerte</td>, solución al <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,4%</td><td>AMRESCO INC</td><td>K940-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma</td><td>22144-77-0</td><td></td></tr><tr><td>BrdU</td><td>Sigma</td><td>B9285</td><td>Reconstituir a 40 mM en agua estéril</td></tr><tr><td>Citocalasina D</td><td>Sigma</td><td></td><td>concentración final 10 &micro; M</td></tr><tr><td>DPBS con Calcio y magnesio</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>DPBS sin calcio y magnesio</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td>Referido a DPBS</td></tr><tr><td>KnockOut&nbsp; DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>12660012</td><td>Referido a DMEM-F12 optimizado para el crecimiento de células madre pluripotentes embrionarias humanas e inducidas</td></tr><tr><td>Laminina Proteína de ratón,</td><td>natural Gibco</td><td>23017015</td><td>Referido a laminina</td></tr><tr><td>Software y equipo</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>Modelo 5810R</td><td></td></tr><tr><td>Citación 5 Imágenes de células vivas lector</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gen5 Microplate Reader and Imager Software</td><td>Biotek</td><td>versión 3.03</td><td></td></tr><tr><td>Multi-Therm Heat-Shake</td><td>Benchmark</td><td></td><td>se refiere como agitador de tubos</td></tr><tr><td>Sonicador de agua</td><td>Elma</td><td>Mode Transsonic 310</td><td></td></tr></tbody></table>

human microglia-like cells: differentiation from induced pluripotent stem cells and in vitro live-cell phagocytosis assay using human synaptosomes

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

La microglía son las células inmunes residentes de origen mieloide que mantienen la homeostasis en el microambiente cerebral y se han convertido en un jugador clave en múltiples enfermedades neurológicas. El estudio de la microglía humana en la salud y la enfermedad representa un desafío debido al suministro extremadamente limitado de células humanas. Las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) derivadas de individuos humanos pueden usarse para eludir esta barrera. Aquí, se demuestra cómo diferenciar las iPSC humanas en células similares a la microglía (iMG) para la experimentación in vitro . Estos iMG exhiben las propiedades esperadas y fisiológicas de la microglía, incluida la morfología similar a la microglía, la expresión de marcadores adecuados y la fagocitosis activa. Además, se proporciona documentación para aislar y etiquetar sustratos sinaptosómicos derivados de neuronas motoras inferiores derivadas de iPSC humanas (i3LMN). Se utiliza un ensayo de imagen longitudinal de células vivas para monitorear la absorción de sinaptosomas humanos marcados con un tinte sensible al pH, lo que permite investigaciones de la capacidad fagocítica de iMG. Los protocolos descritos en este documento son ampliamente aplicables a diferentes campos que investigan la biología de la microglía humana y la contribución de la microglía a la enfermedad.

Para generar iMGs utilizando este protocolo, es importante comenzar con iPSCs indiferenciadas que muestren morfología de colonia compacta con bordes bien definidos (Figura 2A). Las iPSC disociadas mantenidas como se describe en la sección de formación de EB formarán agregados esféricos, denominados EB, que crecerán en tamaño hasta el día 4 de diferenciación (Figura 2B). Una vez que los EB se recogen y chapan en las condiciones apropiadas para la generación de PM...

Este protocolo describe el proceso de diferenciación de células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC) en células similares a la microglía para la experimentación in vitro . También incluimos un procedimiento detallado para generar sinaptosomas humanos a partir de neuronas motoras inferiores derivadas de iPSC que se pueden usar como sustrato para ensayos de fagocitosis in vitro utilizando sistemas de imágenes de células vivas.

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple ...

La microglía derivada de iPS representa una fuente biológicamente relevante de microglía humana para la experimentación in vitro, y es una herramienta importante para investigar la biología de la microglía en la salud y la enfermedad. Presentamos un protocolo simple de diferenciación de microglia que requiere un uso mínimo de factores de crecimiento y logra una alta pureza y rendimiento. Además, demostramos un ensayo de fagocitosis completamente humanizado.Las células similares a la microglía derivadas de iPSC son muy sensibles a la evaporación de los medios. Debe evitar usar los pozos en la esquina de la placa de cultivo celular y llenar todos los pozos vacíos con agua para mejorar la supervivencia. Una vez que las células madre pluripotentes inducidas, o iPSC, hayan alcanzado el 80% de confluencia, disocie las colonias lavando con un mililitro de DPBS y agregando un mililitro de un reactivo de disociación durante dos minutos a 37 grados centígrados.Desaloje las colonias usando un elevador de células raspando varias veces para crear una suspensión de una sola célula. Recoja la suspensión y transfiérala a un tubo cónico de 15 mililitros que contenga nueve mililitros de DPBS. Luego

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Neurociencia

En este video, realizamos el ensayo de fagocitosis microglial para el neuroblastoma utilizando células madre pluripotentes inducidas. El ensayo ayuda a evaluar el deterioro de la función microglial en enfermedades neurodegenerativas.

Ensayo de fagocitosis microglial: un ensayo in vitro para establecer un modelo de fagocitosis microglial para células de neuroblastoma utilizando macrófagos iPSC

Este video muestra el procedimiento de diferenciación de células pluripotentes humanas en células similares a la microglía. El proceso consiste en formar cuerpos embrioides, transferirlos a pocillos recubiertos y utilizar factores de crecimiento específicos para guiar la diferenciación en precursores primitivos de macrófagos, que finalmente se diferencian en células similares a la microglía.

Diferenciación de células madre pluripotentes inducidas por el hombre en células similares a la microglía

Fuente: Funes, S., et. al., Células similares a la microglía humana: diferenciación de células madre pluripotentes inducidas y ensayo de fagocitosis de células vivas in vitro utilizando sinaptosomas humanos. J. Vis. Exp. (2022)Este video muestra un ensayo para estudiar la capacidad fagocítica de células similares a la microglía utilizando sinaptosomas marcados con colorantes fluorescentes sensibles al pH.

Ensayo de fagocitosis de células vivas de células similares a la microglía utilizando sinaptosomas humanos

La microglía son las células inmunes residentes del sistema nervioso central (SNC) con una alta capacidad de fagocitar o material de envolver en su entorno extracelular. Aquí, se describe un ensayo ampliamente aplicable, fiable, y altamente cuantitativo para visualizar y medir la microglia mediada por inmersión de componentes sinápticas.

Un ensayo de Inmersión en: Un Protocolo para Evaluar Interacciones entre CNS fagocitos y neuronas

Este protocolo presenta un en vitro en vivo-proyección de imagen de fagocitosis ensayo para medir la capacidad fagocitaria de los astrocitos. Microglia y astrocitos de rata purificados se utilizan junto con sinaptosomas conjugado con indicador de pH. Este método puede detectar cinética en tiempo real de la inmersión y la degradación y proporciona una plataforma de proyección adecuado para identificar factores de modulación de fagocitosis de los astrositos.

Un pH de novela In Vitro Live-proyección de imagen de ensayo de astrositos mediado fagocitosis usando sinaptosomas conjugado con indicador

Este protocolo es un método eficiente, rentable y robusto para aislar la microglia primaria del tejido cerebral humano vivo, adulto. La microglia humana primaria aislada puede servir como una herramienta para estudiar los procesos celulares en la homeostasis y la enfermedad.

Obtención de Microglia Humana del Tejido Cerebral Humano Adulto

Las enfermedades neurodegenerativas se asocian con funciones de microglía desreguladas. Este artículo describe un ensayo in vitro de fagocitosis de células de neuroblastoma por macrófagos iPSC. Las lecturas de microscopía cuantitativa se describen tanto para imágenes de lapso de tiempo de células vivas como para imágenes de alto contenido de células fijas.

Ensayo de imagen cuantitativa in vitro para la fagocitosis de células muertas de neuroblastoma por iPSC-Macrófagos

El protocolo presentado aquí permite el trasplante de microglía humana derivada de células madre pluripotentes inducidas (iPSMG) en el cerebro a través de una ruta transnasal en ratones inmunocompetentes. Se muestra el método para la preparación y trasplante transnasal de células y la administración de mezcla de citoquinas para el mantenimiento de iPSMG.

Trasplante de microglía derivada de células madre pluripotentes inducidas por humanos en ratones cerebros inmunocompetentes a través de una ruta transnasal no invasiva

Este estudio delinea un enfoque novedoso para el establecimiento de células similares a la microglía (iMG) derivadas de monocitos humanos que permiten la evaluación indirecta de la inflamación cerebral. Esto presenta un modelo celular que puede ser beneficioso para la investigación centrada en la posible inflamación del cerebro y los trastornos neuropsiquiátricos asociados.

Ingeniería de células similares a la microglía inducidas por sangre humana para la investigación traslacional inversa del cerebro

Presentamos un protocolo para generar un organoide cerebral humano con microglía residente mediante la incorporación de células progenitoras hematopoyéticas (HPC) derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) en el desarrollo de organoides.

Derivación de un organoide cerebral humano con desarrollo de microglía

Aprende a diferenciar células iPSC en microglía humana y realizar ensayos de fagocitosis con sinaptosomas humanos mediante imagen de células vivas. Este protocolo optimiza la viabilidad celular y la pureza para estudiar neuroinflamación.

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes (Video) | JoVE Journal

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

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