Name: Un método para estudiar la correlación entre la estructura local del colágeno y las propiedades mecánicas del tejido fibroso de la placa aterosclerótica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-11T13:50:00.000+00:00
Duration: 13 min 45 s
Description: Aprenda a evaluar la arquitectura del colágeno y las propiedades mecánicas del tejido fibroso de placa aterosclerótica mediante microscopía multifotónica y ensayos de tracción uniaxial. Este método integrado permite predecir eventos clínicos fatales por ruptura de placa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue financiado por una subvención NWO-Vidi (18360).

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

El estudio actual se centró en el desarrollo de una tubería de imágenes mecanográficas para estudiar la correlación entre la orientación y dispersión local del colágeno, las propiedades mecánicas locales y el comportamiento de ruptura del tejido fibroso de la placa aterosclerótica. El protocolo descrito en este documento es innovador por varias razones. En primer lugar, esta es la primera vez que se aplica la correlación de imágenes digitales para medir la deformación local del tejido de placa fibrosa bajo carga mecánica. En segundo lugar, este protocolo proporciona la información necesaria para analizar la asociación entre el patrón de deformación local y la arquitectura local de colágeno del tejido fibroso de la placa. La importancia de la evaluación local se enfatiza tanto por los datos de cepa como por los datos de colágeno presentados en la sección de resultados, que muestran la naturaleza heterogénea del tejido. Por lo tanto, se recomienda el uso de técnicas que permitan la evaluación local, como las utilizadas en este protocolo, para futuros estudios de las propiedades de la placa fibrosa.
La preparación de muestras de prueba es uno de los pasos críticos de este protocolo. Las placas carotídeas son principalmente tejidos colágenos; sin embargo, pueden contener calcificaciones que se considera que afectan el comportamiento mecánico general de la placa36,37. Como el estudio se centra en el componente de tejido fibroso de la placa, se evitan calcificaciones en las muestras de prueba mediante el uso de imágenes μCT38. Si la μCT no está disponible, se pueden considerar otras técnicas de imagen como la resonancia magnética o la OCT39 para detectar las regiones calcificadas en la placa. La obtención de muestras de prueba de tejido fibroso que estén libres de calcificaciones y sean de un tamaño lo suficientemente grande como para que sea viable para pruebas mecánicas puede ser una tarea difícil para las placas que están muy calcificadas o contienen calcificaciones dispersas. Otra tarea desafiante en el protocolo es generar un patrón de moteado óptimo para la correlación de imágenes digitales. El DIC óptimo requiere una relación blanco/negro de 50:5028 y motea el tamaño de tres a cinco píxeles29 para garantizar una calidad adecuada. El incumplimiento de estos requisitos puede dar lugar a mediciones de deformación local inexactas. Finalmente, mapear la ubicación de la ruptura con las imágenes de SHG puede ser un desafío si los puntos de referencia naturales de un tejido no están claros. Para tales muestras, la aplicación de varios marcadores fiduciales al tejido antes de la obtención de imágenes será útil.
La técnica MPM-SHG utilizada en el protocolo actual es superior a muchas otras técnicas de imagen de colágeno, ya que es una técnica de alta resolución y no destructiva con una profundidad de penetración relativamente grande. Sin embargo, la profundidad de penetración (<400 μm) de MPM-SHG plantea una limitación, ya que no permite obtener imágenes de todo el espesor de las muestras de prueba, que oscilaban entre 0,5 y 2 mm. En un estudio reciente con resonancia magnética con tensor de difusión (DT-MRI), hemos demostrado que la orientación predominante de la fibra en las partes más profundas del tejido de la placa puede ser diferente de la de las partes más superficiales y luminales del tejido14. Por lo tanto, se justifican estudios adicionales para investigar la arquitectura local del colágeno en las partes más profundas de las muestras gruesas de tejido fibroso y su relación con la mecánica tisular local. Para este propósito, se pueden utilizar imágenes polarizadas en el dominio de la frecuencia espacial (pSFDI). Se informó que esta técnica de imagen óptica recientemente desarrollada tiene el potencial de medir la orientación de la fibra a una profundidad de hasta 0,8 mm en las valvas de la válvula mitral12. El pSFDI también ofrece una adquisición rápida, lo que también podría facilitar la visualización de toda el área de muestra en lugar de solo una selección de mosaicos, como es el caso en el protocolo actual. Otra limitación del protocolo actual es que solo se puede identificar la deformación superficial. En estudios futuros, la DIC40 multivista asistida por espejo o la correlación digital de volumen (DVC)41 pueden incluirse en este protocolo para obtener información adicional sobre las deformaciones volumétricas del subsuelo.
El protocolo experimental actual se puede ampliar o modificar de varias maneras para obtener información adicional sobre la mecánica de ruptura de placa y su relación con la microestructura subyacente. En primer lugar, el protocolo actual incluye pruebas de tracción uniaxial en la dirección circunferencial. Se eligió este tipo de prueba mecánica ya que la placa experimenta predominantemente estiramiento por tracción en la dirección circunferencial in vivo. Para una caracterización mecánica más completa, este protocolo se puede ampliar aún más para incorporar pruebas de inflado, pruebas biaxiales o pruebas de tracción uniaxiales en la dirección longitudinal. En segundo lugar, el protocolo actual solo se centra en la obtención de cepas locales a través de CID. Sin embargo, se puede obtener una visión más completa del comportamiento mecánico de la placa al incluir también el análisis de estrés local en el protocolo, sin embargo, esto requiere la caracterización de la rigidez local. Aunque actualmente es un desafío, esto se puede lograr mediante técnicas computacionales como el método de elementos finitos inversos 42,43 y el método de campos virtuales44. Además de la adaptación experimental, también se pueden agregar algunos pasos adicionales de posprocesamiento al protocolo actual. En primer lugar, en lugar de identificar solo la ubicación de la ruptura, la ruta de propagación de grietas se puede identificar a través de las imágenes de cámara de alta velocidad obtenidas. Esta ruta de propagación se puede correlacionar con parámetros estructurales y mecánicos locales. En segundo lugar, la ubicación de inicio de la ruptura se identificó visualmente en el protocolo descrito. Un estudio previo sobre tejidos no biológicos ha utilizado discontinuidades en las mediciones de deformación DIC para detectar la ruptura45. La aplicación de dicha detección automatizada de rupturas en los tejidos de la placa puede mejorar la precisión de la detección de rupturas. Finalmente, una gran ventaja de MPM-SHG en comparación con otras técnicas de imagen de colágeno es que visualiza fibras de colágeno individuales. Por lo tanto, los datos obtenidos a través de este protocolo también se pueden utilizar para investigar características locales adicionales de colágeno, como el contenido de colágeno.
Este protocolo se puede utilizar para proporcionar una mejor comprensión de las características locales del tejido fibroso de la placa, el componente que falla mecánicamente en la ruptura de la placa in vivo. Esta información es necesaria para establecer nuevos marcadores de imagen estructurales y funcionales que predicen la ruptura de placa en los pacientes. Estos nuevos marcadores son necesarios, ya que los biomarcadores de riesgo previamente sugeridos han demostrado tener un valor predictivo subóptimo para futuros eventos clínicos 5,6. En el futuro, la OCT y la ps-OCT pueden identificar y cuantificar el tejido fibroso en el sistema arterial46,47,48. Además, la cepa fue considerada un marcador sustituto para la composición local de la placa49. Por lo tanto, las mediciones de deformación in vivo 49 podrían ayudar potencialmente en la identificación de la estabilidad de la placa en los pacientes. Sin embargo, se debe tener cuidado con la traducción directa de los resultados obtenidos a la ruptura de placa in vivo. En primer lugar, el tejido de la placa fibrosa experimenta una carga más compleja in vivo que la carga de tracción unidireccional utilizada en este protocolo. En segundo lugar, las placas ateroscleróticas son estructuras multicomponentes; Las distribuciones in vivo de estrés y deformación en el tejido fibroso de la placa pueden verse afectadas por la presencia y localización de los otros componentes de la placa, como las calcificaciones37.
Esta tubería de imágenes mecánicas también se puede utilizar para estudiar otros tejidos colágenos. Las pruebas mecánicas globales y las imágenes estructurales de colágeno ya se utilizan ampliamente para los tejidos biológicos. Sin embargo, la evaluación local de las propiedades previas y de falla, así como la arquitectura del colágeno, es fundamental para la caracterización mecánica precisa de tejidos fibrosos heterogéneos. Anticipamos que la estructura de este nuevo protocolo proporcionará más información sobre la interacción entre la microestructura y la mecánica de varios tejidos biológicos.

El accidente cerebrovascular isquémico, a menudo desencadenado por la ruptura de la placa aterosclerótica en las arterias carótidas, es una de las principales causas de mortalidad y morbilidad en todo el mundo1. Sin embargo, las estrategias actuales de planificación del tratamiento quirúrgico para prevenir el accidente cerebrovascular relacionado con la aterosclerosis carotídea no incluyen la evaluación del riesgo de ruptura de placa2. Esto se debe principalmente a que los biomarcadores de riesgo sugeridos anteriormente, como el grosor de la tapade la placa 3 yel tamaño 4 del núcleo lipídico, han demostrado tener un valor predictivo subóptimo para futuros eventos clínicos 5,6. Es necesaria una mejor comprensión de la mecánica de la placa y los mecanismos de ruptura para optimizar la evaluación del riesgo de ruptura de placa e identificar nuevos marcadores de riesgo de placas ateroscleróticas.
La ruptura de la placa es un evento mecánico local en el que el tejido de placa altamente fibroso no puede soportar la carga mecánica ejercida sobre él por la presión arterial y pierde su integridad estructural7. A pesar de esto, la mecánica del evento de ruptura de placa y su vínculo con la microestructura subyacente son poco conocidos8. Los pocos estudios experimentales que caracterizaron las características de insuficiencia tisular de la placa 9,10,11,12,13 informaron propiedades de ruptura mecánica macroscópica (es decir, deformación y resistencia a la falla de tracción final), derivadas con el supuesto de homogeneidad estructural del tejido. Sin embargo, el tejido fibroso de la placa es estructuralmente heterogéneo, posiblemente debido principalmente a la variación local en la arquitectura de la fibra de colágeno14. Además, el vínculo entre las características de falla mecánica del tejido de la placa y la arquitectura del colágeno solo se investigó en un estudio reciente de Johnston et al. Los autores mostraron una diferencia entre placas en la orientación predominante de la fibra y reportaron mayores tensiones finales y menores cepas finales para muestras de tapa de placa fibrosa con una orientación predominantemente circunferencialde fibra 15. Sin embargo, el estudio también se limitó a las propiedades mecánicas y estructurales brutas.
Para arrojar luz sobre la información esencial sobre la arquitectura local del colágeno y las propiedades mecánicas locales del tejido de la placa fibrosa, en el estudio actual, hemos desarrollado una tubería de mecano-imagen. Esta tubería ex vivo permite cuantificar la dirección y dispersión de la fibra de colágeno local, así como la tensión de ruptura local. La tubería incluye imágenes MPM con SHG para obtener imágenes de fibras de colágeno en el tejido de la placa, así como DIC y pruebas de tracción uniaxiales para cuantificar las características de ruptura del tejido.
La microscopía multifotónica-segunda generación armónica (MPM-SHG) se ha convertido en una técnica popular para estudiar el colágeno en tejidos biológicos16. La técnica tiene muchas ventajas en comparación con otras técnicas de imagen de colágeno, como la histología17, la imagen con tensor de difusión (DTI)14 y la dispersión de luz de ángulo pequeño (SALS)15. En primer lugar, las imágenes MPM-SHG no son destructivas, lo que las hace ideales para combinarlas con pruebas mecánicas18. En segundo lugar, la señal SHG es específica para el colágeno y, por lo tanto, no es necesario teñir el tejido. Debido a las longitudes de onda de excitación largas (infrarrojo cercano), la profundidad de penetración es mayor que con otras técnicas de microscopía16. La alta resolución (nivel μm) lograda con imágenes SHG también permite la visualización de fibras individuales. Esto ofrece muchas posibilidades, como la cuantificación local del número de fibras de colágeno, la orientación de la fibra de colágeno y la distribución19.
La correlación digital de imágenes (CID) combinada con pruebas mecánicas es un método ampliamente utilizado para obtener propiedades mecánicas locales de tejidos biológicos20. Con DIC, el desplazamiento de las manchas aplicadas en la superficie del tejido se rastrea comparando imágenes de cámara de alta velocidad adquiridas durante las pruebas mecánicas20. Este método de postprocesamiento de imágenes se utiliza para estimar las tensiones superficiales de campo completo de la muestra20 y también se puede utilizar para estudiar el comportamiento de ruptura del tejido21.

<table><tbody><tr><td>Anillo de extensión de 10 mm</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>CML10</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de 15 mL</td><td>VWR</td><td>525-0150</td><td></td></tr><tr><td>20x APO Objetivo de inmersión en agua</td><td>Leica</td><td>507701</td><td></td></tr><tr><td>3D Slicer Software</td><td>N/A</td><td>Versión 4.11</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 50 mL</td><td>VWR</td><td>525-0156</td><td></td></tr><tr><td>Pistola de aerógrafo AB 430- diámetro de la boquilla 0,3 mm</td><td>Conrad</td><td>4.01614E+12</td><td></td></tr><tr><td>Blackout, Tejido de nailon con Recubrimiento de poliuretano</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tinte tisú negro</td><td>Polysciences inc</td><td>24113-2</td><td></td></tr><tr><td>Lente de cámara, distancia focal 50 mm</td><td>Thorlabs Inc.</td><td></td><td></td>MVL50M1</tr><tr><td>Soporte de cámara</td><td>VWR</td><td>241-0093, 241-7311</td><td></td></tr><tr><td>Láser multifotónico Chameleon Ultra</td><td></td> Compresor coherente <td></td><td></td></tr><tr><td>+ manguera de aire</td><td>JUN-AIR, Conrad B07GB9HC62</td><td>, 4016138577198</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td></td><td>Microsoft versión 2208</td><td></td></tr><tr><td>Cinta de espuma de doble cara, 1,9 x 150 cm</td><td>Pattex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Baño calefactor</td><td>N/A</td><td></td> Cámara de alta velocidad <td>hecha a medida</td></tr><tr><td>+ software de imagen</td><td>Pixelink-Navitar Inc.</td><td>PL-D725</td><td></td></tr><tr><td>Placas ateroscleróticas carotídeas humanas (de cirugía de endarterectomía carotídea)</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imagen J</td><td>National Institute of Health</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>LAS-AF</td><td>Leica</td><td>versión 2.3</td><td>Microscopio multifotónico de software de imagen</td></tr><tr><td>LEICA TCS SP5 II</td><td>Microscopio Leica</td><td></td><td>utilizado para imágenes SHG</td></tr><tr><td>Sistema de iluminación</td><td>AMZ instruments</td><td>LED-60TB</td><td>Se utiliza para obtener imágenes nítidas con la cámara de alta velocidad</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>versión R2021A</td><td></td></tr><tr><td>Software FibLab basado en MATLAB</td><td>Universidad Tecnológica de Eindhoven</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Herramienta FOA (Fibre Orientation Analysis) basada en MATLAB</td><td>Universidad Tecnológica de Eindhoven</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Software Ncorr basado en</td><td>MATLAB Georgia Instituto de Tecnología</td><td>Versión 1.2</td><td></td></tr><tr><td>Agujas</td><td>Esmeralda</td><td>BDAM302986</td><td></td></tr><tr><td>placa de Petri (10 cm de diámetro)</td><td>VWR</td><td></td> BRND452000 <td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>291-1214</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur</td><td>VWR</td><td>ELKA127-P511-000</td><td></td></tr><tr><td>Quantum GX2 Micro tomografía computarizada (&mu; CT) escáner + filtro de rayos X de Cu 0,06 mm + Al 0,5 mm</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS149276</td><td></td></tr><tr><td>Regla</td><td>Fine Science Tools</td><td>1800030</td><td></td></tr><tr><td>Papel de lija (P180)</td><td>Conrad</td><td>4.00932E+12</td><td></td></tr><tr><td>Cortador lateral</td><td>Conrad</td><td>4.25084E+12</td><td></td></tr><tr><td>Base de elastómero de silicona y agente de curado (Sylgard 184)</td><td>VWR</td><td>634165S</td> Comprobador de <td></td></tr><tr><td>tracción + software + abrazaderas</td><td>N/A</td><td></td><td>Fabricadas internamente con un actuador lineal cilíndrico (EACM2E10AZAK, Oriental Motor Ltd.) y una célula de carga de 10 N (LCMFD-10N, Omega Engineering Inc.)</td></tr><tr><td>Destornillador dinamométrico</td><td>Garant, grupo Hoffman 659906</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un método para estudiar la correlación entre la estructura local del colágeno y las propiedades mecánicas del tejido fibroso de la placa aterosclerótica

A Method to Study the Correlation Between Local Collagen Structure and Mechanical Properties of Atherosclerotic Plaque Fibrous Tissue

La ruptura de placas ateroscleróticas en las arterias coronarias y carótidas es la causa principal de eventos cardiovasculares fatales. Sin embargo, la mecánica de ruptura del tejido heterogéneo y altamente colágeno de la placa, y cómo esto se relaciona con la estructura fibrosa del tejido, aún no se conocen. Las tuberías existentes para estudiar la mecánica de la placa se limitan a obtener solo características mecánicas brutas del tejido de la placa, basadas en el supuesto de homogeneidad estructural del tejido. Sin embargo, el tejido de la placa fibrosa es estructuralmente heterogéneo, posiblemente debido principalmente a la variación local en la arquitectura de la fibra de colágeno.
La tubería de imágenes mecanográficas descrita aquí se ha desarrollado para estudiar las propiedades heterogéneas estructurales y mecánicas de la placa. En esta tubería, la arquitectura de colágeno local del tejido se caracteriza utilizando microscopía multifotónica (MPM) con segunda generación armónica (SHG), y el comportamiento de falla del tejido se caracteriza bajo condiciones de prueba de tracción uniaxial utilizando análisis de correlación de imagen digital (DIC). Esta tubería experimental permite la correlación del ángulo predominante local y la dispersión de la orientación de la fibra de colágeno, el comportamiento de ruptura y las huellas dactilares de tensión del tejido de la placa fibrosa. El conocimiento obtenido es clave para comprender, predecir y prevenir mejor los eventos de ruptura de placa aterosclerótica.

Recolección de tejido y preparación de muestras de prueba La colección de tejido produce muestras de tejido fibroso de placa que se pueden diseccionar en muestras de prueba individuales para imágenes estructurales y pruebas de tracción uniaxial. Idealmente, una muestra de tejido fibroso recolectada contiene áreas con poco o ningún desgarro (Figura 5A) y macrocalcificaciones (Figura 5B). Un exceso de estos desgarros y calcificaciones (Figura 5C) puede dar lugar a muestras de placa que no cumplen con el requisito de dimensión de la muestra mencionado anteriormente de WL 1.
Imágenes de microscopía multifotónica Las imágenes de SHG y el posprocesamiento de imágenes proporcionan MIP de cada mosaico de imagen (Figura 6A, B). El postprocesamiento adicional mediante detección de fibra (Figura 6C) produce histogramas de orientación de fibra (Figura 6D) de los cuales se pueden extraer parámetros estructurales de colágeno (Figura 6E). Además, se pueden obtener mapas de color que muestran los parámetros estructurales locales de colágeno en toda la muestra de placa para el análisis visual (Figura 6F, G). Para la muestra de ensayo representativa de la figura 6, se encuentra una gran variación intramuestra en los parámetros estructurales del colágeno (media ± DE de μ p = -34° ± 32°; σp = 21° ± 4°; Pani = 0,49 ± 0,14, si la dirección circunferencial se define como 0°). Esta variación intramuestra enfatiza la importancia de obtener parámetros estructurales locales en lugar de asumir homogeneidad.
Ensayos mecánicos Comportamiento de ruptura La cámara de alta velocidad proporciona imágenes del comportamiento de deformación y ruptura de las muestras de placa durante las pruebas mecánicas (Figura 7). A partir de estas imágenes, se puede identificar la ubicación del inicio de la ruptura y la trayectoria de propagación de la ruptura. Los resultados de identificación de ruptura son subóptimos si hay burbujas o reflejos en las imágenes de la cámara, o si la ruptura se propaga demasiado rápido para ser capturada por la velocidad de fotogramas elegida.
Patrones de cepas locales El análisis de correlación de imágenes digitales en las grabaciones de cámara adquiridas durante la prueba de tracción uniaxial proporciona los mapas locales de deformación tisular, como los mapas de deformación de Green-Lagrange que se muestran en la Figura 8. Estos mapas muestran los tres componentes de deformación (εxx, εxy y ε yy) en el fotograma antes del inicio de la ruptura. A partir de estos mapas de cepas, se pueden extraer las cepas promedio en una región de interés y la cepa local en un lugar, como la ubicación de la ruptura.
Para la muestra representativa de la Figura 8, los datos de la cepa local muestran una gran variación intramuestra. Para la muestra de ensayo representativa de la figura 8, se encuentra una gran variación intramuestra en las cepas locales (los rangos de las cepas observadas son los siguientes: εxx = -0,30-0,17; εxy = -0,13-0,20; εyy = 0-0,40). Esto enfatiza la importancia de obtener datos locales en lugar de valores brutos y promedio obtenidos con el supuesto de homogeneidad tisular.
Correlación de la información del tejido mecánico y estructural Los resultados mencionados anteriormente permiten la asociación de la deformación local y el comportamiento de ruptura del tejido a la arquitectura del colágeno. Una vez que se identifica la ubicación de la ruptura en las grabaciones de la cámara (Figura 9A), se puede asignar de nuevo a la imagen de la cámara de referencia (Figura 9B) y a la exploración de mosaico de microscopía (Figura 9C). Esto proporciona la baldosa MPM-SHG donde ocurrió la ruptura y los parámetros estructurales encontrados en esta baldosa (Figura 9D). Los parámetros estructurales encontrados en la baldosa donde ocurrió la ruptura en una muestra representativa, mostrados en la Figura 9, sonμ p = 28°, σp = 19° y Pani = 0.6. El mismo procedimiento también se puede aplicar a las ubicaciones de tejido no roto. Es importante tener en cuenta que mapear la ubicación de ruptura en la imagen de referencia del marco de ruptura puede ser un desafío en caso de un patrón de moteado deficiente y puntos de referencia naturales poco claros. Además, si los puntos de referencia naturales del tejido no son lo suficientemente claros, el registro conjunto de la superposición de escaneo de mosaicos y las imágenes de la cámara de alta velocidad puede ser difícil.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64334/64334fig01.jpg"> Figura 1: Gráfico de flujo de trabajo del protocolo experimental presentado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64334/64334fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64334/64334fig02.jpg"> Figura 2: Selección de mosaicos para imágenes SHG del escaneo de mosaicos . (A) Muestra de prueba fijada en silicio. (B) Escaneo en mosaico de la muestra de prueba obtenida por microscopía de campo claro. Los mosaicos seleccionados para la creación de imágenes SHG están marcados con cuadrados azules. (C) Proyección de intensidad máxima del MPM con SHG. Barra de escala = 140 μm (C). Abreviaturas: SHG = segunda generación armónica; MPM = microscopía multifotónica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64334/64334fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64334/64334fig03.jpg"> Figura 3: Muestra de placa colocada bajo el objetivo del microscopio multifotónico. La ubicación de la muestra de placa está asegurada por una placa de Petri llena de solución salina tamponada con fosfato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64334/64334fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64334/64334fig04.jpg"> Figura 4: Probador de tracción uniaxial diseñado a medida con sus diferentes componentes indicados . (A) Visión general total del sistema. Tenga en cuenta que los insertos de papel de lija en las abrazaderas son visibles, ya que solo se adjuntan las abrazaderas inferiores. (B) Imagen ampliada de las abrazaderas del probador de tracción con la muestra de prueba lista para la prueba. Abreviaturas: PVC = cloruro de polivinilo; LED = diodo emisor de luz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64334/64334fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64334/64334fig05.jpg"> Figura 5: Resultados de la recolección de tejido y la preparación de muestras a partir de muestras representativas . (A) Muestra de placa fresca e intacta, recuperada de pacientes que dieron su consentimiento y que se sometieron a cirugía de endarterectomía carotídea. (B) Reconstrucción 3D a partir de una tomografía computarizada μ. El tejido calcificado se muestra en azul claro y no calcificado en rojo. Se podría obtener una muestra óptima sin tejido calcificado del área entre las líneas azules. (C) Reconstrucción 3D de la tomografía computarizada μ que muestra una placa subóptima con un exceso de tejido calcificado. Barra de escala = 3 mm. Abreviatura: μCT = tomografía microcomputarizada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64334/64334fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64334/64334fig06.jpg"> Figura 6: Resultados de MPM-SHG de una muestra representativa. (A) Descripción general del escaneo de mosaicos; Los mosaicos seleccionados para la creación de imágenes se muestran en azul. (B) MIP de varios mosaicos. (C) Detección de fibra por la herramienta FOA de una baldosa seleccionada . (D) Histograma de orientación de fibra de una baldosa seleccionada. (E) Histograma de orientación de fibra + ajuste gaussiano, del cual se pueden extraer parámetros estructurales de colágeno de una baldosa seleccionada. (F) Representación de la μ p (línea negra de orientación) y σp (color de fondo) en toda la muestra de placa. (G) Representación de la μp (línea negra de orientación) y Pani (color de fondo) en toda la muestra de placa. Barras de escala = 140 μm (B,C). Abreviaturas: MPM-SHG = microscopía multifotónica-segunda generación armónica; PDM = proyecciones de intensidad máxima; FOA = análisis de orientación de fibra; μp = ángulo de fibra predominante; Pani = fracción anisotrópica; σp = desviación estándar de la distribución del ángulo de la fibra; Piso = fracción isotrópica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64334/64334fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64334/64334fig07.jpg"> Figura 7: Inicio y propagación de la ruptura en una muestra de tejido de placa durante el procedimiento de prueba de tracción.1) Estado preestirado, tejido intacto. 2) Iniciación de la ruptura: primer marco en el que se observa la ruptura. La ubicación de inicio de la ruptura está marcada con un cuadrado rojo. 3 ) y 4) Propagación de la ruptura. 5) Ruptura completa de la muestra de placa. Barras de escala = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64334/64334fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64334/64334fig08.jpg"> Figura 8: Patrones de deformación de Green-Lagrange de una muestra representativa (εxx, εxy yε yy) en el marco antes de la ruptura, obtenidos con análisis DIC. Se da una desviación media y estándar sobre toda la placa, junto con la tensión en el lugar de la ruptura. Abreviaturas: DIC = correlación de imagen digital; εxx = deformación longitudinal; εxy = cizalladura; εyy = deformación a tracción. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64334/64334fig08large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64334/64334fig09.jpg"> Figura 9: Imagen superpuesta de la ubicación de ruptura (cuadrado rojo) en las imágenes. (A) Imagen de cámara de alta velocidad, donde se identifica la ruptura (marco de ruptura). (B) Imagen de cámara de alta velocidad, donde solo se aplica preestiramiento (sistema de referencia). (C) La imagen de escaneo de mosaico obtenida mediante microscopía. (D) Un mapa codificado por colores que muestra los parámetros estructurales locales de colágeno en varias baldosas. Se presentan los μp (línea negra de orientación) y Pani (color de fondo) en toda la muestra de placa. Abreviaturas: μp = ángulo de fibra predominante; Pani = fracción anisotrópica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64334/64334fig09large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Hemos desarrollado una tubería de imágenes mecanológicas para estudiar las propiedades heterogéneas estructurales y mecánicas de la placa aterosclerótica. Esta tubería permite la correlación del ángulo predominante local y la dispersión de la orientación de la fibra de colágeno, el comportamiento de ruptura y las huellas dactilares de tensión del tejido de la placa fibrosa.

Un método para estudiar la correlación entre la estructura local del colágeno y las propiedades mecánicas del tejido fibroso de la placa aterosclerótica

The rupture of atherosclerotic plaques in coronary and carotid arteries is the primary cause of fatal cardiovascular events. However, the rupture ...

Este protocolo permite las evaluaciones locales tanto de la arquitectura del colágeno como de las características de falla mecánica del tejido fibroso de la placa. Dado que las evaluaciones estructurales y mecánicas se realizaron en la misma muestra de tejido, esta técnica permite desentrañar el vínculo funcional entre las evaluaciones estructurales y mecánicas del tejido. El conocimiento obtenido con este protocolo sobre la estructura del tejido de la placa fibrosa y las características de fallo es clave para prevenir y predecir eventos clínicos fatales desencadenados por la ruptura de la placa aterosclerótica.Para comenzar, corte la placa abierta a lo largo del eje longitudinal de la arteria con tijeras quirúrgicas y pinzas. Recorte muestras de prueba rectangulares de las muestras de placa, asegurándose de que las muestras sean lo más grandes posible y evitando las regiones de tejido que contienen desgarros o calcificaciones. Luego, tome una muestra de prueba de placa y fije ambos extremos a la silicona clavando agujas en el tejido.Inserte las agujas en la región de la muestra que estará en las abrazaderas del dispositivo de prueba de tracción durante la prueba mecánica. Póngase gafas de seguridad. Use un cortador lateral para acortar las agujas de modo que sobresalgan a menos de unos pocos milímetros por encima de la superficie de la muestra para evitar que dañen el objetivo del microscopio.Llene la placa de Petri con PBS hasta que la muestra esté sumergida. A continuación, encienda el sistema de microscopio, gire la tecla multifotónica y abra el software operativo del microscopio. Coloque la placa de Petri que contiene la muestra de prueba debajo del objetivo y baje el objetivo del microscopio.Active el modo de escaneo en vivo. Mueva el objetivo a una esquina de la muestra con las perillas del panel inteligente y haga clic en el símbolo de posición de marca en el panel Escaneo de mosaico. Si se realiza correctamente, aparecerá una cuadrícula con todos los mosaicos seleccionados para la creación de imágenes en naranja.A continuación, haga clic en Inicio en la esquina inferior derecha de la pantalla para crear un escaneo en mosaico de toda la superficie de la muestra para obtener una visión general de la geometría de la muestra. Después del escaneo de mosaicos, observe las coordenadas X e Y de la esquina superior izquierda del mosaico superior izquierdo en el panel Escaneo de mosaico que se muestra automáticamente. Anote estas coordenadas en una hoja de cálculo.En el panel Escaneo de mosaico, observe el número de mosaicos en las direcciones X e Y en el cuadro denominado ScanField. Tenga en cuenta el tamaño del escaneo de mosaico en la hoja de cálculo. Calcula las coordenadas de los otros mosaicos sumando o restando el tamaño del mosaico.En el escaneo de mosaicos, seleccione los mosaicos que se van a fotografiar con una segunda generación de armónicos o imágenes SHG. Para la selección, evite las baldosas en las abrazaderas y deje una baldosa entre cada baldosa seleccionada tanto en la dirección longitudinal como en la circunferencial. A continuación, identifique la ubicación de los mosaicos de los que se va a crear una imagen utilizando las coordenadas calculadas en esta hoja de cálculo.Rellene las coordenadas en los cuadros designados y haga clic en Entrar para que el objetivo se mueva al mosaico derecho. Active el modo de escaneo en vivo. Aumente la potencia del láser multifotón, o MP, utilizando el control deslizante en el panel superior y la configuración de la trayectoria del haz para obtener la mayor potencia láser posible sin blanqueamiento significativo.Luego, ajuste la ganancia del detector para obtener imágenes brillantes sin píxeles saturados utilizando la perilla en el panel inteligente o haciendo clic en el nombre del detector y la configuración de la trayectoria del haz y canales adicionales. Los valores típicos para la ganancia del detector están entre 500 y 800 voltios. Utilice la perilla de posición Z del panel inteligente para ajustar el plano de enfoque.A continuación, desplácese a la parte superior de la muestra y establezca las posiciones de la parte superior de la pila Z haciendo clic en la punta de flecha en el panel de la pila Z en la pestaña Adquisición del tercer panel. Luego, concéntrese en la muestra hasta que ya no se detecte la señal SHG. Nuevamente, haga clic en la punta de flecha en el panel Z-stack para establecer esta posición.Cuando haya terminado, desactive el modo de escaneo en vivo. En la pestaña Adquisición del segundo panel, mantenga la velocidad de escaneo en 400 hercios, establezca el promedio de línea en dos y la resolución en 512 por 512 píxeles por imagen utilizando las listas desplegables. Active el botón de escaneo X bidireccional.Haga clic en el tamaño del paso z en el panel de la pila Z y rellene un tamaño de paso z de tres micras en el cuadro. Haga clic en Inicio en la esquina inferior derecha de la pantalla para crear una pila Z. Cuando haya terminado, guarde las coordenadas del mosaico en el nombre del archivo o asigne a cada mosaico su número.Después de la obtención de imágenes, la muestra se expone a pruebas mecánicas. Para generar un patrón de spackle, sostenga el aerógrafo lleno de tinte de tejido a aproximadamente 30 centímetros de distancia de la muestra de prueba y rocíelo sobre la superficie lumenal. A continuación, para la prueba de tracción uniaxial, coloque la muestra en las abrazaderas del probador de tracción con la dirección circunferencial de la muestra alineada con la dirección de estiramiento de tracción y el lado lumenal de la muestra hacia arriba.Asegúrese de que la longitud del calibre inicial esté configurada de modo que la relación ancho-longitud de la tira sea inferior a uno. Apriete los tornillos de las empuñaduras aplicando un par de 20 centímetros metros utilizando un destornillador dinamométrico. Agregue PBS al baño de calentamiento hasta que la muestra esté sumergida.Desgarre la célula de carga y comience a registrar las mediciones globales de fuerza y desplazamiento de la célula de carga y el actuador del probador de tracción. Enderezar la muestra aplicando un preestiramiento de 0,05 newton para eliminar la holgura de la muestra. Realice 10 ciclos de preacondicionamiento, hasta un 10% de deformación, según la medición de la longitud del medidor por el actuador después de la aplicación del preestiramiento.Inicie la prueba de tracción uniaxial hasta que falle completamente la muestra mientras graba un video de la deformación de la muestra con la cámara de alta velocidad. Después del fracaso, deje de registrar las mediciones globales de fuerza y desplazamiento. Abra las pilas Z obtenidas durante la microscopía multifotónica, o MPM, con SHG en la Imagen J y cree proyecciones de intensidad máxima, o MIP, de cada pila Z.Analice cada MIP con la herramienta de análisis de orientación de fibra basada en MATLAB de código abierto para medir el ángulo de orientación de las fibras de colágeno individuales presentes en las baldosas. Utilice otra herramienta basada en MATLAB, FibLab, para ajustar una distribución gaussiana al histograma de distribución de ángulos. De la gráfica de distribución gaussiana, extraiga los parámetros estructurales como el ángulo de fibra predominante, que es el modo de la distribución, la desviación estándar de la distribución del ángulo de fibra y la fracción anisotrópica.Realice una inspección visual de las imágenes de la cámara para identificar el fotograma en el que se produce el inicio de la ruptura. Identifique visualmente la ubicación de la ruptura. Realice el análisis de correlación de imágenes digitales, DIC, con software basado en MATLAB utilizando las imágenes de la cámara grabadas durante la prueba de tracción.Seleccione el último fotograma antes del estiramiento final hasta el error como imagen de referencia. Para las imágenes actuales, seleccione todas las imágenes desde el inicio del estiramiento final hasta el último fotograma antes del fotograma en el que se produjo el inicio de la ruptura. Seleccione la superficie de muestra como región de interés o ROI.Excluya las áreas que están cerca de las abrazaderas. Realice DIC estableciendo el radio del subconjunto del parámetro en 30 píxeles, el espaciado entre subconjuntos en tres píxeles, el límite de iteración en 50, la norma del límite del vector de diferencia en 10 para la potencia de cinco, el radio de deformación para cinco y el paso de autopropagación para cinco. A partir del análisis DIC con ncorr, obtener las distribuciones de cepas de Green-LaGrange o Eulerian del ROI.Utilice estas distribuciones de deformación para calcular la tensión promedio de Green-LaGrange de toda la superficie de la muestra de placa en el último fotograma antes de la ruptura. Calcule la tensión de Green-LaGrange en el lugar de ruptura. Utilizando los puntos de referencia naturales de la muestra de prueba, realice una superposición de la imagen de referencia y el escaneo de mosaico para identificar la ubicación de ruptura en el escaneo de mosaico.Identifique el mosaico MPM-SHG donde ocurrió la ruptura. Si la ruptura no está en una baldosa escaneada con el MPM-SHG, identifique la baldosa más cercana a la ubicación de la ruptura. Obtenga los parámetros estructurales encontrados en la baldosa donde ocurrió la ruptura.Aquí se muestra una muestra de placa fresca e intacta con poco o ningún desgarro y macrocalcificaciones. Las muestras de placa pueden recuperarse de áreas que no incluyen estos desgarros y calcificaciones. Las imágenes SHG y el posprocesamiento de imágenes proporcionan MIP de cada mosaico de imagen.El postprocesamiento adicional mediante detección de fibra produce histogramas de orientación de fibra de los cuales se pueden extraer parámetros estructurales de colágeno. Además, se obtienen mapas de color que muestran los parámetros estructurales locales de colágeno en toda la muestra de placa para el análisis visual. A partir de estas muestras de ensayo, se observó una gran variación intramuestra en los parámetros estructurales de colágeno.El inicio de la ruptura y la propagación en una muestra de tejido de placa durante la prueba de tracción se demuestran aquí. El análisis de correlación de imágenes digitales proporciona mapas locales de deformación tisular, como los mapas de cepas de Green-LaGrange. A partir de estos mapas de cepas, se observó una gran variación intramuestra en las cepas locales.Una vez que se identifica la ubicación de ruptura en las grabaciones de la cámara, se puede asignar de nuevo a la imagen de referencia de la cámara y al escaneo de mosaico de microscopía. Esto proporciona la baldosa MPM-SHG donde ocurrió la ruptura y los parámetros estructurales encontrados en esta baldosa. La obtención de muestras de tejido fibroso que están libres de calcificaciones y son de un tamaño lo suficientemente grande para trabajar para pruebas mecánicas puede ser una tarea difícil para las placas fuertemente calcificadas.Una vez que se identifica una característica mecánica o estructural como predictor de insuficiencia del tejido de la placa fibrosa, un sistema de imágenes in vivo que mida esta característica permitirá predecir el riesgo de ruptura de placa en pacientes.

a-method-to-study-correlation-between-local-collagen-structure

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Describimos procedimientos para cuantificar y caracterizar lesiones ateroscleróticas en modelos de ratón utilizando el corte de precisión del seno aórtico y la aorta ascendente combinado con análisis histoquímico e inmunohistoquímico.

Análisis cuantitativo y caracterización de lesiones ateroscleróticas en el seno aórtico murino

Se presenta en este artículo una plataforma novela de estiramiento que se puede utilizar para investigar las respuestas de células individuales a complejo deformación mecánica biaxial anisotrópico y cuantificar las propiedades mecánicas de los tejidos biológicos.

Una Plataforma Novela Estiramiento para Aplicaciones en Celular y Tisular Mecanobiología

Describimos el uso de la correlación de imágenes digitales para caracterizar el campo de deformación superficial local en muestras de tejido vascular sometidas a ensayos de tracción uniaxial. Estas mediciones facilitan la cuantificación precisa de la respuesta mecánica de la muestra y la generación de relaciones constitutivas tensión-deformación.

El uso de Correlación Digital de Imágenes para caracterizar cepas locales en muestras de tejido vascular

Describimos prueba mecánica simultánea y proyección de imagen 3D de la pared arterial de aislados, viven las arterias de resistencia humana y Fiji y Ilastik análisis de imagen para la cuantificación de colágeno y elastina densidades organización y volumen espaciales. Discutimos el uso de estos datos en modelos matemáticos de la mecánica de la pared arterial.

Evaluación de colágeno y elastina Microarchitectures dependiente de la presión en las arterias de resistencia viva, humana por microscopía de fluorescencia etiqueta-libre

Proponemos un protocolo estandarizado para caracterizar la composición celular de etapa tardía las lesiones ateroscleróticas murinas como métodos sistemáticos de disección animal, tejido inclusión, seccionamiento, tinción y análisis de las arterias braquiocefálicas de atheroprone músculo liso células linaje seguimiento ratones.

Análisis cuantitativo de la composición celular en las lesiones ateroscleróticas avanzadas de músculo liso células linaje trazado ratones

Los modelos murinos de aterosclerosis son herramientas útiles para investigar vías patógenas a nivel molecular, pero requieren una cuantificación estandarizada del desarrollo de lesiones. Este protocolo describe un método optimizado para determinar el tamaño de la lesión en los vasos arteriales principales, incluyendo la raíz aórtica, el arco aórtico y la arteria braquiocéfala.

Cuantificación de la aterosclerosis en ratones

Es necesario determinar qué lesiones ateroscleróticas progresarán en la vasculatura coronaria para guiar la intervención antes de que ocurra el infarto de miocardio. Este artículo describe el modelado biomecánico de arterias a partir de la tomografía de coherencia óptica utilizando técnicas de interacción fluido-estructura en un solucionador comercial de elementos finitos para ayudar a predecir esta progresión.

Tomografía de coherencia óptica basada en el análisis de interacción fluido-estructura biomecánica de la progresión de la aterosclerosis coronaria

Las imágenes de ultrasonido intravascular in vivo muestran el movimiento de la sección transversal coronaria correspondiente a diferentes condiciones de carga de presión. Sobre la base de un modelo de elementos finitos, se empleó un esquema iterativo para determinar las propiedades mecánicas específicas del paciente de las arterias coronarias in vivo mediante la comparación del movimiento coronario del modelo computacional y las imágenes médicas.

Enfoque de modelado de elementos finitos basado en imágenes de ultrasonido intravascular para cuantificar in vivo las propiedades mecánicas de la arteria coronaria humana 

Este protocolo proporciona una metodología integral para el análisis cuantitativo de las placas ateroscleróticas para facilitar una investigación más profunda sobre los mecanismos y la progresión de la aterosclerosis.

Aislamiento y análisis de lesiones del arco aórtico y la raíz en un modelo de ratón aterosclerótico

Un biorreactor presión cíclica capaz de someter a los tejidos del corazón de la válvula de presión a las condiciones fisiológicas y patológicas ha sido diseñado. Un programa LabVIEW permite a los usuarios para controlar la presión magnitud, amplitud y frecuencia. Este dispositivo puede ser utilizado para estudiar el tejido mecanobiología de las válvulas del corazón o células aisladas.

Diseño de un biorreactor de presión cíclica de la Ex Vivo Estudio de las válvulas aórtica del corazón

Aprenda a evaluar la arquitectura del colágeno y las propiedades mecánicas del tejido fibroso de placa aterosclerótica mediante microscopía multifotónica y ensayos de tracción uniaxial. Este método integrado permite predecir eventos clínicos fatales por ruptura de placa.

Un método para estudiar la correlación entre la estructura local del colágeno y las propiedades mecánicas del tejido fibroso de la placa aterosclerótica (Video) | JoVE Journal

Un método para estudiar la correlación entre la estructura local del colágeno y las propiedades mecánicas del tejido fibroso de la placa aterosclerótica

Explorar más videos