Name: Mediciones similares a un potencial de acción inducida por láser de cardiomiocitos en matrices de microelectrodos para una mayor predictividad de la farmacología de seguridad (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T14:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Aprende a registrar potenciales de acción intracelulares en cardiomiocitos mediante poración láser en matrices de microelectrodos. Este método mejora la clasificación de potenciales pro-arrítmicos y la evaluación de seguridad farmacológica cardiaca.

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Los autores desean agradecer a Foresee Biosystems por prestar el sistema IntraCell durante los estudios. También desean agradecer a Hae In Chang por la asistencia técnica. Este trabajo ha recibido financiación del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea bajo el acuerdo de subvención no. 964518 (ToxFree), del Programa del Consejo Europeo de Innovación Horizon Europe de la UE, el proyecto SiMulTox (acuerdo de subvención No 101057769) y del Ministerio de Estado de Baden-Wuerttemberg para Asuntos Económicos, Trabajo y Turismo.

1. Preparación inducida de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes
NOTA: Los cardiomiocitos iCell2 (denominados cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas [iPSC]) se prepararon de acuerdo con el protocolo proporcionado por el proveedor. El protocolo se resumirá brevemente en la siguiente sección.
<ol><li>Pura de descongelación y mantenimiento del medio a 4 °C durante 24 h antes de su uso.</li>
	<li>Preparar el recubrimiento de fibronectina disolviendo la fibronectina estéril en agua estéril a una concentración de 1 mg/ml. Congelar este stock en alícuotas (por ejemplo, 25 μL por alícuota). Diluir la solución madre alicotizada 1:20 en la solución salina balanceada (dPBS) estéril de Dulbecco.</li>
	<li>Cubra los campos de electrodos de los MEA previamente esterilizados en autoclave bajo la campana de flujo laminar, en forma de gota en condiciones estériles con fibronectina utilizando una pipeta de 10 μL. Para esto, deje caer 5 μL de la solución de recubrimiento de fibronectina sobre los campos de electrodos y observe la formación de una gota en la parte superior del área del electrodo. Asegúrese de no tocar los electrodos sensibles. NOTA: Para mantener condiciones estériles, transfiera el chip MEA a una placa de Petri estéril antes de retirarlo de la campana de flujo laminar.</li>
	<li>Incubar los MEA recubiertos durante 1 h a 37 °C en una incubadora preferiblemente.</li>
	<li>Descongele el criovial que contiene los cardiomiocitos en un baño maría a aproximadamente 37 °C durante 2 min hasta que solo quede un poco de cristal de hielo. Transfiera la solución celular suavemente a un tubo de 50 ml.</li>
	<li>Agregue 1 ml de medio de recubrimiento al criovial vacío. Transfiera la solución gota a gota durante un período de tiempo de 90 s en el tubo de 50 ml para reducir el choque osmótico. Agregue suavemente 8 ml adicionales de medio de recubrimiento en el tubo.</li>
	<li>Mezclar la suspensión celular cuidadosamente con una pipeta de 10 ml. Calcule el número total de células viables utilizando citometría de fluorescencia automatizada. El número debe estar cerca del número en la hoja de datos proporcionada por el fabricante.</li>
	<li>Girar la solución celular durante 3 minutos a 200 x g a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante por aspiración utilizando una pipeta de vidrio conectada a un sistema de bombeo. Ajustar el número de células entre 6.000 y 15.000 células viables/μL. NOTA: El número de celdas suele estar en el rango indicado anteriormente, pero puede variar según el proveedor respectivo.</li>
	<li>Retire la solución de recubrimiento que se aplicó en el paso 1.3 del área del electrodo MEA utilizando una pipeta de 10 μL directamente antes de la siembra celular. Sembrar las células inmediatamente después de la eliminación para evitar el secado del recubrimiento. Para esto, siembre las células gota a gota a 4 μL para MEA de 6 pocillos y MEA de 1 pozo en los campos de electrodos de la misma manera que se hace con el recubrimiento.</li>
	<li>Deje que las células se adhieran durante 1 h en la incubadora a 37 °C y 5% deCO2 antes de llenar los pocillos con el medio estéril calentado a aproximadamente 37 °C a 200 μL para MEA de 6 pocillos y 1 ml para MEA de un solo pozo debajo de la campana de flujo laminar.</li>
	<li>Realice un cambio completo del medio 48 h después del recubrimiento debajo de la campana de flujo laminar. Para ello, retire el medio de recubrimiento por aspiración utilizando una pipeta de vidrio conectada a un sistema de bombeo. Luego, agregue 200 μL de medio de mantenimiento estéril calentado a 37 ° C a los pocillos.</li>
	<li>Realice cambios medios completos cada dos días.</li>
	<li>Comience a medir las células 5-8 días después de la descongelación. Realizar un cambio completo del medio 2 h antes de comenzar los experimentos.</li>
</ol>2. Grabaciones MEA
NOTA: El dispositivo utilizado para transformar la señal FP a liAP consiste en un microscopio vertical y un láser de 1064 nm.
<ol><li>Coloque el sistema MEA en la parte superior del dispositivo con el soporte del chip MEA centrado sobre el orificio del objetivo. Coloque la configuración MEA de modo que el objetivo esté directamente debajo del orificio del sistema MEA para permitir que el láser se enfoque en los electrodos.</li>
	<li>Transfiera el chip MEA con las células cultivadas de la incubadora a la configuración MEA 15 minutos antes de la grabación, lo que permite que las células se recuperen de la perturbación mecánica.</li>
	<li>Limpie cuidadosamente las almohadillas de contacto y los alfileres con isopropanol y un hisopo de algodón para disminuir los niveles de ruido. Coloque el MEA cuidadosamente en la configuración de MEA. Coloque el chip MEA con el logotipo en la parte inferior superior izquierda (MEA de 6 pocillos) o con el electrodo de referencia a la izquierda (MEA de un solo pozo).</li>
	<li>Ajuste la calefacción integrada en el sistema MEA a 38 °C. Coloque una pequeña cámara en la parte superior del chip MEA para perfundir constantemente las células con carbógeno humidificado (5% CO2 y 95%O2) para recrear las condiciones de la incubadora y evitar la evaporación.</li>
	<li>Cierre la tapa del dispositivo. El interruptor de seguridad integrado solo permite activar el láser si la tapa está cerrada sobre el chip MEA. Establezca el filtro del sistema MEA mediante el programa de configuración MEA en 0,1 Hz o menos paso alto y paso bajo de 3.500 Hz.</li>
	<li>Utilice el software MC_Rack (software de grabación) o cualquier software alternativo para la grabación. Ajuste el rango de entrada de acuerdo con sus necesidades asegurándose de que la señal no sature el amplificador y la frecuencia de muestreo (por ejemplo, 20 kHz). Utilice la función de visualización a largo plazo del software para comprobar la grabación.</li>
</ol>3. Poración celular inducida por láser
<ol><li>Después de insertar el chip MEA en la configuración de MEA y configurar el software, inicialice la mecánica láser utilizando el software FB Alps (software de inicialización).</li>
	<li>Primero, haga clic en el botón Inicialización . Al final de la inicialización, el punto láser virtual estará en el pozo D para un MEA de 6 pocillos y en la parte inferior izquierda para un MEA de un solo pozo, respectivamente.</li>
	<li>Mueva el punto láser virtual con Ctrl + clic del mouse en el centro del electrodo D5 y ajuste el enfoque. Ajuste el enfoque con Ctrl + desplazamiento con la rueda del ratón.</li>
	<li>Pulse el botón Set P1. El punto láser virtual se moverá automáticamente al pozo F. Repita el proceso con el electrodo F5 y seleccione Set P2.</li>
	<li>Después de este procedimiento, el punto láser se moverá hacia el pozo B. Repita el mismo proceso con el electrodo B5 y presione Set P3 en el software. El sistema ahora está alineado.</li>
	<li>Ajuste la potencia del láser y el tiempo de proceso de acuerdo con las necesidades de sus células. Aquí, se utilizó un 40% de potencia y un 25% de tiempo de proceso.</li>
	<li>Para habilitar el láser, haga clic en el botón Láser apagado , que luego aparecerá como láser encendido. Cambie al software de grabación, elija un nombre de archivo y haga clic en el botón Grabación roja seguido del botón Reproducir en la parte superior de la ventana para registrar la medición.</li>
	<li>Registre una línea de base de 60 s antes de abrir las células con el láser. Vuelva al software de inicialización.</li>
	<li>Desactive los electrodos para ser excluidos por el láser en el mapa virtual en el lado derecho usando Ctrl + clic del mouse. Seleccione los electrodos de interés activándolos en la representación de la matriz en el lado derecho de la ventana del software.</li>
	<li>Para iniciar el láser, use Alt + clic del mouse y seleccione el electrodo central de este pozo. Esto inicia el láser para abrir automáticamente las celdas en cada electrodo de este pozo. Repita para cada pozo. El láser abrirá automáticamente todos los electrodos previamente activados del pozo seleccionado.</li>
</ol>4. Manipulación y aplicación de medicamentos
<ol><li>Preparar todas las sustancias que se utilizarán para las pruebas de drogas de nuevo el día de las mediciones. Asegúrese de que la concentración de aplicación final sea 10 veces mayor en el medio para hacer una dilución 1:10 en los pocillos.</li>
	<li>Disuelva Nifedipino, E4031 y Dofetilida primero en DMSO en concentración de mM, y luego en medio a 10x de la concentración deseada. Nunca exceda una concentración final de DMSO de 0.1% en el pozo.</li>
	<li>Registre la actividad de línea base durante 60 s. Inicie la poración inducida por láser como se describe en el paso 3 del protocolo, lo que resulta en una transformación del FP en forma de liAP.</li>
	<li>Aplique todos los medicamentos como concentración única por pocillo. Eliminar 20 μL de medio por pocillo para MEA de 6 pocillos y 100 μL para MEA de un solo pozo, respectivamente. Agregue 20 μL o 100 μL, dependiendo del tipo de MEA, de la solución madre del medicamento que se va a medir al pocillo y pipete cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo 2-3 veces. Realizar al menos tres réplicas de cada fármaco y concentración para lograr relevancia estadística.</li>
	<li>Deje que los compuestos se laven durante 300 s. Durante este tiempo, la forma liAP puede transformarse de nuevo en forma FP. Una vez más, inducir la poración inducida por láser y registrar los posibles efectos inducidos por compuestos en el liAP durante 60 s adicionales.</li>
</ol>5. Exportación de datos
<ol><li>Seleccione los electrodos relevantes reproduciendo la grabación en el software de grabación. Utilice MC_DataTool para convertir MC_Rack archivos a archivos ASCII .txt.</li>
	<li>Haga clic en Archivo > Abrir MCD > Seleccione un archivo MC_Rack. Haga clic en el botón txt (texto azul).</li>
	<li>Seleccione un electrodo. El electrodo seleccionado se mostrará en la lista del lado derecho.</li>
	<li>Haga clic en Examinar para seleccionar la carpeta y cambiar el nombre del nuevo archivo .txt. Haga clic en Guardar.</li>
	<li>Anule la selección del electrodo exportado y seleccione el siguiente electrodo que desea exportar. Repita el procedimiento para todos los electrodos de interés.</li>
</ol>6. Tratamiento de datos y análisis estadístico
<ol><li>Importar trazas binarias convertidas a R19. Visualice/analice los datos utilizando scripts personalizados que contienen los siguientes paquetes: dplyr, tidyr y ggplot220,21,22.</li>
</ol>

<ol><li>Shah, M., Akar, F. G., Tomaselli, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of arrhythmias.</a> Circulation. 112 (16), 2517-2529 (2005).</li>
<li>Bowlby, M. R., Peri, R., Zhang, H., Dunlop, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hERG+%28KCNH2+or+Kv11.1%29+K%2B+channels%3A+screening+for+cardiac+arrhythmia+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Drug+Metabolism%22%5BJournal%5D)">hERG (KCNH2 or Kv11.1) K+ channels: screening for cardiac arrhythmia risk.</a> Current Drug Metabolism. 9 (9), 965-970 (2008).</li>
<li>Priest, B. T., Bell, I. M., Garcia, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+hERG+potassium+channel+assays+in+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Channels+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">Role of hERG potassium channel assays in drug development.</a> Channels (Austin). 2 (2), 87-93 (2008).</li>
<li>Fenton, F., Cherry, E., Glass, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+arrhythmia%5BTitle%5D)+AND+%22Scholarpedia%22%5BJournal%5D)">Cardiac arrhythmia.</a> Scholarpedia. 3 (7), 1665(2008).</li>
<li>Tisdale, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-induced+arrhythmias%3A+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Drug-induced arrhythmias: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation. 142 (15), 214-233 (2020).</li>
<li>Kramer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MICE+models%3A+superior+to+the+HERG+model+in+predicting+Torsade+de+Pointes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">MICE models: superior to the HERG model in predicting Torsade de Pointes.</a> Scientific Reports. 3, 2100(2013).</li>
<li>Rampe, D., Roy, M. -L., Dennis, A., Brown, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+for+the+proarrhythmic+effects+of+cisapride+%28Propulsid%29%3A+high+affinity+blockade+of+the+human+cardiac+potassium+channel+HERG%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">A mechanism for the proarrhythmic effects of cisapride (Propulsid): high affinity blockade of the human cardiac potassium channel HERG.</a> FEBS Letters. 417 (1), 28-32 (1997).</li>
<li>Girouard, S. D., Laurita, K. R., Rosenbaum, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+properties+of+cardiac+action+potentials+recorded+with+voltage-sensitive+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Electrophysiology%22%5BJournal%5D)">Unique properties of cardiac action potentials recorded with voltage-sensitive dyes.</a> Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 7 (11), 1024-1038 (1996).</li>
<li>Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+voltage+and+calcium+in+cardiac+cells+%26+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues.</a> Circulation Research. 110 (4), 609-623 (2012).</li>
<li>Hou, J. H., Kralj, J. M., Douglass, A. D., Engert, F., Cohen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+mapping+of+membrane+voltage+and+calcium+in+zebrafish+heart+in+vivo+reveals+chamber-specific+developmental+transitions+in+ionic+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous mapping of membrane voltage and calcium in zebrafish heart in vivo reveals chamber-specific developmental transitions in ionic currents.</a> Frontiers in Physiology. 5, 344(2014).</li>
<li>Ronzhina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Di-4-ANEPPS+modulates+electrical+activity+and+progress+of+myocardial+ischemia+in+rabbit+isolated+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Di-4-ANEPPS modulates electrical activity and progress of myocardial ischemia in rabbit isolated heart.</a> Frontiers in Physiology. 12, 1-15 (2021).</li>
<li>Beck, C., Gong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-speed%2C+bright%2C+red+fluorescent+voltage+sensor+to+detect+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A high-speed, bright, red fluorescent voltage sensor to detect neural activity.</a> Scientific Reports. 9 (1), 15878(2019).</li>
<li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+multisite+study+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+proarrhythmic+potential+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment.</a> Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).</li>
<li>Kovacs, G. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electronic+sensors+with+living+cellular+components%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+IEEE%22%5BJournal%5D)">Electronic sensors with living cellular components.</a> Proceedings of the IEEE. 91 (6), 915-929 (2003).</li>
<li>Tertoolen, L. G. J., Braam, S. R., van Meer, B. J., Passier, R., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpretation+of+field+potentials+measured+on+a+multi+electrode+array+in+pharmacological+toxicity+screening+on+primary+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communication%22%5BJournal%5D)">Interpretation of field potentials measured on a multi electrode array in pharmacological toxicity screening on primary and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 497 (4), 1135-1141 (2018).</li>
<li>Deo, M., Akwaboah, A., Tsevi, B., Treat, J. A., Cordeiro, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+rapid+delayed+rectifier+K%2B+current+in+human+induced+pluripotent+stem+cells+derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Stem+Cell+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Role of the rapid delayed rectifier K+ current in human induced pluripotent stem cells derived cardiomyocytes.</a> Archives of Stem Cell and Therapy. 1 (1), 14-18 (2020).</li>
<li>Hondeghem, L. M., Hoffmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blinded+test+in+isolated+female+rabbit+heart+reliably+identifies+action+potential+duration+prolongation+and+proarrhythmic+drugs%3A+importance+of+triangulation%2C+reverse+use+dependence%2C+and+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Blinded test in isolated female rabbit heart reliably identifies action potential duration prolongation and proarrhythmic drugs: importance of triangulation, reverse use dependence, and instability.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 41 (1), 14-24 (2003).</li>
<li>Dipalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+action+potential+recordings+from+cardiomyocytes+by+ultrafast+pulsed+laser+irradiation+of+fuzzy+graphene+microelectrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Intracellular action potential recordings from cardiomyocytes by ultrafast pulsed laser irradiation of fuzzy graphene microelectrodes.</a> Science Advances. 7 (15), (2021).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este método innovador demuestra una nueva forma de investigar in vitro la modulación farmacológica del potencial de acción cardíaca durante la aplicación de compuestos de herramientas farmacológicas cardioactivas.
Las grabaciones clásicas de MEA permiten grabaciones de FP, que son el derivado de la AP cardíaca14. Este registro indirecto implica el curso temporal de la despolarización y, por lo tanto, elimina las características esenciales del PA. Además, aunque el cambio de voltaje transcelular de un AP típicamente alcanza valores de aproximadamente 100 mV, la amplitud general de FP sigue siendo comparativamente baja, con amplitudes máximas entre varios 100 μV y valores bajos de mV de un solo dígito. Debido al principio de grabación, la fase de repolarización es pequeña; en muchos casos, es simplemente detectable y a menudo de forma poco clara, lo que dificulta la definición del final del PF. La apertura de la membrana celular nos permite acceder al voltaje intracelular, descubriendo así el curso temporal de la PA cardíaca. Hay múltiples ventajas de este método de grabación en comparación con las grabaciones FP. En primer lugar, la amplitud de la señal es más prominente, proporcionando una relación señal-ruido superior. En segundo lugar, la forma de onda da como resultado una mejor detección de la repolarización. En tercer lugar, la forma de la fase de repolarización aporta información sobre el modo de acción del compuesto de prueba, proporcionado por la inclinación de la relajación de la señal. Y, por último, este método ofrece una sensibilidad mejorada para detectar efectos adversos críticos del medicamento, demostrado por el ejemplo de registro que se muestra en la Figura 6 para la aparición de EAD en el liAP pero no en el PF.
Hasta ahora, hay dos formas de obtener acceso al AP intracelular. El primero se logra por electroporación26,27. Aquí, los pulsos de voltaje cortos y fuertes aplicados a través de los electrodos de registro pueden abrir la membrana celular28. La segunda posibilidad es la apertura de la membrana a través de un pulso láser, haciendo uso de un fenómeno físico llamado resonancia de plasmones superficiales, como se demuestra aquí. Una de las ventajas en comparación con la electroporación es la mayor probabilidad de aperturas consecutivas. Debido al punto láser altamente enfocado (1-3 μm) este efecto está muy limitado localmente al electrodo de interés. Curiosamente, el inicio de la liAP no alteró la propagación de la señal del sincitio cultivado. Esto indica que, aunque la integridad celular está dañada, los cardiomiocitos no parecen despolarizarse a través del orificio en la membrana.
Existen limitaciones para este método. Al igual que con la electroporación, la abertura de la membrana, en la mayoría de los casos, no dura durante todo el curso experimental. Los ajustes mínimos de potencia y duración del pulso láser requeridos para la apertura estable del tipo específico de célula de interés deben definirse de forma independiente antes de los experimentos. Encontramos (no mostramos) que los parámetros varían drásticamente entre diferentes tipos de células (en nuestro caso, varios cardiomiocitos primarios y derivados de hiPS). Esto evita el estrés innecesario en las células durante el experimento de prueba de compuestos y da como resultado datos más confiables y reproducibles. Es de vital importancia ajustar el eje z para proporcionar un enfoque claro en las células y los electrodos. Una imagen de cámara desenfocada produce en un punto láser ubicado en un nivel subóptimo, lo que puede resultar en la incapacidad de abrir la membrana celular. Incluso con los parámetros mejor ajustados, el efecto liAP es transitorio y la amplitud se reduce con el tiempo. Además, el acceso al espacio intracelular de las células varía entre las inducciones liAP, tanto dentro de aberturas consecutivas en el mismo electrodo como entre electrodos. Esto resulta en una alta variabilidad de la amplitud liAP. La razón aún no se entiende completamente. Las posibles explicaciones incluyen problemas mecánicos como una deriva del foco láser o una localización subcelular diferente de la abertura de la membrana. Esto hace que el análisis de los efectos de amplitud de los compuestos de prueba sea complicado en este momento. Además, el registro de la actividad eléctrica por un sistema MEA requiere un alto filtrado de paso para compensar la inevitable desviación de referencia. Aunque en el sistema utilizado aquí, este filtrado se estableció en 0.1 Hz (la configuración de filtro más baja disponible para este sistema), los efectos de filtrado durante la fase de meseta aún eran visibles, lo que resultó en una tendencia lenta de la desviación de voltaje hacia la línea de base durante la fase de meseta del PA cardíaco. Esto es especialmente problemático con AP subyacentes extensamente largos como los cardiomiocitos iCell derivados de iPSC2 utilizados aquí, que ya generan AP >700 ms en condiciones de control. El uso de sistemas con menor filtrado puede conservar mejor la forma del AP y permitir un acceso aún mejor al curso temporal de la fase de repolarización.

La contribución eléctrica de un latido cardíaco resulta de una interacción compleja y cronometrada con precisión de muchos canales cardíacos y transportadores, así como de la propagación sintonizada con precisión de señales eléctricas a través del miocardio1. La alteración de estos mecanismos estrechamente coordinados (p. ej., el uso de drogas) puede tener consecuencias graves para la función del corazón (es decir, arritmia potencialmente mortal)2,3. Las arritmias se definen como latidos cardíacos irregulares que alteran el ritmo normal del corazón, lo que puede tener consecuencias potencialmente mortales. Pueden ser causadas por el inicio alterado de una ola de excitación cardíaca o por la propagación anormal de la excitación cardíaca4, lo que a su vez resulta en una disfunción del mecanismo de bombeo del corazón.
Muchos candidatos a fármacos altamente potentes deben ser excluidos de investigaciones adicionales durante la fase temprana de desarrollo de fármacos debido a su potencial (pro-) arrítmico 2,3. Modulan canales cardíacos clave (por ejemplo, el canal genético humano relacionado con éter a go go [hERG]) que son responsables de la formación y terminación del potencial de acción cardíaca normal, así como de la posterior propagación de la señal5.
Las compañías farmacéuticas utilizan rutinariamente mediciones de patch-clamp o matrices de microelectrodos (MEA) para investigar posibles efectos cardiotóxicos fuera del objetivo inducidos por candidatos a fármacos. Los registros de patch-clamp permiten descifrar el impacto de las sustancias en los canales iónicos cardíacos y analizar el potencial de acción cardíaca transcelular con alta resolución espacio-temporal 6,7. Sin embargo, las desventajas de esta técnica incluyen un bajo rendimiento con patch-clamp manual y una aplicabilidad limitada de la automatización debido a la dependencia de este método de las celdas en suspensión. Además, los efectos crónicos no pueden ser investigados debido a la invasividad del método. Finalmente, por lo general, solo se estudian células individuales simultáneamente en lugar de todo el sincitio cardíaco, lo que hace imposible abordar la información sobre la propagación de la señal.
Los colorantes sensibles al voltaje son valiosos para investigar de forma no invasiva los potenciales de acción cardíaca y las arritmias inducidas por fármacos8. Permiten la investigación de la actividad unicelular y sincitium. Los inconvenientes de este método son los efectos citotóxicos de los colorantes per se o del producto de reacción durante la iluminación. Se utilizan para experimentos agudos y son difícilmente aplicables para estudios a largo plazo 9,10,11. Las proteínas sensibles al voltaje como alternativas han progresado significativamente en los últimos años en términos de usabilidad y sensibilidad, pero requieren modificación genética de las células de interés y carecen de alta resolución temporal en comparación con las técnicas electrofisiológicas12.
La información de la iniciativa más reciente de CiPA13 establece que los MEA se utilizan ampliamente en los exámenes de seguridad cardíaca como un enfoque electrofisiológico alternativo, ya que representan una herramienta poderosa y bien establecida para investigar la función cardíaca y la farmacología de seguridad. Los cardiomiocitos se cultivan como un sincitio directamente en la parte superior de los chips, y los potenciales de campo extracelular (PF) se registran de forma no invasiva a través de microelectrodos integrados en el sustrato. Este principio de grabación permite realizar exámenes de mayor rendimiento durante varios días, lo que los hace adecuados para la investigación farmacéutica sobre efectos crónicos. La forma de onda FP resultante es un derivado del AP14 intracelular. Parámetros como la frecuencia de pulsación, la amplitud de la parte inicial del FP y la duración del FP son fácilmente accesibles15. Otros criterios esenciales como la diferenciación entre prolongación y triangulación de la PF (marcador importante de proarritmia16,17) son inaccesibles debido al efecto filtrante AC de la técnica. Además, la detección de otros pequeños eventos proarrítmicos, como las despolarizaciones posteriores tempranas y tardías (EAD y DAD, respectivamente) a menudo se pasan por alto fácilmente debido a su pequeña amplitud.
Aquí describimos un método para obtener acceso al potencial de la membrana intracelular abriendo la membrana de los cardiomiocitos. El dispositivo IntraCell (en adelante, dispositivo de registro intracelular) permite aberturas repetidas de membrana de cardiomiocitos cultivados sobre los electrodos MEA utilizando un rayo láser de nanosegundos altamente enfocado a través de un fenómeno físico específico (resonancia de plasmones de superficie)18. Como resultado, la grabación pasa de un FP regular a un AP intracelular (AP inducido por láser, liAP). El protocolo muestra cómo esto permite obtener acceso a aspectos cinéticos de la forma de onda que no se pueden capturar fácilmente mediante el análisis de FP. Este método representa un puente entre la pinza intracelular tradicional y las grabaciones MEA. Por lo tanto, la tecnología es una poderosa extensión de los métodos actuales de evaluación de seguridad cardíaca.

<table><tbody><tr><td>Chip MEA de 1 pocillo</td><td>Sistemas multicanal MCS GmbH</td><td>890301</td><td></td></tr><tr><td>Chip MEA de 6 pocillos</td><td>Sistemas multicanal MCS GmbH</td><td>7600069</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Merck KGaA</td><td>20-139 Sigma-Aldrich</td><td>disolvente para medicamentos</td></tr><tr><td>Dofetilida</td><td>ALOMONE LABS SEDE DE ISRAEL</td><td>D-100</td><td>Medición de drogas</td></tr><tr><td>dPBS</td><td>Fisher Scientific GmbH</td><td>12037539</td><td>Coating</td></tr><tr><td>E4031</td><td>ALOMONE LABS ISRAEL HEADQUARTERS</td><td>E-500</td><td>Medición de medicamentos</td></tr><tr><td>Falcon</td><td>Fisher Scientific GmbH</td><td>10788561</td><td></td></tr><tr><td>FB Alps versión 0.5.005</td><td>Foresee Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Merck KGaA</td><td>11051407001</td><td>Recubrimiento</td></tr><tr><td>Cardiomiocitos iCell</td><td>FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. (FCDI)</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>IntraCell</td><td>Foresee Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Carl Roth GmbH + Co.</td><td>KG CN09.1</td><td>Para la limpieza de las almohadillas de contacto MEA Medio de</td></tr><tr><td>mantenimiento</td><td>FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. (FCDI)</td><td>#M1003</td><td>Para el cultivo celular</td></tr><tr><td>MC_Data Herramienta Multi Channel</td><td>Systems MCS GmbH</td><td></td><td>Exportación de datos</td></tr><tr><td>MC_Rack</td><td>Sistemas multicanal MCS GmbH</td><td></td><td>Grabación MEA</td></tr><tr><td>MEA 2100 - 2x60 - sistema</td><td>Sistemas multicanal MCS GmbH</td><td>890485</td><td>Para grabaciones MEA</td></tr><tr><td>Nifedipino</td><td>Merck KGaA</td><td>N7634 Sigma-Aldrich</td><td>Medio de recubrimiento para medición de fármacos</td></tr><tr><td></td><td>FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. (FCDI)</td><td>M1001</td><td>Para cultivo celular</td></tr><tr><td>Tergazyme</td><td>VWR International, LLC</td><td>1304-1</td><td>limpieza de MEAs</td></tr></tbody></table>

mediciones similares a un potencial de acción inducida por láser de cardiomiocitos en matrices de microelectrodos para una mayor predictividad de la farmacología de seguridad

Laser-Induced Action Potential-Like Measurements of Cardiomyocytes on Microelectrode Arrays for Increased Predictivity of Safety Pharmacology

La arritmia cardíaca inducida por fármacos potencialmente mortales a menudo está precedida por potenciales de acción cardíacos (PA) prolongados, comúnmente acompañados de pequeñas fluctuaciones del potencial de membrana proarrítmica. La forma y el curso temporal de la fracción repolarizante de la PA pueden ser fundamentales para la presencia o ausencia de arritmia.
Las matrices de microelectrodos (MEA) permiten un fácil acceso a los efectos compuestos cardiotóxicos a través de potenciales de campo extracelular (FP). Aunque es una herramienta poderosa y bien establecida en investigación y farmacología de seguridad cardíaca, la forma de onda FP no permite inferir la forma AP original debido al principio de registro extracelular y al filtrado de corriente alterna (CA) intrínseco resultante.
Un nuevo dispositivo, descrito aquí, puede abrir repetidamente la membrana de los cardiomiocitos cultivados sobre los electrodos MEA en múltiples puntos de tiempo de cultivo, utilizando un rayo láser de nanosegundos altamente enfocado. La poración láser da como resultado la transformación de la señal electrofisiológica de FP a AP intracelulares (AP inducida por láser, liAP) y permite el registro de desviaciones de voltaje transcelular. Este acceso intracelular permite una mejor descripción de la forma AP y una clasificación mejor y más sensible de los potenciales proarrítmicos que las grabaciones regulares de MEA. Este sistema es una extensión revolucionaria de los métodos electrofisiológicos existentes, permitiendo una evaluación precisa del efecto cardiotóxico con todas las ventajas de las grabaciones basadas en MEA (experimentos fáciles, agudos y crónicos, análisis de propagación de señales, etc.).

El sistema de registro utilizado para registrar la actividad eléctrica de los cardiomiocitos cultivados consistía en un sistema MEA estándar equipado con un calentador y una cámara para carbogen conectada a una computadora. El sistema se colocó en la parte superior del dispositivo de grabación intracelular, que a su vez se montó en la parte superior de una pequeña unidad antivibración (Figura 1A-B).
Los cardiomiocitos2 derivados de iPSC comenzaron a latir espontáneamente dentro de los 2-3 días posteriores a la descongelación (días in vitro, DIV) y fueron visibles bajo un microscopio. Desde DIV 4 en adelante, la frecuencia de batido se volvió regular, y los potenciales de campo extracelular (FP) con amplitudes pico a pico del componente despolarizante entre 1 y 5 mV se pudieron detectar en la mayoría de los electrodos dentro de los pozos respectivos de los chips MEA. La actividad eléctrica pudo detectarse en más del 95% de los pozos investigados. Desde DIV 7 en adelante, la probabilidad de desprendimiento celular aumentó, haciendo imposible un mayor uso de estos pozos.
El software para controlar la apertura de la membrana inducida por láser permite ajustar tanto la potencia como el tiempo de proceso del láser que media la apertura de la membrana celular solo en el electrodo bajo investigación (Figura 1C), mientras que otros electrodos en el pozo respectivo no se ven afectados. Si bien los ajustes demasiado conservadores no cambiaron la forma de onda del PF, los ajustes demasiado altos dieron lugar a la lesión putativa de los cardiomiocitos, indicada por latidos vigorosos pero transitorios o pérdida de la señal. Cuando se ajustó a un ajuste de 40% de potencia y 25% de tiempo de proceso bien tolerado por las células, la activación del pulso láser dio lugar a múltiples cambios en la forma de onda registrada (consulte la Figura 1D para un registro ejemplar). En estas condiciones, no se observó macroscópicamente ninguna alteración del material del electrodo. La amplitud de la señal registrada aumentó masivamente en 4.1 ± 0.41 (n = 20, rango 1.34-8.83) veces, analizadas a partir de un subconjunto de grabaciones seleccionadas al azar, lo que resultó en amplitudes entre 7 y 22 mV. Además, la forma de onda se transformó de una forma de FP estándar con una desviación de voltaje rápida, bifásica y transitoria al principio, seguida de una fase de meseta en la línea de base y una pequeña desviación que indica el final de la FP a una forma que estaba más cerca de un AP registrado intracelularmente con un aumento rápido, una fase de meseta despolarizada extendida y una fase de repolarización con un rebasamiento por debajo de la línea de base (Figura 1E ). Definimos estas desviaciones de voltaje como AP inducida por láser (liAP). En la mayoría de los casos, la transición fue transitoria y al menos parcialmente invertida en 5 minutos. La propagación de la señal dentro del sincitio cardíaco permaneció inalterada después de la inducción de liAP (Figura 2), lo que indica que el sincitio restante no se vio afectado por el daño potencial del pulso láser.
Las similitudes con los AP registrados intracelularmente permitieron extraer parámetros de la liAP que no son accesibles para los PM (para parámetros ejemplares ver, por ejemplo, Figura 3A), más prominentemente la medición de la duración de la liAP en puntos de tiempo específicos (por ejemplo, al 20%, 50% y 90%) (Figura 3B), análoga a APD20/50/90 comúnmente utilizada para la descripción de AP.
A continuación, probamos la respuesta de los cardiomiocitos abiertos con láser a los compuestos de herramientas farmacológicas cardioactivas de uso común. Un diseño de protocolo ejemplar se puede encontrar en la Figura 3C. Dado que la transformación del liAP no siempre persistió durante todo el experimento, la aplicación del compuesto se realizó como una concentración única por pocillo en lugar de de manera acumulativa para reducir el tiempo total de registro. Sin embargo, fue necesario volver a abrir las celdas o abrir otra área de electrodos antes de aplicar el compuesto de prueba.
La adición del bloqueador específico del canal Ca 2+ de tipo L, Nifedipino23,24, redujo la fase de meseta de la liAP de una manera dependiente de la concentración y, por lo tanto, acortó toda la liAP (Figura 4A, B). Este acortamiento fue comparable al análisis obtenido de PFs de cardiomiocitos de electrodos no manipulados (Figura 4C), indicando que este método de registro no tuvo efectos adversos en comparación con los registros clásicos de FP.
E4031 inhibe la repolarización del canal de potasio relevante Kv1.11 (hERG)25 y conduce al comportamiento arrítmico de los cardiomiocitos a concentraciones aumentadas. Similar al análisis obtenido de las grabaciones de FP, E4031 aumentó la duración de liAP de una manera dependiente de la concentración (Figura 5). Además, a concentraciones de 0,01 μM y superiores, se observaron pequeñas deflexiones de voltaje positivo al final del liAP. Estas desviaciones se hicieron más prominentes con concentraciones más altas, lo que indica una nueva despolarización transitoria, a diferencia de los PF, donde estas desviaciones eran prácticamente invisibles (ver Figura 5B-C, trazas superiores (FP) vs inferiores (liAP)). Este comportamiento se conoce como postdespolarización temprana (EAD). En la concentración más alta de 0,1 μM, estos EAD aumentaron con el tiempo en latidos ectópicos, que son potenciales de acción prematuros (Figura 5C). Tanto EAD como los latidos ectópicos son indicadores clave de la actividad proarrítmica. Al final del ejemplo que se muestra en la Figura 5D, la actividad eléctrica resultó en latidos arrítmicos. Además, las relaciones concentración-respuesta-mostradas entre las grabaciones de FP y liAP coincidían (Figura 5E). Sin embargo, existe una variabilidad más considerable en los datos de PF como resultado del débil componente de repolarización de los PF a concentraciones más altas del compuesto de ensayo. Parece ser la naturaleza característica de los cardiomiocitos derivados de iPSC2 tender a generar PA no fisiológicamente largos también en condiciones de control (duraciones de PA &gt; 700 ms). El sistema MEA aplicó un filtrado intrínseco de CA de 0,1 Hz, que a su vez dio como resultado una forma parcialmente filtrada del liAP, aunque sin ocluir la información cualitativa sobre el inicio y la terminación del PA subyacente.
Resultó que la aparición inicial de deflexiones de voltaje proarrítmicas podría detectarse a concentraciones más bajas en liAP en comparación con las grabaciones de FP. En la Figura 6 se muestra el registro de la actividad eléctrica durante la aplicación de dofetilida a una concentración de 3 μM. La grabación se obtuvo en el mismo pozo. Aunque tanto FP como liAP mostraron duraciones de aproximadamente 2 s, la forma de onda FP fue discreta, presentando deflexiones repolarizantes regulares. Al mismo tiempo, al final de los liAP, los EAD de diferentes magnitudes se hicieron visibles. Este aumento en la sensibilidad farmacológica de seguridad relevante respalda aún más el hallazgo de que los liAP inducidos por resonancia de plasmones de superficie permiten una mejor calificación de la fase de repolarización y, por lo tanto, ayudan a aprender más sobre el modo de acción de los compuestos de prueba bajo investigación.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig1v2.jpg"> Figura 1: La configuración de la grabación intracelular y las grabaciones ejemplares . (A) Visión general de la configuración. (B) Vista superior del sistema de grabación con amplificador de grabación MEA abierto. (C) Software de inicialización con el mapa MEA virtual en el lado derecho. 1: mesa antivibración, 2: sistema de grabación intracelular, 3: tapa de protección láser, 4: cámara de carbogen humidificada, 5: sistema de calefacción MEA, 6: placa de interfaz MEA, 7: chip MEA de 1 pozo dentro del amplificador de grabación. (D) Grabación de ejemplos de un electrodo antes y después de la inducción de liAPs. Arriba: grabación de aproximadamente 6 min. Las líneas punteadas marcan las áreas expandidas que se muestran en la parte inferior. (E) FP magnificado (arriba) y liAP (abajo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig1v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig02.jpg"> Figura 2: El patrón de propagación de la señal permanece conservado después de la inducción de liAP. Codificación de color falso de la propagación de la señal de la onda de excitación dentro del sincitio. El azul indica temprano (a partir de -4 ms); el rojo indica los puntos de tiempo tardíos (+3 ms) de la señal obtenida en el electrodo de referencia E54 como se indica en la barra de color. La señal viaja de arriba a la derecha a la parte inferior izquierda de la matriz de electrodos. (A) Antes de la inducción de liAP, (B) 1 minuto después de la inducción de liAP. (C) 4 min después de la inducción de liAP. El símbolo del flash indica el punto de inducción del láser en el electrodo 64. Tenga en cuenta que no es visible ninguna diferencia en la dirección general de propagación. Los rectángulos negros indican datos no válidos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig3v2.jpg"> Figura 3: Definición de parámetros FP/liAP y protocolo de grabación . (A) Parámetros que pueden extraerse del FP clásico. (B) Parámetros adicionales que se pueden obtener de liAPs. (C) Cronología de la medición de drogas. De izquierda a derecha: registro de control durante 60 s, inducción de liAP, registro de liAP durante 60 s, aplicación de fármaco, tiempo de lavado 300 s, reinducción de liAP, registro de liAP durante 60 s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig3v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig4v2.jpg"> Figura 4: La nifedipina acorta la liAP cardíaca de una manera dependiente de la concentración. (A) Arriba: trazas de PF en el control (azul) y en presencia de 0,3 μM de nifedipino (rojo). Las trazas se muestran con un desplazamiento del eje y para una mejor visualización. Abajo: trazas liAP de la misma grabación MEA, lo que resulta en un acortamiento del liAP combinado con un aumento en la tasa de latido. (B) Superposición de liAPs simples durante el control (azul) y aplicación de diferentes concentraciones de Nifedipino (rojo). a: 0,01 μM, b: 0,1 μM y c: 0,3 μM. Nótese el acortamiento de la duración de liAP con concentraciones crecientes. (C) La relación concentración-respuesta de la anchura de la señal obtenida de las grabaciones FP (negro) y liAP (rojo). Los datos son de n = 3 experimentos y normalizados para controlar. Las barras de error indican el error estándar de la media. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig4v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig5v2.jpg"> Figura 5: E4031 induce un comportamiento (pro-) arrítmico. (A) FP (arriba) y liAP (abajo) en condiciones de control. (B-C) Los PF y los liAP se registraron en diferentes puntos temporales después de aplicar E4031 (0,1 μM). Después de 80 s, los primeros EAD son visibles al final del liAP (B; marcado con una flecha roja). Los EAD se convierten en latidos ectópicos después de 320 s en presencia del compuesto de prueba (C). (D) Después de 530 s, el sincitio cardíaco entra en un estado taquicárdico. Seguimiento representado a partir de la grabación liAP. (E) Relación concentración-respuesta de la anchura FP (negro) y liAP (rojo). Datos de n = 4 experimentos, normalizados para controlar. Las barras de error indican el error estándar de la media. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig5v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig06.jpg"> Figura 6: La detección de eventos proarrítmicos es más sensible en liAPs que en FPs . (A) grabación de FP y (B) grabación de liAP dentro del mismo pocillo durante la aplicación de 3 μM de dofetilida. Mientras que al final de algunos liAP, los EAD son detectables, permanecen indetectables en las grabaciones de FP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

La combinación de poración láser y matrices de microelectrodos (MEA) permite registros similares al potencial de acción de cardiomiocitos primarios y derivados de células madre cultivados. La forma de onda proporciona una visión superior del modo de acción de los compuestos de prueba que las grabaciones estándar. Vincula patch-clamp y lectura MEA para optimizar aún más la investigación de seguridad cardiovascular en el futuro.

Mediciones similares a un potencial de acción inducida por láser de cardiomiocitos en matrices de microelectrodos para una mayor predictividad de la farmacología de seguridad

Life-threatening drug-induced cardiac arrhythmia is often preceded by prolonged cardiac action potentials (AP), commonly accompanied by small ...

Este método permite registrar potenciales de acción intracelulares similares en MEA tradicionales, lo que permite una mejor descripción de la forma AP y una clasificación más sensible de los potenciales pro-arrítmicos. En comparación con las grabaciones típicas de potencial de campo, la forma de potencial real intracelular proporciona más información sobre la autorización precisa de los canales iónicos subyacentes. Cuando se aplica a cardiomiocitos derivados de pacientes clínicos a través de la tecnología de células madre, el método puede contribuir al diagnóstico causal y la personalización de C R P y, enfermedades cardíacas como arritmias Nuestra técnica, Karin Gebhardt demostrará el cultivo de cardiomiocitos.Para comenzar a cubrir los campos de electrodos de los MEA previamente esterilizados, Dropwise con fibronectina utilizando una pipeta de 10 microlitros debajo de la campana de flujo laminar. Para reducir el choque osmótico, transfiera la solución de recubrimiento gota a gota durante 90 segundos en el tubo de 50 mililitros que contiene cardiomiocitos descongelados. Agregue suavemente ocho mililitros de medio de recubrimiento en el tubo y mezcle la suspensión celular con cuidado.Con una pipeta de 10 mililitros, retire el sobrenadante, asegurándose de no desechar el pellet y ajustar el número de células a la concentración final. Antes del asiento de la celda, retire la solución de recubrimiento aplicada del área del electrodo MEA con una pipeta de 10 microlitros. Para evitar el secado de la semilla de recubrimiento, las células inmediatamente agregando cuatro microlitros de las células gota a gota en los campos de electrodos para ambos, seis pozos MEA y un pozo M E A.Ahora, permita que las células se adhieran a los pocillos durante una hora a 37 grados centígrados, y 5% dióxido de carbono.Debajo de la campana de flujo laminar, agregue 200 microlitros y un mililitro de medio de recubrimiento estéril calentado a 37 grados centígrados para seis pozos MEA y MEA de un solo pozo, respectivamente. Para grabaciones MEA, coloque el sistema MEA en la parte superior del dispositivo con el soporte del chip MEA centrado sobre el orificio del objetivo. Luego permita que el láser se enfoque en los electrodos posicionando la configuración MEA, de modo que el objetivo esté directamente debajo del orificio del sistema MEA.Para permitir que las células se recuperen de la perturbación mecánica, transfiera el chip MEA con las células cultivadas de la incubadora a la configuración MEA 15 minutos antes de la grabación. A continuación, limpie las almohadillas de contacto y los pines cuidadosamente, utilizando un hisopo de isopropanol para disminuir los niveles de ruido. Coloque el MEA cuidadosamente en la configuración MEA y coloque el chip MEA de seis pocillos con el número de serie visible en el lado derecho o un chip MEA de un solo pozo con el electrodo de referencia a la izquierda.Ahora, configure la calefacción integrada del sistema MEA a 38 grados centígrados. Cierre la tapa del dispositivo, ya que el interruptor de seguridad integrado solo permite activar el láser si la tapa está cerrada sobre el chip MEA. Usando el programa de configuración de MEA, establezca el filtro del sistema MEA de paso alto y paso bajo en 0.1 hertz o menos y 3, 500 hertz respectivamente.Utilice el software de rack MC o cualquier software alternativo para grabar. Ajuste el rango de entrada de acuerdo con el experimento. Asegurar que la señal no sature el amplificador y la frecuencia de muestreo.Utilice la función de visualización a largo plazo del software para comprobar la grabación. Después de insertar el chip MEA en la configuración MEA y configurar el software, inicialice la mecánica láser utilizando el software FB ALP. Ahora, haga clic en el botón de inicialización.Al final de la inicialización, el punto láser virtual estará en el pozo D para un MEA de seis pozos y en la parte inferior izquierda para un solo pozo MEA, respectivamente. Luego, usando la tecla de control con un clic del mouse, mueva el punto láser virtual al centro del electrodo D cinco y ajuste el enfoque manteniendo presionada la tecla de control y desplazándose con la rueda del mouse. Como alternativa, utilice la función de enfoque automático.Presione el botón Set P uno, y el punto láser virtual se moverá automáticamente hacia el pozo F. El sistema ahora está alineado. Ajuste la potencia del láser y el tiempo de proceso de acuerdo con los requisitos experimentales. Para habilitar el láser, haga clic en el botón de apagado del láser que aparecerá como láser encendido, cambie al software de grabación.Elija un nombre de archivo y haga clic en el botón rojo de grabación seguido del botón de reproducción en la parte superior de la ventana para registrar la medición. Antes de abrir las celdas con el láser registre una línea de base durante 60 segundos. Vuelva al software de inicialización y desactive los electrodos para que el láser los excluya en el mapa virtual en el lado derecho de la ventana del software.Para iniciar el láser, haga clic con Alt y seleccione el electrodo central de este pozo. Esto inicia el láser para abrir las celdas en cada electrodo de este pozo automáticamente, repita para cada pozo para abrir todos los electrodos previamente activados de este pozo seleccionado. Disuelva la concentración milimolar de Nifedipino E-40 31 y Dofetilida en DMSO primero, y luego en medio completo a 10 veces la concentración deseada.Nunca exceda una concentración final de DMSO de 0.1% en el pozo. Registre la actividad de línea base durante 60 segundos. Inicie la peración inducida por láser como se demostró anteriormente, lo que resulta en una transformación de los FPS en liAP.Aplique todos los medicamentos como concentración única por pocillo. Retire 20 microlitros y 100 microlitros de medio por pozo de seis MEA de pozo y pozo único, respectivamente. Agregue 20 microlitros o 100 microlitros de la solución madre del medicamento que se medirá en el pozo.Dependiendo del tipo de MEA, y pipetear cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo dos o tres veces. Deje que los compuestos se laven durante 300 segundos. Durante este tiempo, la forma liAP puede transformarse en la forma FP.Una vez más, indujo peración inducida por láser y registra posibles defectos inducidos por compuestos en el liAP durante 60 segundos adicionales. La adición de nifedipino redujo la fase de meseta de los liAP de una manera dependiente de la concentración y, por lo tanto, acortó todo el liAP. Este acortamiento fue comparable a los potenciales de campo de los cardiomiocitos de electrodos no manipulados.E-40 31 inhibió la repolarización de los canales de potasio KV un punto 11 relevantes y condujo al comportamiento arrítmico de los cardiomiocitos a concentraciones aumentadas. Además, E-40 31 aumentó la duración de liAP de una manera dependiente de la concentración. Al final del liAP se observaron pequeñas desviaciones positivas de voltaje a 0.1 micromolar que se hicieron más prominentes con concentraciones más altas, lo que indica una nueva despolarización transitoria llamada EAD.En la concentración más alta de 0.1 micromolar, estos EAD aumentaron con el tiempo en latidos ectópicos. Que son potenciales de acción prematuros. EAD y latidos ectópicos son indicadores clave de la actividad pro arrítmica.Y al final, la actividad eléctrica resulta en latidos arrítmicos. Las relaciones de respuesta de concentración se correlacionaron con las grabaciones de FP y liAP. Además, en presencia de dofetilida, tanto FP como liAP mostraron duraciones de aproximadamente dos segundos dentro del mismo pozo, la forma de onda FP presentó deflexiones de repolarización regulares.Mientras que en el liAP EAD's son detectables. Es importante ajustar el enfoque antes de cada melomen, ya que una imagen de microscopio desenfocada podría afectar la apertura de las células. Además, el potencial de acción se toma poco después de que la opterperación debe usarse para el análisis.Esta técnica es más sensible en la detección de efectos arrítmicos previos en comparación con la MEA estándar, lo que permite con mayor precisión la detección de efectos compuestos adversos.

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