Un enfoque de imagen intravital fluorescente para estudiar la dinámica de señalización de calcio inducida por la carga en osteocitos de ratón
24 de febrero de 2023
El presente artículo describe la realización de un enfoque de imagen intravital para observar la señalización de calcio inducida mecánicamente de osteocitos incrustados in vivo en tiempo real en respuesta a la carga mecánica a nivel tisular del tercer metatarsiano del ratón.
Este protocolo proporciona una forma de observar osteocitos incrustados in vivo, lo que representa un avance importante en el estudio de la mecanobiología ósea. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de observar eventos a nivel celular y molecular en osteocitos in vivo, manteniendo su disposición espacial 3D nativa, flujo sanguíneo y condiciones endocrinas, y superando las limitaciones típicamente impuestas por la experimentación celular in vitro. Esta técnica está diseñada para la investigación científica básica en modelos de ratón. Todavía no se extienden a la terapia o al diagnóstico, pero brindan la oportunidad de obtener información que defina la próxima generación de tratamientos óseos.
[Narrador] Para comenzar, haga una incisión con bisturí a través de la dermis entre el segundo y tercer metatarsiano, comenzando en el extremo distal y progresando proximalmente a lo largo de los huesos. Con fórceps, abra el sitio quirúrgico tirando de la piel hacia los bordes medial o lateral. Reseque los tendones extensores con unas tijeras rectas de Vannas para exponer el tercer metatarsiano. Inserte el pasador de apoyo central del dispositivo de carga metatarsiana en el pequeño espacio en el extremo distal donde el tercer metatarsiano se encuentra con la falange proximal. Luego mueva el pasador proximalmente hasta que descanse en la mitad del eje del tercer metatarsiano. Tenga especial cuidado para garantizar una interfaz directa entre el hueso y el pasador, excluyendo cualquier músculo y fascia. Sostenga el tobillo con fórceps y coloque el pie en el baño de agua lleno de DPBS. Asegure la pata en su lugar con el soporte de carga y conecte el soporte a la disposición de la celda de carga del actuador. Levante con cuidado la configuración del dispositivo de carga con el mouse y colóquela en la plataforma del microscopio. Comience con el objetivo de bajo aumento en modo de epifluorescencia para localizar y centrar la diáfisis media del hueso. Después de localizar una región de interés, cambie a un aumento de objetivo de inmersión en agua más alto y cambie la óptica a dos fotones. Establezca la densidad de píxeles utilizando la configuración de control de área Galvo/Resonancia. Para evitar el blanqueo de fotos, reduzca la potencia con la opción de control de potencia y aumente la amplificación PMT en la configuración de control del escáner Galvo/Resonance. Identifique la superficie del hueso en modo de dos fotones buscando la autofluorescencia fibrosa del periostio en el canal verde que utiliza un filtro de paso de banda centrado en 525 nanómetros. Si hay un movimiento visible del hueso durante la carga, seleccione una región de interés diferente a lo largo de las direcciones Y o Z para asegurarse de que esté directamente sobre el pasador de punto de apoyo central. Si el movimiento persiste, ajuste la posición quirúrgica del clavo manualmente debajo del tercer metatarsiano. Realice imágenes de pila Z con carga de acuerdo con el diseño experimental para registrar los eventos de señalización morfométrica, y luego imágenes de la serie T con carga para registrar los eventos de señalización inducidos por carga dinámica. Aquí se muestra una imagen de dos fotones de un solo plano de osteocitos metatarsianos que expresan GCaMp6f in vivo. La expresión endógena de construcciones reporteras de calcio proporciona un objetivo fluorescente sin necesidad de incubación. En esta figura se presenta la proyección 3D Z de osteocitos in vivo capturada con dos microscopía de fotones. El corte transversal en el plano XY y un corte sagital muestran la profundidad de la pila Z. La imagen representativa muestra un ejemplo de curso temporal de la señal fluorescente GCaMp6f de un osteocito incrustado. En reposo, se exhiben fluctuaciones ruidosas de bajo nivel. Con la carga, las fluctuaciones de calcio aumentan en magnitud y regularidad, a menudo ocurriendo al mismo ritmo que la carga aplicada.
Este método allana el camino para que los investigadores respondan preguntas funcionales sobre la mecanobiología de osteocitos in vivo que anteriormente solo eran posibles in vitro o ex vivo.
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Descripción general
Este artículo presenta un protocolo para la imagenología intravital con el fin de observar la señalización de calcio en osteocitos en respuesta a la carga mecánica in vivo. Este avance permite la observación en tiempo real de eventos celulares manteniendo al mismo tiempo el entorno nativo del hueso.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Mecanobiología ósea
- Técnicas de imagen intravital
- Señalización de calcio en osteocitos
Antecedentes
- Los osteocitos desempeñan un papel crucial en la mecanobiología ósea.
- Los métodos tradicionales in vitro limitan la comprensión de las respuestas celulares en su entorno nativo.
- Esta técnica permite la observación de osteocitos mientras se conserva su disposición espacial tridimensional y sus condiciones fisiológicas.
- Los conocimientos obtenidos podrían orientar futuras estrategias de tratamiento óseo.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para observar osteocitos in vivo durante la carga mecánica.
- Mejorar la comprensión de la dinámica de la señalización del calcio en los osteocitos.
- Proporcionar una base para investigaciones futuras sobre la salud ósea y las enfermedades del hueso.
Métodos Utilizados
- Incisión con bisturí para acceder al tercer metatarsiano en ratones.
- Uso de un dispositivo de carga metatarsiana para aplicar estrés mecánico.
- Microscopía de dos fotones para la obtención de imágenes de osteocitos en tiempo real.
- Eventos de señalización inducidos por carga dinámica capturados mediante imágenes en series Z y T.
Resultados principales
- La imagen en tiempo real reveló fluctuaciones de calcio en los osteocitos durante la carga.
- Las señales fluorescentes aumentaron en magnitud con el estrés mecánico.
- La imagen 3D proporcionó información sobre la disposición espacial de los osteocitos.
- Se demostró la eficacia de la técnica para estudiar la mecanobiología ósea.
Conclusiones
- El protocolo permite avances significativos en el estudio de la mecanobiología ósea.
- La imagenología en tiempo real de los osteocitos puede conducir a una mejor comprensión de la salud ósea.
- Esta técnica podría allanar el camino para futuras estrategias terapéuticas en el tratamiento óseo.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La imagen directa in vivo de la señalización de calcio en osteocitos bajo carga mecánica aborda un vacío crítico en la comprensión de la mecanotransducción ósea a nivel molecular. Esta capacidad mejora la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento al permitir la observación en tiempo real de las vías mecanosensoriales en su contexto fisiológico natural. El enfoque facilita la reducción de riesgos mecanicistas y orienta la validación de dianas para carteras relacionadas con la salud ósea y las enfermedades esqueléticas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la investigación de las vías mecanosensoriales de los osteocitos en un entorno fisiológicamente relevante.
- Apoya la reducción de riesgos biológicos al mantener la arquitectura tridimensional nativa y las influencias sistémicas.
- Facilita la validación funcional de dianas para los mecanismos de mecanotransducción ósea.
- Mejora la confianza predictiva para la priorización de dianas relacionadas con el hueso.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Proporciona un sistema validado in vivo para cuantificar la dinámica de la señalización de calcio en respuesta a cargas mecánicas definidas.
- Permite lecturas cuantitativas y reproducibles de la actividad de los osteocitos para el desarrollo de ensayos posteriores.
- Facilita la estandarización de ensayos de mecanotransducción para la evaluación de compuestos.
- Establece las bases para la realización de cribados escalables de moduladores que afectan la mecanosensibilidad ósea.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relaciona conocimientos mecanicistas con modelos óseos relevantes para la enfermedad, garantizando una continuidad traslacional.
- Permite el avance ajustado al riesgo de intervenciones dirigidas al hueso basado en datos mecanicistas obtenidos in vivo.
- Facilita la identificación de biomarcadores traslacionales vinculados a la dinámica de señalización de los osteocitos.
- Conecta hallazgos de etapa de descubrimiento con la validación preclínica en sistemas intactos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este método de imagenología intravital se integra en la interfaz entre el descubrimiento temprano y la investigación preclínica, permitiendo la verificación directa de hipótesis y la aclaración de vías en tejido óseo vivo.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la verificación mecanicista de hipótesis sobre las respuestas de los osteocitos a estímulos mecánicos in vivo.
- Selección: Proporciona mediciones cuantitativas y reproducibles de la señalización de calcio para evaluar la preparación del ensayo.
- Análisis: Ofrece lecturas fluorescentes dinámicas para comparar la señalización bajo diferentes condiciones de carga.
- Investigación Traducional: Conecta eventos de señalización molecular con resultados funcionales a nivel óseo completo en modelos relevantes para enfermedades.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para estudios de mecanobiología en diversos programas de investigación ósea.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la investigación de la mecanotransducción ósea.
- Valor operativo: Estandariza los flujos de trabajo de imagen in vivo para garantizar reproductibilidad y escalabilidad.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de avance o interrupción de proyectos y mejora la eficiencia del capital en I+D dirigida al hueso.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de activos relacionados con la salud ósea y las enfermedades esqueléticas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en imágenes intravitales y técnicas quirúrgicas en pequeños animales.
- Exige acceso a microscopía de dos fotones e instrumentación precisa para carga mecánica.
- Necesita estandarización entre equipos para los parámetros de imagen y el análisis de datos.
- La adaptación a otros sitios óseos o modelos puede requerir optimización del protocolo.
- Se limita a la investigación básica en modelos de ratón, según los datos actuales.
