Name: Evaluación de la función biventricular murina ex vivo en un modelo de Langendorff (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Aprende a evaluar la función biventricular ex vivo en corazones de ratón usando el sistema de perfusión Langendorff. Este método permite cuantificar parámetros cardíacos post-preservación en frío y comparar la respuesta del ventrículo izquierdo y derecho.

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Todos los experimentos con animales en este protocolo fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Michigan, Ann Arbor. Todos los ratones se alojaron en un ciclo de luz de 12:12 en habitaciones libres de patógenos. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, animales y equipos utilizados en este protocolo.
1. Construcción del catéter balón de silicona
NOTA: El globo de silicona se fabrica como se ha descrito anteriormente13.
<ol><li>Agregue 9,5 ml de agua destilada, 14,2 ml de jarabe de maíz ligero y 33,8 g de sacarosa a un vaso de precipitados de 100 ml. Calienta y revuelve la solución hasta que el azúcar se disuelva por completo.</li>
	<li>Prepara la masa mezclando 10 g de harina de trigo y 5 g de agua hasta conseguir una consistencia uniforme y déjala reposar durante 10 min.</li>
	<li>Forme un pequeño trozo de masa en forma de óvalo, la "cabeza", y péguelo al extremo de una hebra de espagueti seca. Luego, sumerja esta cabeza en la solución de azúcar y retírela lentamente de la solución, ya que la cabeza ahora está completamente cubierta. NOTA: La masa debe ser suave y de textura uniforme. Los tamaños de masa se pueden variar para generar diferentes tamaños de globos, desde 5 mm (diámetro corto) hasta 7 mm (diámetro largo). Trate de cubrirlos con una película delgada de solución de azúcar.</li>
	<li>Suspenda la hebra de espagueti en un bloque de espuma de poliestireno u otros soportes, para formar una cubierta brillante de manera uniforme sobre la cabeza y séquela durante la noche.</li>
	<li>Sumerja el molde en dispersión de silicona (elastómero de silicona disperso en xileno). Vuelva a colocar la hebra de espagueti en el bloque de espuma de poliestireno a 37 °C durante 2 h o hasta que se seque. Repita este paso una vez. NOTA: Es fundamental evitar que el gel de dispersión de silicona se oxide debido a la exposición al aire, ya que esto generará un grosor desigual del globo.</li>
	<li>Coloca el molde en el agua para separar y recoger el globo. Guarde el balón en azida de sodio al 0,02%.</li>
	<li>Corta una punta de dos extremos romos de una aguja de 22 G; monte un extremo romo en el globo de silicona y otro extremo romo en el tubo de PE. Use seda 4-0 para atar el globo en su lugar en la aguja. NOTA: Pruebe la integridad del globo inyectando agua en él. Una vez que el globo esté lleno, presiónelo suavemente para probar si el globo mantiene la tensión en el interior. Use un globo nuevo si tiene fugas. Los globos montados se pueden almacenar para su uso futuro.</li>
</ol>2. Preparación del sistema de perfusión cardíaca
<ol><li>Prepare 1 L de tampón de perfusión Krebs-Henseleit (KH) y transfiéralo al depósito de agua del sistema Langendorff.</li>
	<li>Conecte el tubo de aire al depósito de agua y encienda el flujo de aire para equilibrar el tampón KH con 5% de CO 2 y 95% de O2 durante al menos 30 min.</li>
	<li>Ajuste el baño de agua a 41,5 °C y haga circular el agua en la capa exterior del sistema Langendorff para calentar el sistema y el tampón KH. NOTA: La temperatura del baño de agua requiere optimización para cada sistema. Para este sistema, la temperatura del baño de agua mantendrá el KH a 37-37,5 °C cuando se perfunda en el corazón.</li>
</ol>3. Aislamiento, montaje y canulación del corazón del ratón
<ol><li>Para la anticoagulación, administrar 200 unidades de heparina en solución salina mediante inyección intraperitoneal (i.p.) en el cuadrante derecho del abdomen del ratón C57/B6. Aspire la jeringa antes de la inyección para confirmar que el bisel de las agujas no esté en la vejiga o en la luz del tracto gastrointestinal. Use al menos cuatro ratones en cada condición experimental (pero también considere el tamaño del efecto del tratamiento).<ol><li>Después de 30 min, administrar 80 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilacina i.p. para anestesiar al ratón. Compruebe si el ratón anestesiado está inconsciente realizando un pellizco en el dedo del pie y asegurándose de que no se observe ninguna respuesta. Se puede añadir acepromazina 2 mg/kg al cóctel ket/xilo si la cepa de ratones utilizada no alcanza un nivel adecuado de anestesia con ket/xilo solamente.</li>
		<li>Haz una incisión justo debajo del esternón. Usa unas tijeras para abrir el pecho cortando el diafragma y las costillas. Dobla la pared torácica anterior para exponer completamente el tórax. Corte en la aorta descendente (cerrada al arco de la aorta). Transfiera el corazón, los pulmones y el timo del ratón al tampón frío de histidina-triptófano-cetoglutarato (HTK). Aísle los órganos bajo un tampón HTK helado. Exponga la aorta extirpando cualquier tejido conectivo. NOTA: Maximice la longitud de la aorta incluyendo tanto la aorta ascendente como la región del arco aórtico en la escisión para dejar suficiente espacio para conectarse a una aguja.</li>
	</ol></li>
	<li>Conecte el extremo de la aorta a una aguja de 22 G y átela con una sutura de seda 6-0. Asegúrese de que la cánula esté por encima de la raíz aórtica para no interferir con la válvula aórtica. Perfundir la aorta con 10 ml de tampón HTK frío (4 °C) durante aproximadamente 10 minutos. NOTA: Se tarda menos de 15 minutos desde la extracción del corazón hasta la canulación de la aorta; Sin embargo, es importante mantener la velocidad de perfusión en el nivel adecuado. Las inyecciones demasiado rápidas y vigorosas pueden generar altas presiones y causar daños vasculares/cardíacos.</li>
	<li>Almacenar el corazón en un tubo de 50 mL con HTK helado durante 8 h o realizar inmediatamente la perfusión (no guardar el control) y evitar el contacto directo con hielo. NOTA: El contacto directo del tejido cardíaco con hielo puede provocar lesiones por frío.</li>
	<li>Conecte el corazón montado en la aguja a la cánula del aparato de Langendorff y átelo con una sutura de seda. NOTA: Para estandarizar el procedimiento, espere un total de 3 minutos para el proceso de canulación antes de la perfusión.</li>
	<li>Iniciar la perfusión con un modo de flujo constante a 3 mL/min; luego, cambie al modo de presión constante a 70-80 mmHg y ajuste el corazón a ~ 6 mL/min. NOTA: Palpar suavemente el corazón puede ayudar a acelerar la reanimación cardíaca. Si el caudal de perfusión es muy superior a 6 ml/min en modo de presión constante, podría haber una fuga en la canulación o que la válvula de la aorta no esté funcionando correctamente. Ajuste las conexiones para reparar la fuga. El modo de flujo constante anula la autorregulación del tono vascular del corazón. El modo de presión constante permite que el corazón regule su flujo de perfusión coronaria. Por lo tanto, el modo de presión constante medirá con precisión la función cardíaca y la calidad de preservación del corazón.</li>
	<li>Conecte un globo desinflado y lleno de agua a un transductor de presión y una jeringa llena de agua con un grifo de tres vías. Después de un período de equilibrio de 15 a 20 minutos, corte la aurícula derecha (AR) e inserte el balón en el VD a través de la AR. Use cinta adhesiva para sostener el globo dentro del ventrículo recreativo. Minimice el área abierta de la artritis reumatoide para ayudar a sujetar el globo en el ventrículo (consulte la configuración de la figura 1 ). NOTA: Es necesario un período de equilibrio, ya que la contracción y relajación cardíaca no son estables al principio, y la medida es menos precisa y representativa. Si el nódulo auriculoventricular se daña durante la apertura de la AR, el corazón mostrará arritmias frecuentes.</li>
	<li>Después de 20 minutos de recolección de datos funcionales del VD, corte la aurícula izquierda (LA) e inserte un globo lleno de agua desinflado en el VI a través de la LA. Usa cinta adhesiva para sostener el globo dentro del VI. NOTA: El corazón debe mantener una hemodinámica estable durante más de 1,5 h.</li>
</ol>4. Registro de datos funcionales
<ol><li>Calibración del transductor de presión<ol><li>Llene una jeringa de 10 ml con solución salina tibia y conecte la jeringa a la cúpula a través de un grifo de tres vías. Abra el grifo y llene lentamente la cúpula con solución salina, y luego cierre todos los grifos y retire la jeringa. Conecte la cúpula llena al transductor; Conecte el manómetro al tercer extremo del grifo de tres vías.</li>
		<li>En el software de grabación, seleccione el Bridge Amp en el menú desplegable del canal que se conecta al transductor. Cambie el nombre del canal a Presión perfundida. Haga clic en Cero para poner a cero el transductor.</li>
		<li>Inicie la grabación haciendo clic en Iniciar para que el transductor marque ahora 0 mmHg. Después de varios segundos de grabación, empuje lentamente la jeringa y aumente la presión a 100. Haga clic en detener para detener la grabación.</li>
		<li>En el cuadro de diálogo Conversión de unidades, seleccione un área de grabación para 0 mmHg y haga clic en la flecha hasta el punto 1 y escriba 0 mmHg. Seleccione el área de grabación para 100 mmHg, haga clic en la flecha hasta el punto 2 y escriba 100 mmHg. Haga clic en Aceptar para calibrar el transductor.</li>
	</ol></li>
	<li>Cambie el nombre del canal correspondiente al transductor de presión con el balón como Presión del ventrículo. Inicie la grabación cuando el corazón esté conectado al sistema. Después de insertar el balón en el ventrículo, ajuste el volumen de agua en el balón con una jeringa micrométrica a través del grifo de tres vías para mantener la presión diastólica final en 5-10 mmHg. NOTA: La medición diastólica final podría disminuir durante la medición, preferiblemente a partir de cerca de 10 mmHg.</li>
	<li>Cambie el nombre de un canal vacío a dP/dt. En el menú desplegable, seleccione Derivada | canal de origen como Presión del ventrículo. El canal registrará la relación de cambio de presión en la cavidad ventricular durante el período de contracción.</li>
	<li>Seleccione un período de medición estable y, a continuación, haga clic en Configuración en el módulo Presión arterial.<ol><li>Seleccione la presión del ventrículo como canal de entrada y haga clic en selección para un período de cálculo | De acuerdo.</li>
		<li>Haga clic en la vista Clasificador para eliminar el ciclo cardíaco atípico (por ejemplo, tiempo de ciclo o presión anormal).</li>
		<li>Haga clic en la vista de tabla para generar las tablas del promedio de dP/dt máximo (contracción) y dP/dt (relajación) mínimo para el período seleccionado. NOTA: Guarde el archivo de registro de cada muestra y guarde la tabla de la función cardíaca promedio para el análisis estadístico.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Kim, I. C., Youn, J. C., Kobashigawa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+past%2C+present+and+future+of+heart+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Korean+Circulation+Journal%22%5BJournal%5D)">The past, present and future of heart transplantation.</a> Korean Circulation Journal. 48 (7), 565-590 (2018).</li>
<li>Gaffey, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+%26%2334%3Bhigh-risk%26%2334%3B+donor+hearts%3A+Implications+for+infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Transplantation of &#34;high-risk&#34; donor hearts: Implications for infection.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 152 (1), 213-220 (2016).</li>
<li>Hsich, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matching+the+market+for+heart+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%3A+Heart+Failure%22%5BJournal%5D)">Matching the market for heart transplantation.</a> Circulation: Heart Failure. 9 (4), 002679(2016).</li>
<li>Piperata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+transplantation+in+the+new+era+of+extended+donor+criteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiac+Surgery%22%5BJournal%5D)">Heart transplantation in the new era of extended donor criteria.</a> Journal of Cardiac Surgery. 36 (12), 4828-4829 (2021).</li>
<li>Huckaby, L. V., Hickey, G., Sultan, I., Kilic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+the+utilization+of+marginal+donors+for+orthotopic+heart+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiac+Surgery%22%5BJournal%5D)">Trends in the utilization of marginal donors for orthotopic heart transplantation.</a> Journal of Cardiac Surgery. 36 (4), 1270-1276 (2021).</li>
<li>Singh, S. S. A., Dalzell, J. R., Berry, C., Al-Attar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+graft+dysfunction+after+heart+transplantation%3A+a+thorn+amongst+the+roses%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Failure+Reviews%22%5BJournal%5D)">Primary graft dysfunction after heart transplantation: a thorn amongst the roses.</a> Heart Failure Reviews. 24 (5), 805-820 (2019).</li>
<li>Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+heart+perfusion%3A+the+Langendorff+technique+of+isolated+heart+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).</li>
<li>Rossello, X., Hall, A. R., Bell, R. M., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Langendorff+perfused+isolated+mouse+heart+model+of+global+ischemia-reperfusion+injury%3A+impact+of+ischemia+and+reperfusion+length+on+infarct+size+and+LDH+release%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Langendorff perfused isolated mouse heart model of global ischemia-reperfusion injury: impact of ischemia and reperfusion length on infarct size and LDH release.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 21 (3), 286-295 (2016).</li>
<li>Matsuura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+inotropic+effects+of+ATP+released+via+the+maxi-anion+channel+in+Langendorff-perfused+mouse+hearts+subjected+to+ischemia-reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+Development+Biology%22%5BJournal%5D)">Positive inotropic effects of ATP released via the maxi-anion channel in Langendorff-perfused mouse hearts subjected to ischemia-reperfusion.</a> Frontiers in Cell Development Biology. 9, 597997(2021).</li>
<li>Tse, G., Hothi, S. S., Grace, A. A., Huang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventricular+arrhythmogenesis+following+slowed+conduction+in+heptanol-treated%2C+Langendorff-perfused+mouse+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Ventricular arrhythmogenesis following slowed conduction in heptanol-treated, Langendorff-perfused mouse hearts.</a> The Journal of Physiological Sciences. 62 (2), 79-92 (2012).</li>
<li>Kobashigawa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Report+from+a+consensus+conference+on+primary+graft+dysfunction+after+cardiac+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Heart+and+Lung+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Report from a consensus conference on primary graft dysfunction after cardiac transplantation.</a> The Journal of Heart and Lung Transplantation. 33 (4), 327-340 (2014).</li>
<li>Lei, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+inflammatory+responses+of+the+native+left+and+right+ventricle+associated+with+donor+heart+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Differential inflammatory responses of the native left and right ventricle associated with donor heart preservation.</a> Physiological Reports. 9 (17), 15004(2021).</li>
<li>Miller, A., Wright, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+murine+ventricular+balloons+for+the+Langendorff+heart+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology+%26+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Fabrication of murine ventricular balloons for the Langendorff heart preparation.</a> Journal of Biotechnology & Biomaterials. 1 (101), (2011).</li>
<li>Madsen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+immunology+of+heart+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Heart+and+Lung+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Advances in the immunology of heart transplantation.</a> The Journal of Heart and Lung Transplantation. 36 (12), 1299-1305 (2017).</li>
<li>Voelkel, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Right+ventricular+function+and+failure%3A+report+of+a+National+Heart%2C+Lung%2C+and+Blood+Institute+working+group+on+cellular+and+molecular+mechanisms+of+right+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Right ventricular function and failure: report of a National Heart, Lung, and Blood Institute working group on cellular and molecular mechanisms of right heart failure.</a> Circulation. 114 (17), 1883-1891 (2006).</li>
</ol>

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que revelar.

Este protocolo describe el método de Langendorff de perfusión retrógrada mediante canulación aórtica. Esta técnica se puede utilizar para evaluar la función del VI y el VD de los corazones murinos después del almacenamiento en frío. Los resultados muestran que el almacenamiento prolongado en frío de los corazones de los donantes conduce a una reducción de la función cardíaca tanto en el VI como en el VD utilizando este protocolo. 
Los estudios de rechazo agudo y crónico después del trasplante cardíaco se centran ampliamente en la inmunobiología14. Los efectos de las células nativas sobre el DGP durante el almacenamiento en frío están menos bien examinados. El DGP ocurre en ~10%-20% de los trasplantes de corazón y representa el 66% de las muertes prematuras dentro de los 30 días posteriores al trasplante. En particular, la incidencia de DGP que afecta al VI frente al VD difiere después del trasplante11. Sin la contribución de las respuestas celulares receptoras, este método ex vivo se centra en las contribuciones de las células cardíacas nativas al DGP después de la preservación en frío de los corazones de los donantes. Es posible que otros estudios incorporen las respuestas de los receptores en un modelo de trasplante cardíaco murino. 
En este protocolo, la perfusión de Langendorff de corazones de donantes conservados en frío se centró en las respuestas cardíacas nativas a la perfusión cristaloide caliente sin infiltrar la inmunidad celular. Para lograr resultados reproducibles, se estandarizaron varios pasos críticos. Los corazones de ratón se detuvieron con una solución de HTK y se almacenaron en HTK helado, de forma similar a la práctica clínica. El volumen de perfusión y el tiempo de infusión de la solución HTK para cada corazón se monitorizaron de cerca con un temporizador. El corazón del donante se mantuvo en tubos preenfriados sobre hielo que contenía HTK en una habitación a 4 °C. El tiempo de canulación se estandarizó a ~3 min antes de la perfusión. Todos estos pasos aseguraron que la duración de la conservación en frío fuera la variable principal en el estudio. 
Un período de contractilidad cardíaca irregular durante ~20 min se observó comúnmente al comienzo de la perfusión. Este período de equilibrio y recuperación se vio facilitado por el calentamiento gradual y la oxigenación de los tejidos cardíacos. Se esperaba un período relativamente estable después de los 20 minutos iniciales. El balón se insertó en la cavidad ventricular a ~18 min después del período de equilibrio inicial. Comenzamos a registrar la hemodinámica después de que el corazón estuviera estable durante ~ 25 minutos, una vez que se insertó el balón. La perfusión con tampón KH mantuvo un rendimiento cardíaco estable durante ~1,5-2 h. Por lo tanto, se optó por registrar la hemodinámica durante 20 min en cada uno de los ventrículos izquierdo y derecho.
Existen varias limitaciones de la perfusión retrógrada para estudiar el DGP de los corazones después del almacenamiento en frío. En primer lugar, debido al tamaño del balón y a la falta de espacio en cada cavidad ventricular (en particular, en el VD), la inserción simultánea de dos balones tanto en el VI como en el VD es muy difícil. Por lo tanto, medimos la función del VD y el VI secuencialmente. Es importante tener en cuenta que el tabique interventricular contribuye significativamente a la función ventricular izquierda y derecha. El tabique contribuye al ~50% de la función ventricular derecha, por lo que existe dependencia interventricular15. También es importante tener en cuenta que, mientras que los procedimientos para la reperfusión del corazón murino en el dispositivo Langendorff duran ~3 min, la implantación quirúrgica del corazón humano en el campo quirúrgico relativamente cálido tarda ~45 min. En comparación, el corazón murino en este sistema de Langendorff incurre en menos tiempo isquémico. Esto debe tenerse en cuenta a la hora de considerar la traslación clínica.
Dado que usamos el tampón KH para perfundir el corazón sin sangre, esto también puede tener menos eficiencia en el suministro de oxígeno. Sin embargo, la función cardíaca es relativamente estable durante las 1,5-2 h iniciales de perfusión, lo que permite mediciones hemodinámicas fiables. Desafortunadamente, actualmente no existen modelos viables de perfusión cardíaca que funcionen para estos corazones murinos más pequeños, y el efecto de la carga ventricular no se puede evaluar en este sistema. A pesar de esto, el sistema de perfusión es altamente reproducible y requiere menos mano de obra y tiempo que los modelos de trasplante. También es menos costoso que los estudios de trasplante, lo que puede hacerlo más adecuado para el cribado de diferentes opciones terapéuticas y diversas vías moleculares. Con modificaciones en las soluciones de conservación mediante la adición de fármacos candidatos, esta plataforma se puede utilizar para evaluar los efectos de los agentes farmacológicos en la reducción del DGP tanto en el VI como en el VD.

El trasplante cardíaco mejora la supervivencia y la calidad de vida en pacientes con insuficiencia cardíaca terminal1. Desafortunadamente, la escasez de donantes de corazón limita el número de pacientes que podrían beneficiarse de esta terapia y limita la capacidad de los médicos para hacer coincidir de manera óptima a los donantes con los receptores 2,3,4. Además, el nuevo sistema de asignación ha contribuido a prolongar los tiempos de isquemia y ha aumentado significativamente el uso de donantes marginales desde 20185. En consecuencia, la edad media de los donantes de corazón y el tiempo isquémico aumentan con el tiempo, lo que lleva a una mayor tasa de disfunción primaria del injerto (DGP) a pesar de las mejoras significativas en las estrategias de preservación del corazón 6.
El DGP puede afectar al ventrículo izquierdo, al derecho o a ambos, y sigue siendo una complicación potencialmente mortal que representa la principal causa de muerte prematura después de un trasplante de corazón. La investigación de los mecanismos de la PDG y el desarrollo de estrategias para una mejor preservación del corazón son consideraciones importantes, dado el impacto potencial para salvar vidas en los receptores de corazón. Por lo tanto, los modelos experimentales que permiten una evaluación robusta y fiable de la función cardíaca del donante después de un tiempo de almacenamiento prolongado son esenciales para aumentar nuestra comprensión del DGP y facilitar el desarrollo de nuevas terapias. La capacidad de evaluar con precisión la función cardíaca en el corazón del ratón permite acceder a un vasto repertorio de modelos murinos transgénicos que pueden identificar con precisión los mecanismos del DGP.
En estudios fisiológicos y farmacológicos, el modelo de perfusión retrógrada de Langendorff es ampliamente utilizado para evaluar la función cardíaca7. Específicamente, el rendimiento cardíaco se detecta mediante un balón de silicona conectado a un transductor de presión dentro de la cavidad ventricular izquierda (VI). Una característica clave del DGP es la contracción y relajación inadecuadas del músculo ventricular. Los estudios previos de Langendorff se han centrado en el uso de un balón del VI para producir resultados fiables y reproducibles en la evaluación funcional del VI 8,9,10. Sin embargo, el uso de un balón intracavitario para evaluar la función del ventrículo derecho (VD) mediante el sistema de balón es menos reconocido.
Dada una tasa significativa de DGP que afecta al VD después del trasplante11, los métodos experimentales para estudiar la función tanto del VI como del VD ayudarían a determinar los mecanismos moleculares y fisiológicos que contribuyen al DGP del VD. Este protocolo muestra que los balones de silicona intracavitarios pueden proporcionar evaluaciones fiables de la función del VI y del VD en el mismo corazón murino12. Para evaluar el uso potencial del sistema de Langendorff en el estudio de DGP, examinamos las funciones cardíacas con diferentes períodos de almacenamiento y encontramos una disminución de la función cardíaca en la contracción y relajación con el almacenamiento prolongado en frío de los corazones murinos. Curiosamente, el VI tiene una mayor reducción funcional que el VD. En resumen, el protocolo descrito aquí se puede utilizar para evaluar el efecto de un fármaco candidato y las vías moleculares en la función del VI y del VD. La capacidad de utilizar este método en corazones murinos facilitará la realización de estudios mecanicistas detallados.

<table><tbody><tr><td>Sutura de seda 4-0</td><td>Braintree Scientific</td><td>SUTS108</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Sutura de seda</td><td>Braintree Scientific</td><td>SUTS104</td><td></td></tr><tr><td>Harina para todo uso</td><td>Kroger</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Uso general y precisiónGlide Agujas hipodérmicas 22 g</td><td>Fisher scientific</td><td>14-826-5A</td><td></td></tr><tr><td>BD Jeringa con puntas Luer-Lok (sin aguja)</td><td>Fisher scientific</td><td>14-823-16E</td><td></td></tr><tr><td>Jarabe de maíz</td><td>Kroger</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Custodiol HTK Solution</td><td>Essential Pharmaceuticals LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de disección&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>14393/14394</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL tubos cónicos</td><td>Fisher scientific</td><td>14-959-49A</td> Heparina sal sódica de la mucosa intestinal porcina<td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H4784</td><td></td></tr><tr><td>Krebs Tampón Henseleit</td><td>Sigma</td><td>K3753</td><td></td></tr><tr><td>Nusil dispersiones de silicona</td><td>Avantor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de perfusión</td><td>Radnoti</td><td>130101BEZ</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab</td><td>ADInstrumentos</td><td>PL3508</td><td></td></tr><tr><td>Azida de sodio</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Xilacina</td><td>Sigma</td><td>X1126</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluación de la función biventricular murina ex vivo en un modelo de langendorff

Assessment of Ex Vivo Murine Biventricular Function in a Langendorff Model

La disfunción primaria del injerto (DGP) sigue siendo la principal causa de muerte prematura tras el trasplante de corazón. El tiempo isquémico prolongado durante la conservación en frío es un factor de riesgo importante para el DGP, y la evaluación fiable de la función cardíaca es esencial para estudiar las respuestas funcionales del corazón del donante después de la conservación en frío. El vídeo adjunto describe una técnica para evaluar la función ventricular derecha e izquierda murina mediante perfusión ex vivo basada en un modelo de Langendorff después de la conservación en frío durante diferentes duraciones. En resumen, el corazón se aísla y se almacena en una solución fría de histidina-triptófano-cetoglutarato (HTK). A continuación, el corazón se perfunde con un tampón de Kreb en un modelo de Langendorff durante 60 min. Se inserta un balón de silicona en el ventrículo izquierdo y derecho, y se registran los parámetros funcionales cardíacos (dP/dt, relaciones presión-volumen). Este protocolo permite la evaluación fiable de la función cardíaca después de diferentes protocolos de preservación cardíaca. Es importante destacar que esta técnica permite el estudio de las respuestas de preservación cardíaca específicamente en células cardíacas nativas. El uso de corazones murinos muy pequeños permite el acceso a una enorme variedad de ratones transgénicos para investigar los mecanismos del DGP.

Se cosecharon corazones de ratón C57Bl/6 adultos, de 3 meses de edad, y se montaron en el sistema Langendorff. El corazón del donante se almacenó en HTK durante 0 y 8 h, y luego se perfundió con tampón KH oxigenado. Se utilizó un balón de silicona conectado a un transductor de presión para medir la contracción y relajación de la función del VI y el VD.
Las presiones aórticas se mantuvieron en el rango de 70-80 mmHg. La frecuencia cardíaca fue comparable en corazones de ratón con 0 y 8 h de almacenamiento. Se examinó la función del VI y del VD mediante la medición de la presión sistólica y diastólica. Para determinar la dinámica de la presión se calculó dP/dt, una derivada para calcular la relación de cambio de presión. El número absoluto de dP/dt máx. y dP/dt min podría representar el nivel de contracción y relajación muscular. A las 0 h de almacenamiento, el VI presentó mayor presión sistólica en comparación con el VD (Figura 2C y Figura 3A). El VI mostró más contracción y relajación muscular que el VD después de la perfusión de 0 h de almacenamiento (Figura 2C y Figura 3B,C). Sin embargo, después de 8 h de almacenamiento en frío, tanto el VI como el VD mostraron una reducción funcional significativa en comparación con una línea de base de 0 h (Figura 2A-D y Figura 3B,C). Las disminuciones en la contracción cardíaca fueron más severas en el VI. Después de 8 h de almacenamiento, la contracción y relajación del VI fue del 25,1% y 30,7% de la línea basal de 0 h, mientras que el VD tuvo 32,5% y 29,1% de función en comparación con la línea de base de 0 h (Figura 3B,C). Estos resultados mostraron que el DGP del VI después de un almacenamiento prolongado tuvo una reducción de la contracción cardíaca más significativa que el VD.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64384/64384fig01.jpg"> Figura 1: Montaje y canulación del corazón del ratón . (A) Configuración general de la configuración de perfusión. 1. Reservorio de perfusión. 2. Cámara de oxigenación. 3. Cámara de trampa de aire. 4. Cámara cardíaca. 5. Interruptor de valor para flujo y presión constantes. 6 y 7. Entrada de oxígeno. (B) Corazones canulados con el RV en la parte delantera. (C) Posición del RV a cortar para abrir su cavidad. (D) Golpee el tubo del globo con la cánula. Abreviatura: VD = ventrículo derecho. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64384/64384fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64384/64384fig02.jpg"> Figura 2: Comparación de la función del VI frente al VD . (A) Registro de rastreo de dP/dt máx. y min en el VD y VI en el corazón del donante con 0 h de almacenamiento. (B) El registro de dP/dt máx. y min en el VD y VI en el corazón del donante con 8 h de almacenamiento. (C,D) Detalles de dP/dt, presión del VI, frecuencia cardíaca y presión de perfusión en el VI y el VD a las 0 h y 8 h. Abreviaturas: VD = ventrículo derecho; VI = ventrículo izquierdo; dP/dt = relación presión-tiempo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64384/64384fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64384/64384fig03.jpg"> Figura 3: Comparación de la función del VI frente al VD después del almacenamiento y la perfusión. (A) Presión sistólica y diastólica del VI y del VD después de 0 h y 8 h de almacenamiento. (B) DP/dt máx. y (C) dP/dt mín. del VI y del VD después de la perfusión con 0 h y 8 h de almacenamiento. Esta figura es de Lei et al.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64384/64384fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aquí se presenta un protocolo para cuantificar de forma fiable la función ventricular derecha e izquierda de los corazones de donantes después de la conservación en frío utilizando un sistema de perfusión ex vivo .

Evaluación de la función biventricular murina ex vivo en un modelo de Langendorff

Primary graft dysfunction (PGD) remains the leading cause of early death following heart transplantation. Prolonged ischemic time during cold preservation ...

Con el protocolo descrito, podemos comparar el corazón del donante, el ventrículo izquierdo y la función ventricular después de la preservación, y podemos examinar la diferencia de la biología de preservación en ambos ventrículos durante estos procesos de preservación. Esta técnica utiliza un sistema de perfusión ex vivo para examinar las funciones cardíacas después de la preservación. Proporciona herramientas robustas y fiables para detectar nuevos tratamientos con el fin de mejorar las funciones cardíacas del donante después de la preservación.Comience con la preparación de la masa como se describe en el texto y forme un pequeño trozo de masa en forma ovalada para obtener la cabeza. Colócalo al final de una hebra de espagueti seca. Sumerja la cabeza en la solución de azúcar ya preparada y retírela lentamente una vez que esté bien cubierta con una película delgada de la solución.Luego, suspenda la hebra de espagueti en un bloque de espuma de poliestireno u otros soportes para permitir la formación de una cubierta uniforme y brillante sobre la cabeza y séquela durante la noche. Al día siguiente, sumerja el molde en un elastómero de silicona disperso en xileno y vuelva a colocar la hebra de espagueti en el bloque de espuma de poliestireno a 37 grados centígrados durante dos horas o hasta que se seque. Repita este paso una vez más.Luego, coloca el molde en el agua para separar y recoger el globo. Guarde el balón en azida de sodio al 0,02%. Ahora, corta una punta de dos extremos romos de una aguja de calibre 22 y monta un extremo romo en el globo de silicona mientras que el otro extremo romo en un tubo de PE.Use una sutura de seda 4-0 para atar el globo en su lugar en la aguja. Tome el ratón C57Black/6 e inyecte intraperitonealmente 200 unidades de heparina en el abdomen del animal para su anticoagulación. Después de confirmar la anestesia adecuada con un pellizco en el dedo del pie, haga una incisión justo debajo del esternón.Y con unas tijeras, abre el pecho cortando el diafragma en las costillas. Luego, dobla la pared torácica anterior para exponer completamente el tórax antes de hacer un corte en la aorta descendente cerca del arco de la aorta. Ahora, transfiera el corazón, los pulmones y el timo del ratón a histidina-triptófano-cetoglutarato helado, o tampón HTK, para aislar los órganos.Exponga la aorta mediante la extirpación de cualquier tejido conectivo. Conecte el extremo de la aorta a una aguja de calibre 22 y átela con una sutura de seda 6-0. Asegúrese de que la cánula esté por encima de la raíz aórtica, para no interferir con la válvula aórtica.Perfundir la aorta durante aproximadamente 10 minutos con 10 mililitros de tampón HTK, previamente enfriado a cuatro grados centígrados. Dependiendo del tipo de experimento, almacene el corazón en un tubo de 50 mililitros con HTK helado durante ocho horas o realice inmediatamente la profusión. Para realizar la profusión, conecte el corazón montado en una aguja a la cánula en el aparato de Langendorff y átelo con una sutura de seda.Comience la profusión en un modo de flujo constante a tres mililitros por minuto, y luego, después de cambiar a un modo de presión constante a 70 a 80 milímetros de mercurio, ajuste la tasa de perfusión a aproximadamente seis mililitros por minuto. A continuación, conecte un globo de silicona desinflado lleno de agua a un transductor de presión y una jeringa llena de agua con un grifo de tres vías. Después de 15 a 20 minutos de un período de equilibrio después de la perfusión anterior, corte la aurícula derecha, o AR, e inserte el balón en el ventrículo derecho, o VD, a través de la AR. Use cinta adhesiva para sostener el balón dentro del ventrículo revisorino y minimice el área abierta de la artritis reumatoide para ayudar a sujetar el balón en el ventrículo.Después de 20 minutos de recolección de datos funcionales para el VD, corte la aurícula izquierda, o LA, e inserte un globo desinflado lleno de agua en el ventrículo izquierdo, o VI, a través de la LA. Use cinta adhesiva para sostener el globo dentro del LV.To calibrar el transductor de presión, primero llene una jeringa de 10 mililitros con solución salina tibia y conecte la jeringa a la cúpula a través de un grifo de tres vías. Abra el grifo y llene lentamente la cúpula con solución salina antes de cerrar todos los grifos y retirar la jeringa. Luego, conecte la cúpula llena al transductor conectando el manómetro al tercer extremo del grifo de tres vías.En el software de grabación, en el menú desplegable del canal que se conecta al transductor, seleccione la opción de Bridge Amp. Haga clic en 0 antes de iniciar la grabación para establecer la lectura del transductor en cero milímetros de mercurio. Después de varios segundos de grabación, empuje lentamente la jeringa y aumente la presión a 100.Haga clic en Detener para finalizar la grabación. En el cuadro de diálogo Conversión de unidades, seleccione el área de grabación de cero milímetros de mercurio y haga clic en la flecha a 1 antes de escribir cero milímetros de mercurio. Del mismo modo, seleccione el área de registro para 100 milímetros de mercurio.Haga clic en la flecha hasta 2 y escriba 100 milímetros de mercurio. Ahora, haga clic en Aceptar para calibrar el transductor. Una vez realizada la calibración, cambie el nombre del canal correspondiente al transductor de presión con el balón como Presión del ventrículo o Presión del ventrículo izquierdo, y comience a registrar cuando el corazón esté conectado al sistema.Después de insertar el balón en el ventrículo, ajuste el volumen de agua en el balón con una jeringa micrométrica a través del grifo de tres vías para mantener la presión diastólica final de cinco a 10 milímetros de mercurio. A continuación, cambie el nombre de un canal vacío a dP/dt y mantenga el canal de origen derivado como presión ventrícula. Este canal registra la relación del cambio de presión en la cavidad ventricular durante la contracción.Seleccione el período estable de medición antes de ir al ajuste en el módulo de presión arterial. A continuación, seleccione la presión del VI como canal de entrada y haga clic en la selección antes de pulsar OK. Ahora, haga clic en Vista de clasificador para eliminar cualquier ciclo cardíaco atípico y en Vista de tabla para generar las tablas para el promedio de dP/dt máximo y dP/dt mínimo para el período seleccionado. Cuando el corazón del ratón se almacenó en tampón HTK durante cero horas antes de la perfusión, se registró una presión sistólica más alta para el VI en comparación con el VD. Además, en comparación con el VD, el VI también mostró una contracción muscular significativamente mayor, así como relajación.Sin embargo, cuando se realizó la perfusión en el corazón después de someterlo a ocho horas de almacenamiento en frío, tanto el VI como el VD mostraron una reducción funcional significativa en comparación con la etapa de cero horas. Se observó que las disminuciones fueron más severas en el VI en comparación con el VD. La contracción y relajación del VI después de ocho horas de almacenamiento fueron del 25,1% y el 30,7% de la función correspondiente al almacenamiento de cero horas, mientras que el VD mostró el 32,5% y el 29,1% de la función, en comparación con la línea de base de cero horas. La indicación de la disfunción primaria del injerto del VI después de un almacenamiento prolongado fue más significativa que la del VD. La calidad de conservación depende en gran medida de la perfusión de HTK.Es importante asegurarse de que la perfusión sea consistente para comparar con precisión los diferentes tratamientos. Con una medición precisa de la función de preservación del corazón de un donante, este método puede adaptarse fácilmente a los fármacos de cribado que pueden mejorar la función cardíaca del donante y luego validarlo aún más utilizando un modelo de trasplante heterotópico.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

El objetivo es supervisar el estado redox mitocondrial de los corazones aislados dentro del contexto de la precarga fisiológica y presiones poscarga. Un modelo de trabajo biventricular corazón de conejo se presenta. De alta resolución espacio-temporal de imágenes de fluorescencia de NADH se utiliza para supervisar el estado redox mitocondrial del tejido epicárdico.

NADH fluorescencia de imágenes de biventricular aislada Trabajo corazones de conejo

En este video, realizamos la perfusión retrógrada de Langendorff de un corazón de ratón aislado. Durante el procedimiento, la actividad cardíaca del corazón se mantiene perfundiéndolo retrógradamente con una solución de perfusión a través de las arterias coronarias mediante una cánula insertada en la aorta ascendente. El modelo se utiliza para estudiar la fisiopatología cardíaca del corazón.

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Aquí, presentamos un protocolo para la modulación del sistema de nervioso autónomo intracardiaca y la evaluación de su influencia en la electrofisiología básica, arritmogénesis y campo dinámica utilizando una configuración de Langendorff ex vivo .

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