Evaluación de la función biventricular murina ex vivo en un modelo de Langendorff

Con el protocolo descrito, podemos comparar el corazón del donante, el ventrículo izquierdo y la función ventricular después de la preservación, y podemos examinar la diferencia de la biología de preservación en ambos ventrículos durante estos procesos de preservación. Esta técnica utiliza un sistema de perfusión ex vivo para examinar las funciones cardíacas después de la preservación. Proporciona herramientas robustas y fiables para detectar nuevos tratamientos con el fin de mejorar las funciones cardíacas del donante después de la preservación.

Comience con la preparación de la masa como se describe en el texto y forme un pequeño trozo de masa en forma ovalada para obtener la cabeza. Colócalo al final de una hebra de espagueti seca. Sumerja la cabeza en la solución de azúcar ya preparada y retírela lentamente una vez que esté bien cubierta con una película delgada de la solución.

Luego, suspenda la hebra de espagueti en un bloque de espuma de poliestireno u otros soportes para permitir la formación de una cubierta uniforme y brillante sobre la cabeza y séquela durante la noche. Al día siguiente, sumerja el molde en un elastómero de silicona disperso en xileno y vuelva a colocar la hebra de espagueti en el bloque de espuma de poliestireno a 37 grados centígrados durante dos horas o hasta que se seque. Repita este paso una vez más.

Luego, coloca el molde en el agua para separar y recoger el globo. Guarde el balón en azida de sodio al 0,02%. Ahora, corta una punta de dos extremos romos de una aguja de calibre 22 y monta un extremo romo en el globo de silicona mientras que el otro extremo romo en un tubo de PE.

Use una sutura de seda 4-0 para atar el globo en su lugar en la aguja. Tome el ratón C57Black/6 e inyecte intraperitonealmente 200 unidades de heparina en el abdomen del animal para su anticoagulación. Después de confirmar la anestesia adecuada con un pellizco en el dedo del pie, haga una incisión justo debajo del esternón.

Y con unas tijeras, abre el pecho cortando el diafragma en las costillas. Luego, dobla la pared torácica anterior para exponer completamente el tórax antes de hacer un corte en la aorta descendente cerca del arco de la aorta. Ahora, transfiera el corazón, los pulmones y el timo del ratón a histidina-triptófano-cetoglutarato helado, o tampón HTK, para aislar los órganos.

Exponga la aorta mediante la extirpación de cualquier tejido conectivo. Conecte el extremo de la aorta a una aguja de calibre 22 y átela con una sutura de seda 6-0. Asegúrese de que la cánula esté por encima de la raíz aórtica, para no interferir con la válvula aórtica.

Perfundir la aorta durante aproximadamente 10 minutos con 10 mililitros de tampón HTK, previamente enfriado a cuatro grados centígrados. Dependiendo del tipo de experimento, almacene el corazón en un tubo de 50 mililitros con HTK helado durante ocho horas o realice inmediatamente la profusión. Para realizar la profusión, conecte el corazón montado en una aguja a la cánula en el aparato de Langendorff y átelo con una sutura de seda.

Comience la profusión en un modo de flujo constante a tres mililitros por minuto, y luego, después de cambiar a un modo de presión constante a 70 a 80 milímetros de mercurio, ajuste la tasa de perfusión a aproximadamente seis mililitros por minuto. A continuación, conecte un globo de silicona desinflado lleno de agua a un transductor de presión y una jeringa llena de agua con un grifo de tres vías. Después de 15 a 20 minutos de un período de equilibrio después de la perfusión anterior, corte la aurícula derecha, o AR, e inserte el balón en el ventrículo derecho, o VD, a través de la AR. Use cinta adhesiva para sostener el balón dentro del ventrículo revisorino y minimice el área abierta de la artritis reumatoide para ayudar a sujetar el balón en el ventrículo.

Después de 20 minutos de recolección de datos funcionales para el VD, corte la aurícula izquierda, o LA, e inserte un globo desinflado lleno de agua en el ventrículo izquierdo, o VI, a través de la LA. Use cinta adhesiva para sostener el globo dentro del LV.To calibrar el transductor de presión, primero llene una jeringa de 10 mililitros con solución salina tibia y conecte la jeringa a la cúpula a través de un grifo de tres vías. Abra el grifo y llene lentamente la cúpula con solución salina antes de cerrar todos los grifos y retirar la jeringa. Luego, conecte la cúpula llena al transductor conectando el manómetro al tercer extremo del grifo de tres vías.

En el software de grabación, en el menú desplegable del canal que se conecta al transductor, seleccione la opción de Bridge Amp. Haga clic en 0 antes de iniciar la grabación para establecer la lectura del transductor en cero milímetros de mercurio. Después de varios segundos de grabación, empuje lentamente la jeringa y aumente la presión a 100.

Haga clic en Detener para finalizar la grabación. En el cuadro de diálogo Conversión de unidades, seleccione el área de grabación de cero milímetros de mercurio y haga clic en la flecha a 1 antes de escribir cero milímetros de mercurio. Del mismo modo, seleccione el área de registro para 100 milímetros de mercurio.

Haga clic en la flecha hasta 2 y escriba 100 milímetros de mercurio. Ahora, haga clic en Aceptar para calibrar el transductor. Una vez realizada la calibración, cambie el nombre del canal correspondiente al transductor de presión con el balón como Presión del ventrículo o Presión del ventrículo izquierdo, y comience a registrar cuando el corazón esté conectado al sistema.

Después de insertar el balón en el ventrículo, ajuste el volumen de agua en el balón con una jeringa micrométrica a través del grifo de tres vías para mantener la presión diastólica final de cinco a 10 milímetros de mercurio. A continuación, cambie el nombre de un canal vacío a dP/dt y mantenga el canal de origen derivado como presión ventrícula. Este canal registra la relación del cambio de presión en la cavidad ventricular durante la contracción.

Seleccione el período estable de medición antes de ir al ajuste en el módulo de presión arterial. A continuación, seleccione la presión del VI como canal de entrada y haga clic en la selección antes de pulsar OK. Ahora, haga clic en Vista de clasificador para eliminar cualquier ciclo cardíaco atípico y en Vista de tabla para generar las tablas para el promedio de dP/dt máximo y dP/dt mínimo para el período seleccionado. Cuando el corazón del ratón se almacenó en tampón HTK durante cero horas antes de la perfusión, se registró una presión sistólica más alta para el VI en comparación con el VD. Además, en comparación con el VD, el VI también mostró una contracción muscular significativamente mayor, así como relajación.

Sin embargo, cuando se realizó la perfusión en el corazón después de someterlo a ocho horas de almacenamiento en frío, tanto el VI como el VD mostraron una reducción funcional significativa en comparación con la etapa de cero horas. Se observó que las disminuciones fueron más severas en el VI en comparación con el VD. La contracción y relajación del VI después de ocho horas de almacenamiento fueron del 25,1% y el 30,7% de la función correspondiente al almacenamiento de cero horas, mientras que el VD mostró el 32,5% y el 29,1% de la función, en comparación con la línea de base de cero horas. La indicación de la disfunción primaria del injerto del VI después de un almacenamiento prolongado fue más significativa que la del VD. La calidad de conservación depende en gran medida de la perfusión de HTK.

Es importante asegurarse de que la perfusión sea consistente para comparar con precisión los diferentes tratamientos. Con una medición precisa de la función de preservación del corazón de un donante, este método puede adaptarse fácilmente a los fármacos de cribado que pueden mejorar la función cardíaca del donante y luego validarlo aún más utilizando un modelo de trasplante heterotópico.