Focalización génica altamente eficiente mediada por CRISPR/Cas9 en células madre embrionarias para desarrollar modelos de ratón manipulados genéticamente

La producción de ratones modificados genéticamente y el análisis de su fenotipo nos permite comprender las funciones genéticas específicas en detalle, in vivo. Se han descubierto numerosos hallazgos importantes utilizando modelos animales modificados genéticamente. El método que describimos aquí permite que el ADN largo implante células madre con una eficiencia aceptable sin selección de fármacos.

La técnica es beneficiosa no solo para las ciencias básicas de la vida, sino que los hallazgos también se implementarán en ciencias aplicadas como la ciencia médica y la ciencia animal. Demostrando el procedimiento estarán el Dr. Chihiro Emori, profesor asistente, y el Dr. Manabu Ozawa, profesor asociado de mi laboratorio. Después de preparar el fibroblasto embrionario de ratón, prepare el plato de cultivo celular recubierto de gelatina como se describe en el manuscrito e incube durante dos horas en una incubadora húmeda.

Retire la solución de gelatina, lave el plato dos veces con PBS y guárdelo a temperatura ambiente hasta que lo use. Descongele las existencias de MEF congeladas mitóticamente inactivadas utilizando un baño de agua templado a 37 grados centígrados durante un minuto. Un día antes de la siembra de ESC, coloque el MEF en un plato de 60 milímetros recubierto de gelatina.

Descongele un tubo de ESC congelado como se mostró anteriormente y colóquelo una vez de 10 a cinco ESC en un plato de 60 milímetros que contenga MEF presembrado. Luego, agregue cuatro mililitros de medio de cultivo ESC e incube el plato hasta que el ESC alcance 50 a 70% de confluencia. Después de lavar el ESC cultivado con cuatro mililitros de PBS, digerirlos con 800 microlitros de solución de EDTA de tripsina al 0,25% durante cinco minutos a 37 grados centígrados.

Una vez que la tripsina se inactiva con un mililitro de ESCM, agregue un mililitro de ESCM fresco a las células, transfiera el medio a un tubo y granule las células por centrifugación a 280 G durante cinco minutos. Después de resuspender las células en un mililitro de ESCM fresco, cuente la concentración celular usando un contador celular con tinción de azul de tripano. Después de transferir una vez 10 a la quinta ESC a un nuevo tubo de 1,5 mililitros y lavarlas tres veces con PBS por centrifugación, resuspenda el pellet de ESC en 12 microlitros de mezcla de ADN Cas9 RNP y mezcle bien con un pipeteo suave para evitar burbujeos.

Luego, sirva el ESC suspendido para electroporación. A continuación, cultive las ESC electroporadas en un plato de 60 milímetros que contenga cuatro mililitros de ECSM con MEF mitóticamente inactivada y siga cambiando el medio diariamente. De tres a cinco días después de la electroporación, lavar las ESCs con cuatro mililitros de PBS y luego digerirlas con 800 microlitros de 0,25% de tripsina EDTA y cultivar en una incubadora húmeda.

Después, agregue dos mililitros de ESCM para detener la digestión de tripsina. Una vez que la mezcla celular esté peletizada, resuspenda el pellet en un mililitro de ESCM fresco y cuente la concentración celular usando un contador celular con tinción de azul de tripano. Pasar las ESC a una vez 10 a la tercera celda por plato de 60 milímetros que contenga ESCM y MEF de alimentación.

Asegúrese de cambiar el medio hasta que la colonia se recupere. De cinco a siete días después del primer paso, una vez que el ESCM esté aspirado de la placa de cultivo ESC, agregue cuatro mililitros de PBS. Usando una pipeta de 20 microlitros, recoja colonias ESC individuales con cinco microlitros de PBS bajo un microscopio estereoscópico.

Coloque las colonias individuales en un pocillo de una placa de fondo redondo de 96 pocillos que contenga 15 microlitros de solución de EDTA de tripsina al 0,25%. Después de incubar la placa de 96 pocillos, detenga la digestión de tripsina agregando 80 microlitros de ESCM y disociando las colonias de ESC en células individuales mediante pipeteo. Para el genotipado por PCR, transfiera 40 microlitros de suspensión de ESC a una placa de 96 pocillos recubierta de gelatina, sin alimentador, que contenga 50 microlitros de ESCM por pocillo.

Para hacer el stock de ESC congelado, transfiera los 60 microlitros restantes de suspensión de ESC a un pocillo de una placa de 24 pocillos recubierta de gelatina que contenga 500 microlitros de ESCM y MEF de alimentación. Stock clones individuales de ESC cultivados en la placa de 24 pocillos hasta que alcancen 60 a 80% de confluencia y recuperar clones ESC individuales por tripsinización, como se demostró anteriormente. Después de obtener el pellet celular por centrifugación, resuspender el en 500 microlitros de medio de congelación celular para congelar las células a menos 80 grados centígrados.

Para el genotipado por PCR, cultivar clones de ESC como se demostró anteriormente y eliminar ESCM de cada pocillo por aspiración antes de lavarlo con 100 microlitros de PBS dos veces. Después de aspirar el PBS, agregue 100 microlitros de tampón de lisis que contenga proteinasa K y mezcle bien. Ahora transfiera el lisado ESC a un nuevo tubo de 1,5 mililitros y manténgalo en una cámara de calor a 65 grados centígrados durante al menos una hora.

Una vez que el ADN genómico se disuelve en 20 microlitros de agua libre de DNasa, determine la pureza y concentración de ADN utilizando un espectrofotómetro. Después de realizar la PCR genómica utilizando conjuntos de cebadores específicos del locus para amplificar la región objetivo, verifique la secuencia y elija los clones de ESC con las secuencias de knock-in deseadas. Después de aparear las hembras tratadas con la hormona con los machos ICR y recolectar el oviducto, coloque los oviductos recolectados en gotas de FHM y recupere los embriones en etapa de dos o cuatro células lavando el oviducto con FHM usando una aguja de lavado insertada en el infundíbulo.

Lave los embriones recolectados moviéndolos en varias gotas frescas de FHM con una pipeta bucal. Cultive los embriones en 50 microlitros de gotas de KSOM en una placa de cultivo celular de 35 milímetros cubierta con aceite mineral, como se demostró anteriormente, durante un día hasta que se alcance la etapa de ocho células o mórula. Preparar pipetas de vidrio para sujetar los embriones y la inyección de ESC utilizando un extractor y microforja.

Después de integrar una pipeta de sujeción que contiene FHM en un soporte capilar conectado a un microinyector, colóquela en el lado izquierdo del micromanipulador. Conecte una pipeta de inyección a otro microinyector y configúrela en el lado derecho. Alinee las dos pipetas directamente en el campo de visión del microscopio.

Haga gotas de cinco microlitros de pirrolidona de polivinilo al 12% y gotas de cinco microlitros de FHM en la misma tapa de un plato de 60 milímetros, una al lado de la otra. Cubra las gotas con aceite mineral. Transfiera los embriones en cinco microlitros de gota de FHM y agregue de uno a cinco microlitros de la suspensión ESC a la gota de FHM que contiene embriones.

Una vez lavada la pipeta de inyección con polivinil pirrolidona, mueva la pipeta de inyección a la gota que contiene los embriones y las ESC. Elija tres dobletes ESC individuales que acaban de terminar su división celular en la pipeta de inyección. Usando la pipeta de sujeción, sostenga un embrión de ocho células o en estadio de mórula que haya completado la compactación por aspiración y haga un agujero en la zona pelúcida con un pulso piezoeléctrico.

Expulsar la ESC de seis células dentro de la zona pelúcida y sacar la pipeta de los embriones. Lave suavemente los embriones inyectados con ESC con varias gotas de KSOM usando una pipeta bucal e incubarlos en una nueva gota de KSOM de 50 microlitros cubierta con aceite mineral, como se demostró anteriormente, hasta que los embriones se desarrollen hasta la etapa de blastocisto. Se obtiene un amplicón de PCR de tamaño específico para el objetivo knock-in y 9 de los 22 clones mostraron una banda específica knock-in.

Estos resultados son eficientes y reproducibles para la entrada de genes sin ninguna selección de medicamentos. Recoger el tamaño óptimo de las colonias ESC es muy importante para este procedimiento. Evite seleccionar colonias que sean demasiado grandes o demasiado pequeñas.

La edición directa del genoma mediada por CRISPR Cas9 utilizando un cigoto sería aplicable para hacer ratones simples que eliminan genes. Este protocolo de orientación de genes ESC mediado por CRISPR Cas9 facilita la producción de varios ratones modificados genéticamente para futuros análisis en ciencias de la vida.