Name: Aislamiento de vectores de terapia génica de próxima generación a través de ingeniería, códigos de barras y detección de variantes de cápside del virus adenoasociado (AAV) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Aprende a aislar vectores de terapia génica de próxima generación mediante ingeniería de AAV, códigos de barras y detección de variantes de cápside. Este método permite el cribado de alta eficiencia para mejorar la especificidad y reducir dosis virales.

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D.G. agradece enormemente el apoyo de la Fundación Alemana de Investigación (DFG) a través de los Centros de Investigación Colaborativa DFG SFB1129 (Projektnummer 240245660) y TRR179 (Projektnummer 272983813), así como del Centro Alemán para la Investigación de Infecciones (DZIF, BMBF; TTU-VIH 04.819).

<ol><li>Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).</li>
<li>Muhuri, M., Levy, D. I., Schulz, M., McCarty, D., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Durability+of+transgene+expression+after+rAAV+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Durability of transgene expression after rAAV gene therapy.</a> Molecular Therapy. 30 (4), 1364-1380 (2022).</li>
<li>Li, C., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+adeno-associated+virus+vectors+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Engineering adeno-associated virus vectors for gene therapy.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (4), 255-272 (2020).</li>
<li>Kuzmin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+landscape+for+AAV+gene+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">The clinical landscape for AAV gene therapies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).</li>
<li>Mullard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+community+grapples+with+toxicity+issues%2C+as+pipeline+matures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Gene therapy community grapples with toxicity issues, as pipeline matures.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20 (11), 804-805 (2021).</li>
<li>Nature Biotechnology. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+at+the+crossroads%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Gene therapy at the crossroads.</a> Nature Biotechnology. 40 (5), 621(2022).</li>
<li>Becker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fantastic+AAV+Gene+Therapy+Vectors+and+How+to+Find+Them-Random+Diversification%2C+Rational+Design+and+Machine+Learning%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Fantastic AAV Gene Therapy Vectors and How to Find Them-Random Diversification, Rational Design and Machine Learning.</a> Pathogens. 11 (7), 756(2022).</li>
<li>Perabo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+viral+vectors+with+modified+tropism%3A+the+adeno-associated+virus+display%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display.</a> Molecular Therapy. 8 (1), 151-157 (2003).</li>
<li>Muller, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+peptide+libraries+displayed+on+adeno-associated+virus+to+select+for+targeted+gene+therapy+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors.</a> Nature Biotechnology. 21 (9), 1040-1046 (2003).</li>
<li>Dalkara, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo-directed+evolution+of+a+new+adeno-associated+virus+for+therapeutic+outer+retinal+gene+delivery+from+the+vitreous%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous.</a> Science Translational Medicine. 5 (189), (2013).</li>
<li>Sahel, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+recovery+of+visual+function+in+a+blind+patient+after+optogenetic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Partial recovery of visual function in a blind patient after optogenetic therapy.</a> Nature Medicine. 27 (7), 1223-1229 (2021).</li>
<li>Adachi, K., Enoki, T., Kawano, Y., Veraz, M., Nakai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drawing+a+high-resolution+functional+map+of+adeno-associated+virus+capsid+by+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Drawing a high-resolution functional map of adeno-associated virus capsid by massively parallel sequencing.</a> Nature Communications. 5, 3075(2014).</li>
<li>Marsic, D., Mendez-Gomez, H. R., Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-accuracy+biodistribution+analysis+of+adeno-associated+virus+variants+by+double+barcode+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">High-accuracy biodistribution analysis of adeno-associated virus variants by double barcode sequencing.</a> Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 2, 15041(2015).</li>
<li>Korbelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+targeting+of+adeno-associated+viral+vectors+by+next-generation+sequencing-guided+screening+of+random+capsid+displayed+peptide+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Pulmonary targeting of adeno-associated viral vectors by next-generation sequencing-guided screening of random capsid displayed peptide libraries.</a> Molecular Therapy. 24 (6), 1050-1061 (2016).</li>
<li>Deverman, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre-dependent+selection+yields+AAV+variants+for+widespread+gene+transfer+to+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 204-209 (2016).</li>
<li>Ravindra Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+Cre-dependent+selection+yields+systemic+AAVs+for+targeting+distinct+brain+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed Cre-dependent selection yields systemic AAVs for targeting distinct brain cell types.</a> Nature Methods. 17 (5), 541-550 (2020).</li>
<li>Hanlon, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+an+efficient+AAV+vector+for+robust+CNS+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Selection of an efficient AAV vector for robust CNS transgene expression.</a> Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 15, 320-332 (2019).</li>
<li>Nonnenmacher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+evolution+of+blood-brain-barrier-penetrating+AAV+capsids+by+RNA-driven+biopanning%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Rapid evolution of blood-brain-barrier-penetrating AAV capsids by RNA-driven biopanning.</a> Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 20, 366-378 (2021).</li>
<li>Tabebordbar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+a+family+of+AAV+capsid+variants+enabling+potent+muscle-directed+gene+delivery+across+species%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of a family of AAV capsid variants enabling potent muscle-directed gene delivery across species.</a> Cell. 184 (19), 4919-4938 (2021).</li>
<li>Davidsson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+capsid+evolution+approach+performed+in+vivo+for+the+design+of+AAV+vectors+with+tailored+properties+and+tropism%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A systematic capsid evolution approach performed in vivo for the design of AAV vectors with tailored properties and tropism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (52), 27053-27062 (2019).</li>
<li>Pekrun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+barcoded+AAV+capsid+library+to+select+for+clinically+relevant+gene+therapy+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation+Insight%22%5BJournal%5D)">Using a barcoded AAV capsid library to select for clinically relevant gene therapy vectors.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 4 (22), (2019).</li>
<li>Ogden, P. J., Kelsic, E. D., Sinai, S., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+AAV+capsid+fitness+landscape+reveals+a+viral+gene+and+enables+machine-guided+design%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comprehensive AAV capsid fitness landscape reveals a viral gene and enables machine-guided design.</a> Science. 366 (6469), 1139-1143 (2019).</li>
<li>Kondratov, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+study+of+a+29-capsid+AAV+library+in+a+non-human+primate+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">A comprehensive study of a 29-capsid AAV library in a non-human primate central nervous system.</a> Molecular Therapy. 29 (9), 2806-2820 (2021).</li>
<li>Weinmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+myotropic+AAV+by+massively+parallel+in+vivo+evaluation+of+barcoded+capsid+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Identification of a myotropic AAV by massively parallel in vivo evaluation of barcoded capsid variants.</a> Nature Communications. 11 (1), 5432(2020).</li>
<li>Kremer, L. P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+screening+of+novel+AAV+capsids+identifies+variants+for+transduction+of+adult+NSCs+within+the+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">High throughput screening of novel AAV capsids identifies variants for transduction of adult NSCs within the subventricular zone.</a> Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 23, 33-50 (2021).</li>
<li>Borner, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-arrayed+pan-AAV+peptide+display+libraries+for+rapid+single-round+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Pre-arrayed pan-AAV peptide display libraries for rapid single-round screening.</a> Molecular Therapy. 28 (4), 1016-1032 (2020).</li>
<li>Kienle, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+and+evolution+of+synthetic+adeno-associated+virus+%28AAV%29+gene+therapy+vectors+via+DNA+family+shuffling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Engineering and evolution of synthetic adeno-associated virus (AAV) gene therapy vectors via DNA family shuffling.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), e3819(2012).</li>
<li>Furuta-Hanawa, B., Yamaguchi, T., Uchida, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+droplet+digital+PCR+as+a+tool+for+titration+and+integrity+evaluation+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional droplet digital PCR as a tool for titration and integrity evaluation of recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Human Gene Therapy Methods. 30 (4), 127-136 (2019).</li>
<li>Lyons, E., Sheridan, P., Tremmel, G., Miyano, S., Sugano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+DNA+barcode+library+generation+for+biomolecule+identification+in+high-throughput+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Large-scale DNA barcode library generation for biomolecule identification in high-throughput screens.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13899(2017).</li>
<li>Korbelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+design+and+production+strategies+for+novel+adeno-associated+viral+display+peptide+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Optimization of design and production strategies for novel adeno-associated viral display peptide libraries.</a> Gene Therapy. 24 (8), 470-481 (2017).</li>
<li>Korbelin, J., Trepel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+successfully+screen+random+adeno-associated+virus+display+peptide+libraries+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">How to successfully screen random adeno-associated virus display peptide libraries in vivo.</a> Human Gene Therapy Methods. 28 (3), 109-123 (2017).</li>
<li>Herrmann, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+all-inclusive+pipeline+for+shuffling+of+adeno-associated+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22American+Chemical+Society+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">A robust and all-inclusive pipeline for shuffling of adeno-associated viruses.</a> American Chemical Society Synthetic Biology. 8 (1), 194-206 (2019).</li>
<li>Choudhury, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+selection+yields+AAV-B1+Capsid+for+central+nervous+system+and+muscle+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">In vivo selection yields AAV-B1 Capsid for central nervous system and muscle gene therapy.</a> Molecular Therapy. 24 (7), 1247-1257 (2016).</li>
<li>Buschmann, T., Bystrykh, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Levenshtein+error-correcting+barcodes+for+multiplexed+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Levenshtein error-correcting barcodes for multiplexed DNA sequencing.</a> BMC Bioinformatics. 14, 272(2013).</li>
<li>Buschmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNABarcodes%3A+an+R+package+for+the+systematic+construction+of+DNA+sample+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">DNABarcodes: an R package for the systematic construction of DNA sample tags.</a> Bioinformatics. 33 (6), 920-922 (2017).</li>
<li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+mouse+transcriptomic+BodyMap+across+17+tissues+by+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A comprehensive mouse transcriptomic BodyMap across 17 tissues by RNA-seq.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4200(2017).</li>
<li>Clarner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+one-step+RT-ddPCR+method+to+determine+the+expression+and+potency+of+AAV+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Development of a one-step RT-ddPCR method to determine the expression and potency of AAV vectors.</a> Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 23, 68-77 (2021).</li>
<li>Zolotukhin, S., Vandenberghe, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+capsid+design%3A+A+Goldilocks+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">AAV capsid design: A Goldilocks challenge.</a> Trends in Molecular Medicine. 28 (3), 183-193 (2022).</li>
<li>Brown, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((deep+parallel+characterization+of+AAV+tropism+and+AAV-mediated+transcriptional+changes+via+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">deep parallel characterization of AAV tropism and AAV-mediated transcriptional changes via single-cell RNA sequencing.</a> Frontiers in Immunology. 12, 730825(2021).</li>
</ol>

D.G. es cofundador de AaviGen GmbH. D.G. y K.R. son inventores en una solicitud de patente pendiente relacionada con la generación de variantes de cápside AAV que evaden el sistema inmunológico. El resto de los autores no tienen nada que revelar.

En este protocolo, se describen los pasos necesarios para la ingeniería de la cápside AAV de visualización de péptidos y para la detección de bibliotecas AAV con código de barras, así como para el análisis bioinformático de la composición de la biblioteca y el rendimiento de la cápside. Este protocolo se centra en los pasos que facilitan el análisis bioinformático de este tipo de bibliotecas, porque la mayoría de los laboratorios de virología están rezagados en las habilidades de programación para que coincidan con su co...

La terapia de transferencia de genes es la introducción de material genético en las células para reparar, reemplazar o alterar el material genético celular para prevenir, tratar, curar o mejorar la enfermedad. La transferencia de genes, tanto in vivo como ex vivo, se basa en diferentes sistemas de administración, no virales y virales. Los virus han evolucionado naturalmente para transducir eficientemente sus células diana y pueden ser utilizados como vectores de entrega. Entre los diferentes tipos de vectores virales empleados en la terapia génica, los virus adenoasociados se han utilizado cada vez más, debido a su falta de patogenicidad, seguridad, baja inmunogenicidad y, lo que es más importante, su capacidad para mantener la expresión no integradora a largo plazo 1,2,3. La terapia génica AAV ha producido logros considerables en la última década; tres terapias han sido aprobadas por la Agencia Europea de Medicamentos y la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos para su uso en humanos 3,4. También se están realizando varios ensayos clínicos para tratar una variedad de enfermedades, como la hemofilia, las enfermedades musculares, cardíacas y neurológicas, como se revisó en otra parte3. A pesar de décadas de avances, el campo de la terapia génica ha experimentado una serie de reveses en los últimos años4, sobre todo muertes en ensayos clínicos5 que se han suspendido debido a las toxicidades limitantes de la dosis, particularmente para tejidos que son masivos, como los músculos, o difíciles de alcanzar, como el cerebro6.
Los vectores AAV que se utilizan actualmente en ensayos clínicos pertenecen a los serotipos naturales con algunas excepciones1. La ingeniería AAV ofrece la oportunidad de desarrollar vectores con una especificidad y eficiencia superior de órganos o células. En las últimas dos décadas, se han aplicado con éxito varios enfoques, como la visualización de péptidos, el intercambio de bucles, la mezcla de ADN de la cápside, la PCR propensa a errores y el diseño dirigido, para generar variantes individuales de AAV o bibliotecas de las mismas con diversas propiedades7. Estos se someten a múltiples rondas de evolución dirigida para seleccionar las variantes dentro de ellos con las propiedades deseadas, como se revisa en otra parte 1,3. De todas las estrategias de evolución de la cápside, las bibliotecas AAV de visualización de péptidos han sido las más utilizadas, debido a algunas propiedades únicas: son relativamente fáciles de generar y pueden lograr una alta diversidad y una secuenciación de alto rendimiento, lo que permite seguir su evolución.
Las primeras bibliotecas AAV de inserción de péptidos exitosas se describieron hace casi 20 años. En uno de los primeros, Perabo et al.8 construyeron una biblioteca de cápsides AAV2 modificadas, en la que se insertó un conjunto de oligonucleótidos generados aleatoriamente en un plásmido en una posición que corresponde al aminoácido 587 de la proteína de la cápside VP1, en el eje triple que sobresale de la cápside. Utilizando la coinfección por adenovirus, la biblioteca AAV evolucionó a través de múltiples rondas de selección, y se demostró que las variantes finales redirigidas eran capaces de transducir líneas celulares refractarias al AAV2 parental8. Poco después, Müller et al.9 introdujeron el sistema de dos pasos para la producción bibliotecaria, una mejora significativa del protocolo. Inicialmente, la biblioteca de plásmidos, junto con un plásmido auxiliar adenoviral, se utilizan para producir una biblioteca AAV que contiene cápsides quiméricas. Esta biblioteca de lanzadera AAV se utiliza para infectar células a baja multiplicidad de infección (MOI), con el objetivo de introducir un genoma viral por célula. La coinfección con adenovirus asegura la producción de AAV con un genoma y una cápside9 coincidentes. Aproximadamente una década después, Dalkara10 utilizó la evolución dirigida in vivo para crear la variante de 7m8. Esta variante tiene una inserción de 10 aminoácidos (LALGETTRPA), tres de los cuales actúan como enlazadores, y se dirige eficientemente a la retina externa después de la inyección intravítrea10. Esta cápside diseñada es una historia de éxito excepcional, ya que es una de las pocas cápsides diseñadas para llegar a la clínica hasta ahora11.
El campo experimentó un segundo impulso con la introducción de técnicas de secuenciación de próxima generación (NGS). Dos publicaciones de Adachi et al.12 en 2014 y de Marsic et al.13 en 2015, mostraron el poder de NGS para rastrear la distribución de bibliotecas de cápside AAV con código de barras con alta precisión. Unos años más tarde, la NGS de las regiones con código de barras se adaptó a la región de inserción de péptidos para seguir la evolución de la cápside. Körbelin et al.14 realizaron un cribado guiado por NGS para identificar una cápside basada en AAV2 dirigida a los pulmones. El análisis NGS ayudó a calcular tres puntajes de calificación: el puntaje de enriquecimiento entre las rondas de selección, el puntaje de especificidad general para determinar la especificidad del tejido y, finalmente, el puntaje combinado14. El laboratorio Gradinaru15 publicó el sistema de evolución dirigida AAV (CREATE) basado en la recombinación de Cre en el mismo año, que facilita una selección específica del tipo de célula. En este sistema, la biblioteca de cápside lleva un interruptor invertible Cre, ya que la señal polyA está flanqueada por dos sitios loxP. Luego, la biblioteca AAV se inyecta en ratones Cre, donde la señal de poliA se invierte solo en células Cre+, proporcionando la plantilla para la unión de un cebador de PCR inversa con el cebador directo dentro del gen de la cápside. Este rescate de PCR altamente específico permitió la identificación del AAV-PHP. Variante B que puede atravesar la barrera hematoencefálica15. Este sistema evolucionó aún más en M-CREATE (Multiplexed-CREATE), en el que NGS y la generación de bibliotecas sintéticas se integraron en la tubería16.
Una versión mejorada basada en ARN de este sistema del laboratorio17 de Maguire, iTransduce, permite la selección a nivel de ADN de cápsides que transducen funcionalmente células y expresan sus genomas. El genoma viral de la biblioteca de visualización de péptidos comprende un gen Cre bajo el control de un promotor ubicuo y el gen de la cápside bajo el control del promotor p41. La biblioteca se inyecta en ratones que tienen un casete loxP-STOP-loxP aguas arriba de tdTomato. Las células transducidas con variantes AAV que expresan el genoma viral y, por lo tanto, Cre expresan tdTomato y, en combinación con marcadores celulares, pueden clasificarse y seleccionarse17. Del mismo modo, Nonnenmacher et al.18 y Tabebordbar et al.19 colocaron la biblioteca de genes de la cápside bajo el control de promotores específicos de tejido. Después de la inyección en diferentes modelos animales, se utilizó ARN viral para aislar las variantes de la cápside.
Un enfoque alternativo es usar códigos de barras para etiquetar las bibliotecas de cápside. El laboratorio20 de Björklund utilizó este enfoque para las bibliotecas de cápside de inserción de péptidos de códigos de barras y desarrolló la evolución racional del vector AAV con código de barras (BRAVE). En un plásmido, el casete Rep2Cap se clona junto a un transgén marcado con código de barras que expresa repeticiones terminales invertidas (ITR) y que expresa proteínas fluorescentes amarillas (YFP). Utilizando sitios loxP entre el final de la tapa y el comienzo del código de barras, una recombinación de Cre in vitro genera un fragmento lo suficientemente pequeño para NGS, lo que permite la asociación de la inserción del péptido con el código de barras único (tabla de búsqueda, LUT). La producción de AAV se realiza utilizando la biblioteca de plásmidos y los códigos de barras expresados en el ARNm se examinan después de la aplicación in vivo , nuevamente con NGS20. Cuando las bibliotecas de cápside comprenden variantes de todo el gen de la cápside (es decir, bibliotecas barajadas), se debe utilizar la secuenciación de lectura larga. Varios grupos han utilizado códigos de barras para etiquetar estas diversas bibliotecas, lo que permite que NGS tenga una mayor profundidad de lectura. El laboratorio Kay21 etiquetó bibliotecas barajadas de cápside muy diversas con códigos de barras aguas abajo de la señal de poliA de la tapa . En un primer paso, se generó una biblioteca de plásmidos con código de barras, y la biblioteca de genes de la cápside barajada se clonó en ella. Luego se utilizó una combinación de MiSeq (lectura corta, mayor profundidad de lectura) y PacBio (lectura larga, menor profundidad de lectura), así como la secuenciación de Sanger para generar su LUT21. En 2019, Ogden y sus colegas del laboratorio Church22 delinearon la aptitud de la cápside AAV2 para múltiples funciones utilizando bibliotecas que tenían mutaciones, inserciones y eliminaciones de un solo punto en cada posición, lo que finalmente permitió el diseño guiado por máquina. Para la generación de la biblioteca, se sintetizaron fragmentos más pequeños del gen de la cápside, se marcaron con un código de barras, se secuenciaron de próxima generación y luego se clonaron en el gen completo de la cápside. Los datos de NGS se utilizaron para generar una LUT. Luego, la biblioteca se examinó utilizando solo los códigos de barras y la secuenciación de lectura corta, lo que a su vez permite una mayor profundidad de lectura22.
Las bibliotecas con código de barras se han utilizado predominantemente para examinar un conjunto de variantes conocidas, naturales y de ingeniería después de varias rondas de selección de bibliotecas de cápside o independientes de un estudio de evolución de la cápside. La ventaja de tales bibliotecas es la oportunidad de examinar múltiples cápsides, al tiempo que reduce el número de animales y minimiza la variación entre los animales. Los primeros estudios que introdujeron esta tecnología en el campo de AAV se publicaron hace casi una década. El laboratorio Nakai 12 etiquetó 191 mutantes de alanina doble que cubrían los aminoácidos 356 a 736 en el VP1 de AAV9 con un par de códigos de barras de12 nucleótidos. Utilizando NGS, la biblioteca fue examinada in vivo para la unión a galactosa y otras propiedades12. Marsic y sus colegas delinearon la biodistribución de las variantes de AAV utilizando también un análisis de doble barra 1 año después13. Un estudio más reciente en primates no humanos comparó la biodistribución en el sistema nervioso central de 29 cápsides utilizando diferentes vías de entrega23. Nuestro laboratorio ha publicado recientemente pantallas de biblioteca AAV con código de barras de 183 variantes que incluían AAV naturales y de ingeniería. Estas pantallas a nivel de ADN y ARN condujeron a la identificación de una variante AAV24 altamente miotrópica en ratones, así como otras que muestran una alta especificidad de tipo celular en el cerebro del ratón25.
Aquí, describimos la metodología utilizada en este trabajo y la ampliamos para incluir la detección de las bibliotecas de visualización de péptidos AAV. Esto comprende la generación de bibliotecas de visualización de péptidos AAV2, un método de PCR digital de gotas (dd-PCR) para la cuantificación y, finalmente, una tubería NGS para analizar las variantes de AAV, basada en parte en el trabajo de Weinmann y colegas24. Finalmente, se proporciona una descripción de la generación de bibliotecas AAV con código de barras y la canalización NGS utilizada en la misma publicación.

<table><tbody><tr><td>Cebador de amplificación</td><td>ELLA Biotech (Múnich, Alemania)</td><td>-</td><td>Síntesis de segunda cadena de inserto de oligonucleótidos</td></tr><tr><td>Agilent DNA 1000 Reagents</td><td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, EE. UU.)</td> <td>5067-1504 Validación de fragmentos de</td><td>ADN</td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer System</td><td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, EE. UU.)</td><td>G2938C</td><td>Validación de fragmentos de ADN</td></tr><tr><td>AllPrep DNA/RNA Mini Kit &nbsp;</td><td>Qiagen (Venlo, Países Bajos)</td><td>80204</td><td>Extracción de ADN/ARN</td></tr><tr><td>Agilent DNA 1000 Reagents</td><td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, EE. UU.</td><td>)5067-1504 Preparación de</td><td>la biblioteca NGS</td></tr><tr><td>Sistema de bioanalizador Agilent 2100</td><td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, EE. UU.)</td><td>G2938C</td><td>Preparación de la biblioteca NGS</td></tr><tr><td>BC-seq fw:&nbsp;</td><td>IDT (San José, CA, CA, EE. UU.)</td><td>ATCACTCTCGGCATGGACGAGC&nbsp;</td><td>Preparación de la biblioteca NGS</td></tr><tr><td>BC-seq rv:&nbsp; &nbsp;</td><td>IDT (San Joce, CA, CA, EE. UU.)</td><td>GGCTGGCAACTAGAAGGCACA&nbsp;</td><td>Preparación de la biblioteca NGS</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoetanol</td><td>Millipore Sigma (Burlington, MA, EE. UU.)</td><td>44-420-3250ML</td><td>Extracción de ADN/ARN</td></tr><tr><td>BglI</td><td>New England Biolabs (Ipswich, MA, EE. UU.)</td><td>R0143</td><td>Digestión del inserto de doble cadena</td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, EE. UU.)</td><td>1851196</td><td>Ciclado dd-PCR</td></tr><tr><td>dNTPS&nbsp;</td><td>New England Biolabs (Ipswich, MA, EE. UU.)</td><td>N0447S</td><td>Preparación de la biblioteca NGS</td></tr><tr><td>ddPCR Supermix para sondas (sin dUTP)</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, EE. UU.)</td> <td>1863024</td><td>dd-PCR</td></tr><tr><td>supermix Aceite de generación de gotas para sondas</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, EE. UU.)</td><td>1863005</td><td>Aceite de generación de gotas dd-PCR</td></tr><tr><td>DG8 Cartuchos para generador de gotas QX100 / QX200</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, EE. UU.)</td> <td>1864008</td><td>dd-PCR cartucho de generación de gotas</td></tr><tr><td>DG8 Soporte de cartucho</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, EE. UU.)</td><td>1863051</td><td>Soporte de cartucho dd-PCR</td></tr><tr><td>Generador de gotas DG8 Junta</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, EE. UU.)</td><td>1863009</td><td>Tapa dd-PCR para cartucho</td></tr><tr><td>Placas ddPCR de 96 pocillos, semifaldón</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, EE. UU.)</td><td>12001925</td><td>dd-PCR Placa de 96 pocillos</td></tr><tr><td>E.cloni 10G SUPREME Electrocompetente Celdas</td><td>Lucigen (Middleton, WI, EE. UU.)</td><td>60081-1</td><td>Celdas electrocompetentes</td></tr><tr><td>Cubetas de electroporación, 1 mm</td><td>Biozym Scientific (Oldendorf, Alemania)</td><td>748050</td><td>Electroporación</td></tr><tr><td>GAPDH Mezcla de cebador/sonda</td><td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, EE. UU.)</td><td>Mm00186825_cn</td><td>Taqman cebador qPCR</td></tr><tr><td>Genepulser Xcell</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, EE. UU.)</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>Kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad</td> por electroporación <td>Applied Biosystems (Waltham, MA, EE. UU.)</td> <td>4368814</td> transcripción <td>inversa de ADNc</td></tr><tr><td>ITR_fw</td><td>IDT (San Joce, CA, EE. UU.)</td> <td>GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)</td><td>DD-PCR PRIMER</td></tr><tr><td>ITR_rv</td><td>IDT (San Joce, CA, EE. UU.)</td><td>CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)</td><td>dd-PCR primer</td></tr><tr><td>ITR_probe</td><td>IDT (San Joce, CA, EE. UU.)</td><td>HEX-CACTCCCTCTCTGGCGCGCGCGGG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)</td><td>dd-PCR sonda</td></tr><tr><td>Illumina NextSeq 500 system</td><td>Illumina Inc (San Diego, CA, EE. UU.)</td><td>SY-415-1001</td><td>NGS Library secuenciación</td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)*</td><td>Roche AG (Basilea, Suiza)</td><td>KK2600 07958919001</td><td>Preparación de muestras NGS</td></tr><tr><td>Dispositivo de separación magnética MagnaBot 96</td><td>Promega GmbH (Madison, WI, EE. UU.)</td><td>V8151</td><td>Preparación de muestras para la biblioteca NGS</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro NanoDrop 2000</td><td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, EE. UU.)</td><td>ND-2000</td><td>Digestión de inserto de doble cadena</td></tr><tr><td>NGS_frw</td><td>Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, EE. UU.)</td><td>GTT CTG TAT CTA CCA ACC TC</td><td>NGS</td></tr> primer <tr><td>NGS_rev</td><td>Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, EE. UU.)</td> <td>CGC CTT GTG TGT TGA CAT C</td><td>NGS</td></tr> primer <tr><td>NextSeq 500/550 High Output Kit (75 ciclos)</td><td>Illumina Inc (San Diego, CA, EE. UU.)</td><td>FC-404-2005</td><td>Secuenciación de bibliotecas NGS</td></tr><tr><td>Sistema de biblioteca Ovation para kit de muestras de baja complejidad&nbsp;</td><td>NuGEN Technologies, Inc. (San Carlos, CA, EE. UU.)</td><td>9092-256</td><td>Preparación de la biblioteca NGS Sellador</td>de</tr><tr><td>placas PX1&nbsp;</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, EE. UU.)</td><td>1814000</td><td>Sellador de placas dd-PCR</td></tr><tr><td>Sellado térmico de lámina perforable</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, EE. UU.)</td> <td>1814040</td><td>lámina de sellado dd-PCR</td></tr><tr><td>Phusion ADN-polimerasa de alta fidelidad</td><td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, EE. UU.)</td> <td>F530S</td><td>Síntesis de segunda cadena de inserto de oligonucleótidos</td></tr><tr><td>PEI MAX - Clorhidrato de polietileno lineal de grado de transfección (MW 40,000)</td><td>Polysciences, Inc. (Warrington, PA, EE. UU.)</td><td>24765-1G</td><td>Preparación de la biblioteca AAV</td></tr><tr><td>Sistema de purificación selectivo por tamaño ProNex</td><td>Promega GmbH (Madison, WI, EE. UU.)</td><td>NG2002</td><td>Preparación de muestras para la biblioteca NGS</td></tr><tr><td>Phusion Hot Start II Polymerase&nbsp;</td><td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, EE. UU.)</td><td>F549L</td><td>Preparación de la biblioteca NGS</td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Roche AG (Basilea, Suiza)</td><td>5963117103</td><td>Extracción de ADN/ARN</td></tr><tr><td>pRep2Cap2_PIS</td><td></td><td></td><td>vector ITR-Rep2Cap2-ITR. Sitio de inserción de péptidos dentro del ORF Cap2, fabricado/preparado en el laboratorio&nbsp;</td></tr><tr><td>Generador de gotas QX200</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, EE. UU.)</td><td>1864002</td> generador <td>de gotas dd-PCR</td></tr><tr><td>QX200 Droplet Reader</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, EE. UU.)</td><td>1864003</td><td>análisis de gotas dd-PCR</td></tr><tr><td>QIAquick Kit de eliminación de nucleótidos</td><td>Qiagen (Venlo, Países Bajos)</td><td>28306</td><td>Síntesis de segunda cadena de purificación de insertos de oligonucleótidos</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Kit de extracción</td><td>Qiagen (Venlo, Países Bajos)</td><td>28704</td><td>Purificación de vectores plásmidos</td></tr><tr><td>QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen (Venlo, Países Bajos)</td><td>12162</td><td>Biblioteca de plásmidos Preparación de ADN</td></tr><tr><td>Qiaquick PCR Kit de purificación</td><td>Qiagen (Venlo, Países Bajos)</td><td>28104</td><td>Preparación de muestras para la biblioteca NGS</td></tr><tr><td>Fluorímetro Qubit</td><td>Invitrogen (Waltham, MA, EE. UU.)</td><td>Q32857</td><td>Preparación de la biblioteca NGS</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS</td><td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, EE. UU.)</td><td>Q32851</td><td>Preparación de la biblioteca</td></tr><tr><td>NGS QuantiFast PCR Master Mix</td><td>Qiagen (Venlo, Países Bajos)</td><td>1044234</td><td>Taqman qPCR</td></tr><tr><td>rep_fw</td><td>IDT (San José, CA, EE. UU.)</td><td>AAGTCCTCGGCCCAGATAGAC</td><td>DD-PCR</td></tr><tr><td>PRIMER rep_rv</td><td>IDT (San Joce, CA, EE. UU.)</td> <td>CAATCACGGCGCACATGT</td><td>DD-PCR</td></tr><tr><td>rep_probe</td><td>IDT (San Joce, CA, EE. UU.)</td><td>FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1</td><td>sonda dd-PCR</td></tr><tr><td>DNasa libre de ARNasa</td><td>Qiagen (Venlo, Países Bajos)</td><td>79254</td><td>Extracción de ADN/ARN</td></tr><tr><td>SfiI</td><td>New England Biolabs (Ipswich, MA, EE. UU.)</td><td>R0123</td><td>Digestión de vector</td></tr><tr><td>5 mm, acero Beads</td><td>Qiagen (Venlo, Países Bajos)</td><td>69989</td><td>Extracción de ADN/ARN</td></tr><tr><td>TRIMER-oligonucleótidos</td><td>ELLA Biotech (Múnich, Alemania)</td><td>-</td><td>Ligasa de oligonucleótidos</td></tr><tr><td>T4 degenerados</td><td>New England Biolabs (Ipswich, MA, EE. UU.)</td><td>M0202L</td><td>Ligadura de bibliotecas de plásmidos</td></tr><tr><td>TissueLyserLT</td><td>Qiagen (Venlo, Países Bajos)</td><td>85600</td><td>Extracción de ADN/ARN</td></tr><tr><td>YFP_fw</td><td>IDT (San Joce, CA, EE. UU.)</td><td>GAGCGCACCATCTTCTTCAAG</td><td>DD-PCR</td></tr><tr><td>YFP_rv</td><td>IDT (San Joce, CA, EE. UU.)</td><td>TGTCGCCCTCGAACTTCAC</td><td>dd-PCR primer</td></tr><tr><td>YFP_probe</td><td>IDT (San Joce, CA, EE. UU.)</td><td>Fam-ACGACGGCAACTACA-BHQ1</td><td>dd-PCR</td></tr><tr><td>sonda Zymo DNA Clean & Concentrador-5 (tapado)</td><td>Investigación de Zymo (Irvine, CA, EE. UU.)</td><td>D4013</td><td>Purificación de vectores y ligadura</td></tr></tbody></table>

aislamiento de vectores de terapia génica de próxima generación a través de ingeniería, códigos de barras y detección de variantes de cápside del virus adenoasociado (aav)

Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus (AAV) Capsid Variants

Los vectores de entrega de genes derivados del virus adenoasociado (AAV) son una de las herramientas más prometedoras para el tratamiento de enfermedades genéticas, evidenciada por el fomento de datos clínicos y la aprobación de varias terapias génicas AAV. Dos razones principales para el éxito de los vectores AAV son (i) el aislamiento previo de varios serotipos virales naturales con propiedades distintas, y (ii) el posterior establecimiento de tecnologías poderosas para su ingeniería molecular y reutilización en alto rendimiento. Impulsando aún más el potencial de estas técnicas se han implementado recientemente estrategias para codificar cápsides AAV seleccionadas a nivel de ADN y ARN, lo que permite su estratificación in vivo completa y paralela en todos los órganos principales y tipos de células en un solo animal. Aquí, presentamos una tubería básica que abarca este conjunto de vías complementarias, utilizando la visualización de péptidos AAV para representar el diverso arsenal de tecnologías de ingeniería de cápside disponibles. En consecuencia, primero describimos los pasos fundamentales para la generación de una biblioteca de visualización de péptidos AAV para la selección in vivo de candidatos con las propiedades deseadas, seguido de una demostración de cómo codificar las variantes de cápside más interesantes para el cribado secundario in vivo. A continuación, ejemplificamos la metodología para la creación de bibliotecas para la secuenciación de próxima generación (NGS), incluida la amplificación de códigos de barras y la ligadura de adaptadores, antes de concluir con una descripción general de los pasos más críticos durante el análisis de datos NGS. Como los protocolos informados aquí son versátiles y adaptables, los investigadores pueden aprovecharlos fácilmente para enriquecer las variantes óptimas de la cápside AAV en su modelo de enfermedad favorito y para aplicaciones de terapia génica.

Generación de una biblioteca de visualización de péptidos AAV2. Como primer paso hacia la selección de AAV diseñados, se describe la generación de una biblioteca de plásmidos. El inserto peptídico se produce mediante el uso de cebadores degenerados. Reducir la combinación de codones en aquellos de 64 a 20 tiene las ventajas de eliminar los codones de parada y facilitar el análisis NGS, al reducir la diversidad de bibliotecas en el ADN pero no en el nivel de proteína. El inserto de oligonucleótido se com...

Generación de la biblioteca de visualización de péptidos AAV y posterior validación a través del código de barras de candidatos con propiedades novedosas para la creación de AAV de próxima generación.

Aislamiento de vectores de terapia génica de próxima generación a través de ingeniería, códigos de barras y detección de variantes de cápside del virus adenoasociado (AAV)

Gene delivery vectors derived from Adeno-associated virus (AAV) are one of the most promising tools for the treatment of genetic diseases, evidenced by ...

Este protocolo cierra una brecha significativa entre la evolución natural de los virus y su uso como vectores recombinantes para la terapia génica humana al permitir su ingeniería, diversificación y estratificación. Esta técnica permite la detección paralela de alto rendimiento para variantes novedosas, aisladas o diseñadas de virus adenoasociados, en resumen AAV, ahorrando así en número de animales, trabajo, costo y tiempo. Las variantes identificadas de la cápside AVV pueden aumentar la eficacia y la especificidad de la administración de transgenes terapéuticos basados en AAV, reduciendo así la dosis viral requerida.Esto podría mejorar la seguridad y la aplicabilidad de la terapia génica. El mismo enfoque también podría usarse para la cápside o la ingeniería promotora de otros vehículos de administración de genes, lo que mejora nuestra comprensión de su biología y su uso en la terapia génica. Ayudarán a demostrar el procedimiento los estudiantes de doctorado Jonas Becker y Jixin Liu, las postdoctorales Joanna Szumska y Margarita Zayas, así como las asistentes de investigación Emma Gerstmann y Ellen Widtke de mi laboratorio.Comience analizando los datos de secuenciación NGS con Python 3 y Biopython. El análisis NGS se compone de dos pasos. Para el primer paso, busque en los archivos de secuencia secuencias que satisfagan criterios específicos, como secuencias de flanqueo, longitud y ubicación, utilizando el script uno, y un archivo de configuración que proporcione la información necesaria.Para el segundo paso, traduzca las secuencias extraídas comenzando en la secuencia AGWGGC usando el script número dos y la configuración y zuordnung. TXT que proporciona la información necesaria. Prepare dos carpetas: script y data.Copie los archivos comprimidos Gzip resultantes de la secuenciación en la carpeta de datos. A continuación, copie Python y los archivos de configuración en la carpeta de secuencias de comandos como se describe en el manuscrito de texto. Antes de ejecutar los scripts, abra el zuordnung.txt y agregue dos columnas separadas por tabulaciones. Introduzca los nombres de los archivos Gzip en la columna uno y el nombre final deseado en la columna dos. Cambie las variables en el archivo de configuración como se describe en el manuscrito de texto.Con el comando específico, inicie la detección y extracción de secuencias de variantes. La salida serán archivos TXT con las secuencias de ADN extraídas y su número de lecturas. El encabezado de este archivo contiene datos estadísticos y estos datos se transferirán a los siguientes archivos.Estos datos TXT serán el archivo de entrada para el script número dos en el que se traducen, clasifican y analizan las secuencias de ADN. Usando el comando específico, inicie la traducción PV y el análisis de los archivos de salida de texto del script uno como se describe en el manuscrito de texto. Los archivos de salida del script número dos se nombrarán utilizando la segunda columna de la tabla de búsqueda en zuordnung.TXT con extensiones basadas en el tipo de análisis. Asegúrese de que los tres archivos de salida contienen datos estadísticos en las primeras filas y una primera columna con el índice de cada secuencia de ADN de los archivos de texto de entrada. Las columnas restantes deben consistir en la secuencia de ADN, el número de lecturas, la lectura directa o inversa y la secuencia peptídica traducida.Las secuencias no válidas deben tener NA y no ser válidas en las dos últimas columnas. Visualice los archivos de salida utilizando el software disponible según las necesidades del usuario. Para realizar el análisis de los datos de secuenciación NGS utilizando código personalizado en Python 3, el flujo de trabajo comprende la detección de secuencias de códigos de barras guiadas por secuencias de flanqueo, su longitud y ubicación, así como el análisis del enriquecimiento y distribución de códigos de barras sobre el conjunto de tejidos.Prepare dos carpetas: script y data. Copie los archivos comprimidos Gzip resultantes de la secuenciación en la carpeta de datos. A continuación, copie los archivos de python y configuración en la carpeta de script como se describe en el manuscrito de texto.Antes de ejecutar el script, cree dos archivos de texto delimitados por tabulaciones:capsidvariance. txt con las secuencias de códigos de barras asignadas a los nombres de variantes de cápside AAV y la contaminación. TXT con secuencias de códigos de barras que provienen de una posible contaminación.Finalmente, edite el archivo de configuración para incluir la información de la ruta a la carpeta con datos de secuenciación, secuencia de regiones flanqueantes de los códigos de barras, su posición y tamaño de ventana para la detección de códigos de barras. Ejecute el script de detección de código de barras con las rutas proporcionadas y los archivos de configuración utilizando el comando respectivo. El resultado de la ejecución de este comando serán archivos TXT con recuentos por variante de cápside y el número total de lecturas recuperadas de los datos sin procesar.Evaluar la distribución de la cápside AAV con código de barras entre tejidos u órganos, en el zuordnung. txt, asigne el nombre de cada archivo de texto obtenido de la ejecución de detección de código de barras a un nombre de tejido u órgano. Agregue los nombres de los archivos de texto en la primera columna y los nombres de tejidos u órganos correspondientes en la asignación delimitada por tabulaciones.Crear un órgano. TXT con la lista de nombres para órganos dentro y fuera del objetivo, que corresponden a los nombres dados en la asignación Zuordnung. Txt.A continuación, cree normalization_organ. txt y normalization_variant. Archivos de texto delimitados por la pestaña TXT con valores normalizados para todas las variantes de cápside y todos los órganos y tejidos.En la primera columna con el normalization_organ. txt, escriba los nombres dados para cada órgano, y la segunda columna con valores de normalización para el tejido correspondiente. Rellene la primera columna del normalization_variant.TXT con la lista de nombres de cápside y la segunda columna con los valores normalizados de los recuentos de lectura para cada cápside de la biblioteca agrupada. Edite el archivo de configuración especificando las rutas completas a todos los archivos adicionales y ejecute el script de análisis de código de barras utilizando este comando específico. El script de análisis de código de barras genera varios archivos, como los archivos de texto con concentración relativa o valores RC de distribución de cápside dentro de diferentes tejidos basados en múltiples pasos de normalización descritos anteriormente, y el archivo de hoja de cálculo que combina datos de archivos de texto en datos de matriz combinados.Visualice los datos y realice un análisis de conglomerados de los datos de la matriz como se describe en el texto manuscrito. El script introducirá la concentración relativa. XLS y generar dos gráficos de mapa de calor de clúster jerárquico y análisis de componentes principales.Para modificar trazados o parámetros PNG, abra el script de R y siga las instrucciones de la sección de comentarios. Las regiones cuantificadas del gen AAV2 rep mostraron que el 99,2% eran positivas para ITR, lo que sugiere que las cápsides AAV contenían todos los genomas virales. En los tres conjuntos, las lecturas extraídas basadas en secuencias de firmas específicas de la biblioteca representaron aproximadamente el 94% del total de lecturas, lo que indica una buena calidad.De estos, más del 99% eran lecturas PV válidas y más del 99% de las lecturas PV válidas eran únicas, lo que sugiere que la biblioteca estaba equilibrada con una alta diversidad interna. Las dos ramas principales de la jerarquía del mapa de calor reflejaron la diferencia en la eficiencia de transducción de las variantes de cápside. La rama izquierda con la mayoría de las variantes de cápside incluía todas las cápsides que mostraron un alto valor de concentración relativa en la mayoría de los tejidos.Además de la especificidad hepática sorprendentemente alta, otras tres cápsides exhibieron especificidad en el diafragma, el músculo esquelético, los bíceps y el cerebro. La rama derecha del agrupamiento jerárquico incluyó las variantes de cápside con una eficiencia de transducción general más baja más evidente en el duodeno y el páncreas. El análisis de componentes principales para el subconjunto original forma el grupo de variantes de cápside con alta especificidad hepática y describe el tropismo muscular sobresaliente de la cápside VAR60.Al intentar este protocolo, debe prestar atención a los errores de escritura. La sintaxis también es diferente si está usando el símbolo del sistema de Windows en comparación con Linux. Tras la identificación de nuevas variantes de AAV, el potencial terapéutico y traslacional debe verificarse en un modelo animal fallecido o más grande.Esta técnica permite una comparación directa lado a lado de variantes de AAV en condiciones idénticas y es extremadamente versátil, allanando el camino para su traducción en animales grandes, o incluso en humanos.

isolation-next-generation-gene-therapy-vectors-through-engineering

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Se demuestra la técnica básica para diseñar y evolucionar molecularmente sintéticos virales adeno-asociados (AAV) vectores de terapia génica a través de la familia de ADN arrastrando los pies. Por otra parte, nos proporcionan las pautas generales y ejemplos representativos para la selección y el análisis de cada uno de cápsidas quiméricas con propiedades mejoradas en las células diana en la cultura o en ratones.

Ingeniería y Evolución de la sintética virus adeno-asociado (AAV) vectores de terapia génica a través de la familia transposición de ADN

Aquí, describimos una estrategia eficiente y reproducible para producir, título y lotes de control de calidad de vectores de virus adeno-asociado. Permite al usuario obtener una preparación de vector con alto título (≥1 x 1013 vector genomas/mL) y una alta pureza, para uso en vitro o en vivo .

Producción, purificación y Control de calidad de vectores de base de Virus Adeno-asociado

Aquí proporcionamos un procedimiento detallado para la producción a gran escala de vectores AAV de grado de investigación utilizando células HEK 293 adherentes cultivadas en pilas celulares y purificación por cromatografía de afinidad. Este protocolo produce consistentemente &gt;1 x 1013 genomas vectoriales / ml, proporcionando cantidades vectoriales apropiadas para estudios con animales grandes.

Producción de vectores de virus adenoasociados en pilas celulares para estudios preclínicos en modelos animales grandes

Aquí, presentamos un protocolo para el desarrollo y validación de buenas prácticas de laboratorio en la detección compatible de vectores virales adenoasociados en lágrimas humanas por reacción en cadena de la polimerasa digital de gotitas en apoyo del desarrollo clínico de vectores de terapia génica.

Un ensayo validable de reacción digital de la polimerasa en cadena de gotas para la detección de vectores virales adenoasociados en estudios de bioderramamiento de lágrimas

El virus adenoasociado recombinante (rAAV) se usa ampliamente para la administración clínica y preclínica de genes. Un uso poco apreciado de los rAAV es la transducción robusta de células cultivadas sin necesidad de purificación. Para los investigadores nuevos en rAAV, proporcionamos un protocolo para la clonación de casetes transgénicos, la producción de vectores crudos y la transducción de cultivos celulares.

Expresión de transgenes en células cultivadas utilizando vectores virales adenoasociados recombinantes no purificados

El virus adenoasociado se produce en cultivo celular en suspensión y se purifica mediante centrifugación de doble gradiente de densidad de yodixanol. Se incluyen medidas para aumentar el rendimiento total del virus, disminuir el riesgo de precipitación del virus y concentrar aún más el producto final del virus. Los títulos finales esperados alcanzan las 1012 partículas virales/ml y son adecuados para el uso preclínico in vivo .

Producción de cultivos en suspensión y purificación de virus adenoasociados mediante centrifugación en gradiente de densidad de yodixanol para aplicaciones in vivo

Este manuscrito describe un protocolo detallado para la generación y purificación de vectores virales adenoasociados utilizando un método optimizado de cromatografía de afinidad basado en heparina. Presenta un enfoque simple, escalable y rentable, que elimina la necesidad de ultracentrifugación. Los vectores resultantes exhiben una alta pureza y actividad biológica, lo que demuestra su valor en estudios preclínicos.

Aislamiento de vectores virales adenoasociados mediante un protocolo de cromatografía de afinidad con heparina semiautomatizado y de un solo paso

A medida que el campo de la terapia génica continúa evolucionando, existe una creciente necesidad de métodos innovadores que puedan abordar estos desafíos. Aquí, se presenta un método único, que agiliza el proceso de generación de vectores AAV de alto rendimiento y alta pureza utilizando una plataforma de fábrica de células, cumpliendo con los estándares de calidad para estudios in vivo .

Un procedimiento simplificado y estandarizado para generar vectores de virus adenoasociados de alta calidad y alto título utilizando una plataforma de fábrica de células

La cuantificación precisa de las copias del genoma del vector de virus adenoasociados (AAV) es fundamental, pero aún no se ha establecido un protocolo estandarizado. Este protocolo describe un método validado para preparar muestras purificadas de AAV y realizar una reacción en cadena de la polimerasa (dd_PCR) digital para cuantificar de forma fiable el título del genoma viral.

Cuantificación de genomas virales adenoasociados en muestras de vectores purificadas mediante reacción en cadena de la polimerasa por gotas digitales

Este protocolo tiene como objetivo introducir un método para producir y purificar biomiméticos extracelulares derivados de células madre mesenquimales (MSC) para la terapia génica. La nanovesícula está confinada con bicapas lipídicas derivadas de MSC y encapsula los AAVs recombinantes que portan el gen de interés en la luz. Esta nanovesícula ofrece un vector mejorado para la entrega de genes in vivo .

Desarrollo de nanovesículas envueltas en membrana de células madre mesenquimales para mejorar la entrega génica

Aprende a aislar vectores de terapia génica de próxima generación mediante ingeniería de AAV, códigos de barras y detección de variantes de cápside. Este método permite el cribado de alta eficiencia para mejorar la especificidad y reducir dosis virales.

Aislamiento de vectores de terapia génica de próxima generación a través de ingeniería, códigos de barras y detección de variantes de cápside del virus adenoasociado (AAV) (Video) | JoVE Journal

Aislamiento de vectores de terapia génica de próxima generación a través de ingeniería, códigos de barras y detección de variantes de cápside del virus adenoasociado (AAV)

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