Name: Modelado del desarrollo cerebeloso humano in vitro en estructura 2D (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Aprende a generar células cerebelosas humanas a partir de iPSCs en una estructura 2D simplificada. Este método permite estudiar el desarrollo temprano del cerebelo y sus alteraciones en trastornos neuropsiquiátricos con eficiencia de costos.

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Agradecemos a Jenny Gringer Richards por su minucioso trabajo en la validación de nuestros sujetos de control, a partir de los cuales generamos las iPSC de control. Este trabajo fue apoyado por NIH T32 MH019113 (a D.A.M. y K.A.K.), el Nellie Ball Trust (a T.H.W. y A.J.W.), NIH R01 MH111578 (a V.A.M. y J.A.W.), NIH KL2 TR002536 (a A.J.W.) y Roy J. Carver Charitable Trust (a V.A.M., J.A.W. y A.J.W.). Las figuras fueron creadas con BioRender.com.

La investigación con sujetos humanos fue aprobada bajo el número de aprobación de la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Iowa número 201805995 y el número de aprobación del Comité de Células Madre Pluripotentes Humanas de la Universidad de Iowa 2017-02. Las biopsias de piel se obtuvieron de los sujetos después de obtener el consentimiento informado por escrito. Los fibroblastos se cultivaron en DMEM con 15% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de solución de aminoácidos no esenciales MEM a 37 °C y 5% deCO2. Los fibroblastos se reprogramaron utilizando un kit de reprogramación episomal siguiendo el protocolo del fabricante (ver Tabla de materiales) utilizando un nucleofector para electroporación. Todos los procedimientos se realizaron en un gabinete de seguridad biológica Tipo A2 de Clase II ("capucha" para abreviar). Todos los medios de cultivo celular estaban libres de antibióticos; Por lo tanto, cada componente que entró en la campana se limpió con etanol al 70%. Todos los medios y componentes de cultivo celular se filtraron estérilmente o se abrieron en la campana para mantener su esterilidad.
1. Preparación experimental
<ol><li>Prepare placas recubiertas de matriz de membrana basal (BMM). NOTA: BMM se solidifica más rápidamente a temperaturas más cálidas. Las placas deben prepararse rápida e inmediatamente a 4 °C para su almacenamiento.<ol><li>Descongele el BMM (ver Tabla de materiales) en hielo, a 4 °C durante al menos 2 h, o durante la noche.</li>
		<li>Mezclar DMEM/F12 y BMM hasta una concentración final de 80 μg/mL. Distribuir la solución de BMM en placas de cultivo de tejidos (1 ml para placas de 35 mm y 2 ml para placas de 60 mm) e incubar a 37 °C durante al menos 1 h o durante la noche antes de colocar las células. NOTA: Los platos no utilizados se pueden conservar a 4 °C durante 2 semanas.</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare placas recubiertas de poli-L-ornitina/laminina (OLP/laminina).<ol><li>Prepare 20 μg/ml de PLO (consulte la Tabla de materiales) en DPBS+/+ estéril y agregue 1 ml a cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Incubar durante la noche a 37 °C en la incubadora.</li>
		<li>Al día siguiente, aspirar la OLP con un aspirador de vacío y lavar dos veces con DPBS+/+. Secar al aire en la campana. NOTA: Las placas secadas al aire se pueden almacenar a 4 °C durante un máximo de 2 semanas, envueltas en papel de aluminio, para su uso futuro.</li>
		<li>Prepare 10 μg/ml de laminina (consulte la Tabla de materiales) en DPBS+/+ y agregue 1 ml a cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Incubar al menos durante 3 h o durante la noche a 37 °C en la incubadora.</li>
		<li>Aspire la laminina con un aspirador de vacío y agregue 1 ml de DPBS+/+ mediano o estéril. NOTA: El recubrimiento de laminina no debe secarse. PBS o un medio de cultivo apropiado debe agregarse inmediatamente para evitar esto. Las placas recubiertas se pueden almacenar a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare la solución de paso de PSC. NOTA: Se requiere un osmómetro (consulte la Tabla de materiales) para hacer la solución de paso PSC10.<ol><li>Disolver 11,49 g de cloruro de potasio (KCl) y 0,147 g de citrato de sodio dihidratado (HOC(COONa)(CH 2 COONa)2*2H2O)en 400 ml de agua estéril de cultivo celular (ver Tabla de materiales).</li>
		<li>Mida el volumen de la solución y anístrelo como el volumen inicial (Vi).</li>
		<li>Mida la osmolaridad y ajústela a 570 mOsm agregando agua estéril de grado de cultivo celular utilizando la fórmula Vi × Oi = Vf × 570 mOsm.</li>
		<li>Filtrar-esterilizar la solución con un filtro de 0,20 μm y hacer 10 ml de alícuotas. Guarde las alícuotas a temperatura ambiente (RT) hasta por 6 meses.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparar el medio de células madre pluripotentes (PSC). NOTA: Las iPSC se mantienen en un medio que contiene FGF2 termoestable (consulte la Tabla de materiales), lo que proporciona un horario de alimentación libre de fines de semana. Otros medios PSC disponibles comercialmente no han sido probados para este protocolo.<ol><li>Descongele el suplemento medio de PSC durante la noche a 4 °C.</li>
		<li>Añadir 10 ml de suplemento de medio PSC a 500 ml de medio de PSC basal. Preparar 25 ml de alícuotas y almacenar a −20 °C. NOTA: Las alícuotas congeladas pueden almacenarse a -20 °C durante 6 meses. Las alícuotas descongeladas deben conservarse a 4 °C y utilizarse en un plazo de 2 semanas. Las células se pueden congelar para su almacenamiento a largo plazo en un medio PSC con 10% (v / v) de dimetilsulfóxido (DMSO).</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare el medio de descongelación PSC.<ol><li>Suplemento de medio PSC con 50 nM de cromano, 1,5 μM de emricasan, 1x suplemento de poliamina y 0,7 μM trans-ISRIB (CEPTcocktail 11) (ver Tabla de materiales).</li>
		<li>Filtrar-esterilizar con un filtro de 0,20 μm y conservar a 4 °C durante un máximo de 4 semanas.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparar pipetas de vidrio desmenuzado.<ol><li>Tire de las pipetas Pasteur de vidrio de 22,9 cm (9 pulgadas) en dos piezas por encima de un quemador Bunsen, ~ 2 cm por debajo del cuello, creando dos pipetas, con el lado más delgado siendo ~ 4 cm más corto que el otro.</li>
		<li>Con la ayuda de la llama, doble las puntas del lado tirado para crear una "r" suave.</li>
		<li>Coloque las pipetas tiradas en manguitos de autoclave y autoclave para esterilización.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparar el medio de diferenciación cerebelosa (MDL).<ol><li>Mezcle IMDM y la mezcla de nutrientes F12 de Ham en una proporción de 1: 1. Complemente la mezcla con 1x suplemento de L-alanina-L-glutamina, concentrado de lípidos químicamente definido al 1% (v/v), 0.45 mM 1-tio-glicerol, 15 μL/ml de apotransferrina, 5 mg/ml de albúmina sérica bovina (BSA) y 7 μg/ml de insulina (ver Tabla de materiales).</li>
		<li>Filtrar-esterilizar con un filtro de 0,20 μm, almacenar a 4 °C y utilizar en el plazo de 1 mes.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparar el medio de maduración cerebelosa (MMC).<ol><li>Suplemento de medio neurobasal con 1x suplemento de L-alanina-L-glutamina y 1x suplemento de N-2 (ver Tabla de Materiales).</li>
		<li>Filtrar-esterilizar con un filtro de 0,20 μm, almacenar a 4 °C y utilizar en un plazo de 2 semanas.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Cultura iPSC sin alimentador
<ol><li>Descongele las celdas siguiendo los pasos a continuación.<ol><li>Introducir una placa BMM (paso 1.1) en la incubadora a 37 °C para gelificar durante al menos 1 h o durante la noche antes de descongelar las células.</li>
		<li>Precaliente 10 ml de medio de descongelación PSC (paso 1.5) a 37 °C.</li>
		<li>Transfiera el criovial con células de nitrógeno líquido a un baño de agua a 37 ° C. NOTA: Para evitar generar una fuente de contaminación en el espacio de cultivo celular, no se recomienda el uso de un baño de agua estándar. En cambio, el agua dulce se puede calentar en un vaso pequeño a 37 ° C para generar un baño de agua de un solo uso.</li>
		<li>Cuando quede un pequeño trozo de hielo en el tubo, retírelo del baño de agua, seque el tubo y rocíe con etanol al 70%. Transfiera el tubo a la campana y use una pipeta serológica de 2 ml o 5 ml (consulte la Tabla de materiales) para transferir suavemente las células a un tubo cónico de 15 ml.</li>
		<li>Agregue 8 ml de medio de descongelación de PSC a las células gota a gota mientras gira el tubo cónico. Centrifugar a 200 x g durante 5 min en RT.</li>
		<li>Aspire cuidadosamente el sobrenadante con un aspirador de vacío sin alterar la bolita celular. Resuspender las células en 2 mL de medio de descongelación PSC.</li>
		<li>Aspire el BMM de la placa y agregue las células resuspendidas gota a gota por toda la placa para una distribución uniforme.</li>
		<li>Colocar la placa en la incubadora a 37 °C, 5%CO2. Actualice el medio al día siguiente con el medio PSC. Después de eso, cambie el medio diariamente.</li>
	</ol></li>
	<li>Mantenga las celdas siguiendo los pasos a continuación.<ol><li>Precaliente el volumen necesario de medio PSC a 37 °C (por ejemplo, 1 ml de medio por placa de 35 mm).</li>
		<li>Investigar las placas en busca de células o colonias diferenciadas y extraer las células diferenciadas con una pipeta de vidrio tirado (paso 1.6). NOTA: Las colonias iPSC tienen bordes lisos con células morfológicamente idénticas.</li>
		<li>Cambiar el medio gastado diariamente y el paso cada 3-4 días o cuando se alcance el 70% de confluencia.</li>
	</ol></li>
	<li>Paso de las celdas.<ol><li>Coloque la cantidad necesaria de placas BMM en la incubadora durante al menos 1 h o durante la noche antes de pasar. Precaliente la cantidad necesaria de PSC medio (paso 1.3) a 37 °C.</li>
		<li>Con una pipeta de vidrio tirado, limpie cualquier célula o colonia diferenciada.</li>
		<li>Aspirar el medio gastado con un aspirador de vacío y añadir medio de disociación PSC, 1 ml por plato de 35 mm. Incubar a 37 °C durante 1-3 min. NOTA: Si las colonias se están levantando en la solución de paso de PSC antes de agregar el medio PSC, el tiempo de incubación se puede reducir.</li>
		<li>Aspire la solución de paso de PSC y agregue el medio PSC precalentado.</li>
		<li>Usando una punta de pipeta estéril de 200 μL, raye las líneas paralelas entre sí en una dirección, gire la placa 90° y haga un segundo conjunto de líneas de rayado perpendiculares a las anteriores (haciendo un patrón de rayado cruzado a través de la placa).</li>
		<li>Aspire la solución BMM de las placas fijas. Recoger las colonias mediante una pipeta serológica y distribuirlas en nuevas placas BMM.</li>
		<li>Incubar a 37 °C, 5%CO2. Cambie el medio diariamente.</li>
	</ol></li>
	<li>Congelar las células.<ol><li>Prepare los crioviales etiquetando el contenido y esterilice bajo luz ultravioleta (UV) en la campana (consulte la Tabla de materiales) durante 30 minutos.</li>
		<li>Prepare el medio de congelación PSC complementando el medio PSC con DMSO al 10% (v / v). Siga los pasos 2.3.2-2.3.5.</li>
		<li>Transfiera las células a un tubo cónico de 15 ml con una pipeta serológica de 5 ml y centrifuga a 200 x g durante 5 min a RT.</li>
		<li>Aspirar cuidadosamente el medio y resuspender el pellet celular en medio de congelación PSC.</li>
		<li>Distribuir en crioviales. Coloque los viales en un recipiente de congelación y colóquelos en un congelador a -80 °C.</li>
		<li>Al día siguiente, transfiera los crioviales a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Diferenciación cerebelosa
NOTA: Antes de comenzar la diferenciación, las iPSC se pasan a seis platos de 35 mm y están listas para la diferenciación cuando están al 70% de confluencia. Cada placa de 35 mm se transferirá a un pocillo de la placa de 6 pocillos.
<ol><li>El día 0, levante las colonias sanas de iPSC para la formación de EB.<ol><li>Agregue 1 ml de CDM (paso 1.7) suplementado con 10 μM Y-27632 y 10 μM SB431542 (consulte la Tabla de materiales) a cada pocillo de una placa de fijación ultra baja (ULA) de 6 pocillos y colóquela en la incubadora hasta que las colonias levantadas estén listas para agregarse a los pocillos.</li>
		<li>Limpie las células diferenciadas con una pipeta de vidrio tirado. Aspirar el medio y añadir 1 ml de solución de paso PSC por cada plato de 35 mm. Incubar durante 3 min a 37 °C, aspirar y añadir 2 mL de MDL suplementado con 10 μM Y-27632 y 10 μM SB431542. NOTA: Si las colonias despegan en la solución de paso de PSC antes de agregar CDM, el tiempo de incubación se puede reducir.</li>
		<li>Bajo un microscopio invertido de luz transmitida, levante suavemente las colonias usando el borde doblado de la pipeta de vidrio tirado con un aumento de 4x. Una vez que se levante cada colonia, transfiera suavemente todo a un pocillo de la placa ULA de 6 pocillos con una pipeta serológica de 10 ml. Repita este proceso para cada placa iPSC. Incubar las células a 37 °C con 5% deCO2. NOTA: Si las colonias son demasiado grandes o están fusionadas, se pueden cortar con la punta de la pipeta de vidrio extraído para crear EB más pequeños.</li>
	</ol></li>
	<li>El día 2, agregue FGF2 a cada pocillo a una concentración final de 50 ng / ml. NOTA: El FGF2 utilizado para la diferenciación cerebelosa no es estable al calor. Este protocolo no ha sido probado con FGF2 termoestable.</li>
	<li>El día 7, haz un cambio medio de 1/3. Para 3 ml de medio total en un pozo, con una pipeta de 1.000 μL, aspire suavemente 1 ml de medio gastado y reemplácelo con 1 ml de MDL fresco. Incubar los EB durante 7 días.</li>
	<li>El día 14, aspire suavemente casi todo el medio gastado con un pipetor de 1.000 μL. Para garantizar un daño mínimo a los EB, gire la placa para reunir todos los EB en el centro de la placa, y luego incline la placa y aspire lentamente desde el borde.<ol><li>A medida que la cantidad media disminuye, coloque lentamente la placa plana y continúe aspirando. Deje suficiente medio para evitar que se resequen los EB. Después, agregue 3 ml de CDM fresco suplementado con 10 μM Y-27632. Transfiera los EB utilizando una pipeta serológica de 10 ml a un plato recubierto de OLP/laminina (paso 1.2). NOTA: Dependiendo de la aplicación posterior, los EB se pueden transferir a una placa OLP/laminina de 6 pocillos o los EB individuales se pueden transferir a un solo pocillo de una placa o cubrecubierta de 24 pocillos recubierta de OLP/laminina.</li>
	</ol></li>
	<li>El día 15, aspirar el medio y reemplazarlo con CDM fresco. NOTA: Es importante agregar suficiente medio a los pocillos para asegurar suficiente medio entre alimentaciones ya que, con el tiempo, habrá evaporación (por ejemplo, para un pozo en una placa de 6 pocillos, agregue 3 ml de medio). Si el medio ha comenzado a acidificarse (se vuelve claro y amarillo), refresque el medio incluso si no está en el horario de alimentación hasta el final del protocolo.</li>
	<li>El día 21, aspirar el medio gastado y reemplazarlo con MMC. El día 28, cambie el medio con MMC fresca. En el día 35, cosecha las células para otras aplicaciones.</li>
</ol>4. Preparación de la muestra para el aislamiento de ARN
<ol><li>Aspirar el medio y añadir 500 μL de reactivo de disociación celular (ver Tabla de materiales) a cada pocillo de la placa de 6 pocillos. Déjalo actuar durante un par de segundos y aspira.</li>
	<li>Incubar el plato, con la tapa puesta, a temperatura ambiente durante 2 min. Golpee los lados de la placa para separar las celdas.</li>
	<li>Añadir 1 ml de MMC (paso 1.8) y recoger las células en un tubo de 1,5 ml.</li>
	<li>Granular las células por centrifugación utilizando una mini centrífuga de sobremesa (ver Tabla de materiales) durante 30 s a RT (velocidad máxima 2000 x g), desechar el medio y agregar 1 ml de 1x PBS pH 7.4 para lavar el pellet celular.</li>
	<li>Vuelva a granular las células con una mini centrífuga de sobremesa durante 30 s en RT y lavar con PBS una vez más.</li>
	<li>Granular las células y desechar el PBS. Lise las células en fenol y guanidina isotiocianato que contiene reactivo (ver Tabla de materiales). NOTA: Las células lisadas en fenol e isotiocianato de guanidina que contienen reactivo pueden almacenarse a −80 °C hasta por 1 año. Las células se pueden lisar directamente en el plato dependiendo del método de aislamiento de ARN y los reactivos que se utilicen. Debido al bajo número de células en un plato, el aislamiento de ARN utilizando columnas de espín de sílice (ver Tabla de materiales) dará como resultado mayores rendimientos de ARN.</li>
</ol>5. Preparación de células para la tinción inmunofluorescente
NOTA: Para una placa de 24 pocillos, un EB por pocillo es suficiente.
<ol><li>En el día 35, aspirar el medio gastado y lavar las células agregando 1 ml de DPBS+/+ por pocillo (para un pocillo de una placa de 24 pocillos).</li>
	<li>Aspirar el DPBS+/+ y añadir 500 μL de paraformaldehído frío al 4% (PFA, ver Tabla de materiales) preparado en DPBS+/+ por pocillo. Incubar durante 20 min en RT.</li>
	<li>Retire el PFA al 4% y lave las células dos veces con DPBS+/+, como en el paso 5.1. Añadir 1 ml de DPBS+/+ y almacenar las células a 4 °C hasta que se realice la tinción. NOTA: Se aconseja hacer la tinción inmunofluorescente dentro de 1 semana después de la fijación para evitar el desprendimiento de células y la pérdida de antígenos. Sin embargo, dependiendo del anticuerpo y la ubicación celular del objetivo, la tinción se puede hacer en momentos posteriores hasta 4 semanas después de la fijación.</li>
</ol>

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<li>Telley, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+function+of+NRP1+in+axon+guidance+and+subcellular+target+recognition+in+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dual function of NRP1 in axon guidance and subcellular target recognition in cerebellum.</a> Neuron. 91 (6), 1276-1291 (2016).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+to+mature+functional+Purkinje+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons.</a> Scientific Reports. 5, 9232(2015).</li>
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</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

La capacidad de modelar el desarrollo cerebeloso humano in vitro es importante para el modelado de enfermedades, así como para promover la comprensión del desarrollo normal del cerebro. Los protocolos menos complicados y rentables crean más oportunidades para la generación de datos replicables y una amplia implementación en múltiples laboratorios científicos. Aquí se describe un protocolo de diferenciación cerebelosa utilizando un método modificado de generación de EB que no requiere enzimas o agentes de disocia...

Comprender el desarrollo cerebeloso humano y las ventanas de tiempo críticas de este proceso es importante no solo para decodificar las posibles causas de los trastornos del desarrollo neurológico, sino también para identificar nuevos objetivos para la intervención terapéutica. Modelar el desarrollo cerebeloso humano in vitro ha sido un desafío, sin embargo, con el tiempo, han surgido muchos protocolos que diferencian las células madre embrionarias humanas (hESC) o iPSC con destinos de linaje cerebeloso 1,2,3,4,5,6,7,8 . Además, es importante desarrollar protocolos que generen resultados reproducibles, sean relativamente simples (para reducir el error) y no sean pesados en costos monetarios.
Los primeros protocolos para la diferenciación cerebelosa se generaron a partir de cultivos 2D a partir de cuerpos embrioides (EB) en placas, induciendo el destino cerebeloso con varios factores de crecimiento similares al desarrollo in vivo, incluyendo WNT, BMPs y FGFs 1,9. Los protocolos publicados más recientes indujeron la diferenciación principalmente en el cultivo de organoides 3D con FGF2 e insulina, seguido de FGF19 y SDF1 para estructuras rómbicas similares a labios3,4, o utilizaron una combinación de FGF2, FGF4 y FGF85. Ambos métodos de inducción de organoides cerebelosos dieron como resultado organoides cerebelosos 3D similares, ya que ambos protocolos informaron una expresión similar de marcadores cerebelosos en puntos de tiempo idénticos. Holmes y Heine ampliaron su protocolo 3D5 para mostrar que las células cerebelosas 2D se pueden generar a partir de hESCs e iPSCs, que comienzan como agregados 3D. Además, Silva et al.7 demostraron que las células que representan neuronas cerebelosas maduras en 2D pueden generarse con un enfoque similar al de Holmes y Heine, utilizando un punto de tiempo diferente para cambiar de 3D a 2D y extender el tiempo de crecimiento y maduración.
El protocolo actual induce el destino cerebeloso en iPSC libres de alimentador mediante la generación de cuerpos embrioides (EB) flotantes libres utilizando insulina y FGF2 y luego colocando los EB en platos recubiertos de OLP / laminina el día 14 para el crecimiento y diferenciación 2D. Para el día 35, se obtienen células con identidad cerebelosa. La capacidad de recapitular las primeras etapas del desarrollo cerebeloso, especialmente en un entorno 2D, permite a los investigadores responder preguntas específicas que requieren experimentos con una estructura monocapa. Este protocolo también es susceptible de modificaciones adicionales, como superficies con micropatrones, ensayos de crecimiento axonal y clasificación celular para enriquecer las poblaciones celulares deseadas.

<table><tbody><tr><td>10 mL Pipeta serológica</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-26D</td><td></td></tr><tr><td>1-tio-glicerol</td><td>Sigma</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Pipeta serológica</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-26B</td><td></td></tr><tr><td>250 mL Unidad de filtro, 0,2 y micro; m aPES, 50 mm Dia</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB12566502</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Plato de clutura de tejidos de fácil agarre</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>4D Unidad central Nucleofector</td><td>Lonza</td><td>276885</td><td>Nucleofector</td></tr><tr><td>5 mL Pipeta serológica</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-25D</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Plato de cultivo de tejidos de fácil agarre</td><td>Falcon</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>6 pocillos placas de fijación ultra bajas</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur desechables de 9" Fisher</td><td>Scientific</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>Apo-transferrina</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Agua de grado de cultivo celular</td><td>Cytiva</td><td>SH30529.02</td><td></td></tr><tr><td>Concentrado lipídico químicamente definido</td><td>Gibco</td><td>11905031</td><td></td></tr><tr><td>Chroman 1</td><td>Cayman</td><td>34681</td><td></td></tr><tr><td>Clase II, Tipo A2, Gabinete de seguridad biológica</td><td>NuAire, Inc.</td><td>NU-540-600</td><td>Campana, luz ultravioleta</td></tr><tr><td>Placa Costar de 24 pocillos, tratada</td><td>TC Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Costar Placa de 6 pocillos, tratada TC</td><td>Solución Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>DAPI Thermo</td><td>Scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (Dimetlisulfóxido)</td><td>Sigma</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>DPBS+/+</td><td>Gibco</td><td>14040133</td><td></td></tr><tr><td>Emricasan</td><td>Cayman</td><td>22204</td><td></td></tr><tr><td>Epi5 Kit de reprogramación episomal iPSC</td><td>Life Technologies</td><td>A15960</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8-Flex</td><td>Gibco</td><td>A2858501</td><td>medio PSC con sistema de imagen FGF2</td></tr><tr><td>EVOS XL Core termoestable Life</td><td>Technologies</td><td>AMEX1000</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino - Premium</td><td>Select Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>Suplemento de L-alanina-L-glutamina</td></tr><tr><td>Ham's F12 Nutrient Mix</td><td>Gibco</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>HERAcell VIOS 160i Incubadora de CO2</td><td>Thermo Scientific</td><td>50144906</td><td></td></tr><tr><td>Anti-EN2 humano, ratón</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-293311</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ki67/MKI67 humano, conejo</td><td>R& D Systems</td><td>MAB7617</td><td></td></tr><tr><td>Humano anti-PTF1a, conejo</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-98726</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TUBB3 humano, ratón</td><td>Biolegend</td><td>801213</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Gibco</td><td>12585</td><td></td></tr><tr><td>Laminina Proteína de ratón</td><td>Gibco</td><td>23017015</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>Matriz de membrana basal</td></tr><tr><td>MEM-NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Mini centrífuga</td><td>Labnet International</td><td>C1310</td><td>Mini centrífuga de sobremesa</td></tr><tr><td>Kit de limpieza de ARN monarca (50 &micro; g)</td><td>New England BioLabs</td><td>T2040</td><td>Columnas de centrifugación de sílice</td></tr><tr><td>Monarch Total RNA Miniprep Kit</td> New <td>England BioLabs</td><td>T2010</td><td>Columnas de espín de sílice</td></tr><tr><td>N-2 suplemento</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Medio neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>PFA 16%</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento de poliamina</td><td>Sigma</td><td>P8483</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithine (PLO)</td><td>Sigma</td><td>3655</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma</td><td>746436</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Sigma</td><td>54317</td><td></td></tr><tr><td>Bolsas transparentes autosellables</td><td>Steriking</td><td>SS-T2 (90x250)</td><td>Bolsas de autoclave</td></tr><tr><td>Sodio citrato dihidratado &nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S279-500</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de jeringa, estériles, PES 0.22 y micro; m, 30 mm Dia</td><td>Research Products International</td><td>256131</td><td></td></tr><tr><td>Trans-ISRIB</td><td>Cayman</td><td>16258</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>Fenol e isotiocianato de guanidina</td></tr><tr><td>Enzima TrypLE Express (1x)</td><td>Gibco</td><td>12604039</td><td>Reactivo de disociación celular&nbsp;</td></tr><tr><td>Osmómetro de presión de vapor</td><td>Wescor, Inc.</td><td>Osmómetro</td> <td>modelo 5520</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Biogems</td><td>1293823</td><td></td></tr></tbody></table>

modelado del desarrollo cerebeloso humano in vitro en estructura 2d

Modeling Human Cerebellar Development In Vitro in 2D Structure

El desarrollo preciso y oportuno del cerebelo es crucial no solo para la coordinación y el equilibrio motor precisos, sino también para la cognición. Además, la interrupción en el desarrollo cerebeloso se ha implicado en muchos trastornos del desarrollo neurológico, como el autismo, el trastorno por déficit de atención con hiperactividad (TDAH) y la esquizofrenia. Las investigaciones del desarrollo cerebeloso en humanos anteriormente solo han sido posibles a través de estudios post-mortem o neuroimágenes, sin embargo, estos métodos no son suficientes para comprender los cambios moleculares y celulares que ocurren in vivo durante el desarrollo temprano, que es cuando se originan muchos trastornos del desarrollo neurológico. La aparición de técnicas para generar células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC) a partir de células somáticas y la capacidad de volver a diferenciar aún más las iPSC en neuronas han allanado el camino para el modelado in vitro del desarrollo temprano del cerebro. El presente estudio proporciona pasos simplificados hacia la generación de células cerebelosas para aplicaciones que requieren una estructura monocapa de 2 dimensiones (2D). Las células cerebelosas que representan las primeras etapas del desarrollo se derivan de iPSC humanas a través de los siguientes pasos: primero, los cuerpos embrioides se hacen en cultivo tridimensional (3D), luego se tratan con FGF2 e insulina para promover la especificación del destino cerebeloso, y finalmente, se diferencian terminalmente como una monocapa en sustratos recubiertos de poli-l-ornitina (PLO) / laminina. A los 35 días de diferenciación, los cultivos de células cerebelosas derivadas de iPSC expresan marcadores cerebelosos que incluyen ATOH1, PTF1α, PAX6 y KIRREL2, lo que sugiere que este protocolo genera precursores neuronales cerebelosos glutamatérgicos y GABAérgicos, así como progenitores de células de Purkinje. Además, las células diferenciadas muestran una morfología neuronal distinta y son positivas para marcadores de inmunofluorescencia de identidad neuronal como TUBB3. Estas células expresan moléculas de guía axonal, incluyendo semaforina-4C, plexina-B2 y neuropilina-1, y podrían servir como modelo para investigar los mecanismos moleculares del crecimiento de neuritas y la conectividad sináptica. Este método genera neuronas cerebelosas humanas útiles para aplicaciones posteriores, incluyendo expresión génica, estudios fisiológicos y morfológicos que requieren formatos monocapa 2D.

Descripción general de la diferenciación cerebelosa 3D a 2D Las células cerebelosas se generan a partir de iPSCs. La figura 1A muestra el flujo de trabajo general y la adición de componentes principales para la diferenciación. El día 0, los EB se fabrican levantando suavemente las colonias iPSC (Figura 1B) utilizando una pipeta de vidrio tirado en CDM que contiene SB431542 e Y-27632 y se colocan en placas de fijación ultrabaja. FGF2 se añade ...

El presente protocolo explica la generación de una monocapa 2D de células cerebelosas a partir de células madre pluripotentes inducidas para investigar las primeras etapas del desarrollo cerebeloso.

Modelado del desarrollo cerebeloso humano in vitro en estructura 2D

The precise and timely development of the cerebellum is crucial not only for accurate motor coordination and balance but also for cognition. In addition, ...

Este método puede ayudar a estudiar el desarrollo cerebeloso humano temprano y cómo podría alterarse en los trastornos neuropsiquiátricos. La ventaja clave de este método es generar células cerebelosas humanas tempranas en desarrollo en una estructura de capa 2D sin realizar pasos complicados. También es rentable.Hacer pipetas de tracción puede ser complicado al principio, pero con la práctica y el tiempo, es más fácil tirar de las pipetas de una manera que sea más fácil de trabajar. Comience la preparación experimental tirando de una pipeta Pasteur de 22,9 centímetros aproximadamente dos centímetros por debajo del cuello, por encima del quemador bunsen para crear dos pipetas de vidrio. El lado más delgado será aproximadamente cuatro centímetros más corto que el otro.Doble las puntas del lado tirado sobre la llama para crear una R suave, luego coloque las pipetas tiradas en las mangas del autoclave y esterilícelas en un autoclave. En el día cero, agregue un mililitro de medio de diferenciación cerebelosa suplementado con 10 micromolares Y-27632 y SB-431542 a cada pocillo de una placa de accesorio ultra bajo de seis pocillos, o ULA, y colóquelo en la incubadora hasta que las colonias levantadas estén listas para agregarse a los pocillos. Limpie las células diferenciadas con una pipeta de vidrio tirado.Aspire el medio y agregue un milímetro de solución de paso iPSC por cada plato de 35 milímetros. Después de tres minutos de incubación a 37 grados centígrados, aspirar el medio y añadir dos milímetros de medio de diferenciación cerebelosa suplementado con 10 micromolares Y-27632 y SB-431542 Bajo un aumento de 4x de un microscopio invertido de luz transmitida, levante las colonias utilizando el borde doblado de la pipeta de vidrio tirado. Una vez que se levante cada colonia, transfiera suavemente todas las colonias a un pocillo de la placa ULA de seis pocillos utilizando una pipeta serológica de 10 mililitros.Repita este proceso para cada placa iPSC e incube las células a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono. En el segundo día, agregue FGF2 a cada pocillo para ajustar una concentración final de 50 nanogramos por mililitro. En el séptimo día, cambie un tercio del medio aspirando un mililitro de medio gastado y reemplazándolo con un mililitro de medio de diferenciación cerebelosa fresca.Incubar los cuerpos embrioides durante siete días. El día 14, agita la placa para reunir todos los cuerpos embrioides en el centro de la placa. Luego incline la placa y aspire todo el medio gastado usando un pipetter de 1000 microlitros desde el borde.A medida que la cantidad media disminuye, coloque lentamente la placa plana y continúe aspirando, dejando suficiente medio para evitar sacar los cuerpos embrioides. A continuación, agregue tres mililitros de medio de diferenciación cerebelosa fresca suplementado con 10 micromolares Y-27632. Luego transfiera los cuerpos embrioides usando una pipeta serológica de 10 mililitros a un plato recubierto de poli-L-ornitina laminina.El día 15, aspirar el medio y reemplazarlo con un medio de diferenciación cerebelosa fresca. En el día cero, las colonias de iPSC se limpiaron y se elevaron en un medio de diferenciación cerebelosa que contenía SB-431542 e Y-27632 y se colocaron en placas de fijación ultra bajas para generar cuerpos embrioides. La adición de FGF2 en el segundo día y un cambio de 1/3 de medio en el séptimo día dio como resultado cuerpos embrioides que mostraron agrandamiento en el día 14.Las células comenzaron a migrar hacia afuera desde los cuerpos embrioides a lo largo de la superficie recubierta en el día 15. El cambio completo del medio al medio de maduración cerebelosa a partir del día 21 dio como resultado una monocapa de células con morfología y complejidad neuronales para el día 35. El análisis de expresión génica en el día 35 reveló que las células expresan marcadores progenitores cerebelosos tempranos como progenitores glutamatérgicos, ATOH1, progenitores GABAérgicos, PTF1 alfa y los marcadores celulares progenitores de Purkinje KIRREL2 y SKOR2.Además, también se observó la expresión del marcador rómbico del labio OTX2 y en su mayoría de la neurona anterior específica SIX3. El marcaje inmunofluorescente de las células recolectadas en el día 35 mostró tinción positiva para los marcadores cerebelales EN2 y PTF1 alfa, el marcador neuronal beta tubulina III y el marcador de proliferación KI67. La tinción nuclear con 4'6-diamidino-2-fenilindol, o DAPI, mostró núcleos celulares.Para una diferenciación exitosa, es crucial comenzar con colonias de iPSC sanas e indiferenciadas y usar reactivos que estén lo más recién reconstituidos posible.

modeling-human-cerebellar-development-in-vitro-in-2d-structure

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este video muestra un protocolo para diferenciar células madre pluripotentes inducidas humanas en progenitores cerebelosos. Consiste en transferir colonias de células madre a una placa de unión ultra baja para formar cuerpos embrioides, promoviendo la diferenciación con factores de crecimiento, y luego transferir los cuerpos embrioides a una placa recubierta de matriz para su adhesión. Los pasos posteriores implican la inducción de la migración celular y la adición de un medio de maduración...

Una técnica para generar una monocapa 2D de células cerebelosas a partir de células madre pluripotentes inducidas

Este video demuestra la generación de un modelo de lesión neuronal en neuronas cerebelosas primarias de ratón. Describe los pasos involucrados en la inducción de la lesión neuronal utilizando NMDA, un agonista del receptor de neurotransmisores excitatorios, y glicina, un coagonista. El NMDA y la glicina se unen a receptores neuronales específicos, lo que provoca su sobreestimulación y provoca una afluencia masiva de calcio intracelular, que provoca daño y muerte de las células neuronales.

Modelado de la lesión neuronal en neuronas cerebelosas primarias de ratón

La capa externa del gránulo del cerebelo es el sitio de la amplificación de tránsito más grande en el cerebro en desarrollo. A continuación, presentamos un protocolo para orientar la modificación genética a esta capa en el pico de la proliferación mediante electroporación ex vivo y la cultura de las rebanadas del cerebelo a partir de embriones Día 14 embriones de pollo.

Ex Vivo Cultura de polluelo cerebelosos Rebanadas y espacialmente focalizadas Electroporación de gránulos precursores celulares

Este protocolo describe un método simple para el aislamiento y cultivo de neuronas de gránulo cerebral primario de ratón (CGNs) de cachorros de 6-7 días, transduction eficiente de CGNs por pérdida y ganancia de estudios de la función y modelado de excitotoxicidad neuronal inducida por el NMDA, muerte celular inducida por potasio bajo, daño del ADN y estrés oxidativo utilizando el mismo modelo de cultura.

Modelado de la muerte Neuronal y la degeneración en las neuronas del gránulo cerebeloso primario de ratón

Describimos un medio de protocolo para hPSCs, utilizando la diferenciación 3D simplificada y reducida de factores de crecimiento, capaces de generar agregados de células con estructuras neuroepiteliales temprano y el positivos para cerebelosa asociada a marcadores, así como un opcional Modificación 2D para diferenciar las células como una monocapa para generar neuronas funcionales.

Protocolo de diferenciación cerebelosa 3D optimizada con modificación 2D opcional

Aquí presentamos un método para preparar organotypic culturas rebanada de cerebelo de ratón y la vaina de mielina de tinción por inmunohistoquímica adecuado para investigar mecanismos de myelination y remielinización en el sistema nervioso central.

Preparación y el Immunostaining de Myelinating Organotypic rebanada cerebelosa culturas

Este protocolo describe un sistema de cultivo dinámico para producir agregados de tamaño controlado de células madre pluripotentes humanas y estimular aún más la diferenciación en organoides cerebelosos en condiciones definidas químicamente y libres de alimentadores utilizando un biorreactor de un solo uso.

Generación escalable de organoides cerebelosos maduros a partir de células madre pluripotentes humanas y caracterización por inmunosuización

Aquí describimos un método para visualizar la sinaptogénesis de las neuronas granulares en el cerebelo del ratón durante el curso del desarrollo cerebral postnatal cuando estas células refinan sus estructuras sinápticas y forman sinapsis para integrarse en el circuito cerebral general.

Utilización de electroporación postnatal in vivo para estudiar la morfología de la neurona del gránulo cerebeloso y el desarrollo de la sinapsis

Presentamos protocolos detallados para la generación y caracterización de modelos de desarrollo neocortical basados en células madre pluripotentes inducidas humanas (hIPSC) 2D y 3D, así como metodologías complementarias que permiten el análisis cualitativo y cuantitativo de la biogénesis y función del cilio primario (PC).

Modelos 2D y 3D basados en células madre pluripotentes inducidas por humanos para diseccionar la participación del cilio primario durante el desarrollo neocortical

Este vídeo demuestra un método para analizar la cultura y las neuronas de la comisura de la médula espinal de ratas E13 dorsal. Disociada neuronas comisurales son útiles para estudiar los mecanismos celulares y moleculares de crecimiento axonal y orientación.

La disección y la Cultura de las neuronas comisurales de médula espinal embrionaria

Aprende a generar células cerebelosas humanas a partir de iPSCs en una estructura 2D simplificada. Este método permite estudiar el desarrollo temprano del cerebelo y sus alteraciones en trastornos neuropsiquiátricos con eficiencia de costos.

Modelado del desarrollo cerebeloso humano in vitro en estructura 2D

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