Name: Un modelo de intestino en un chip para estudiar el eje microbioma intestinal-sistema nervioso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Aprende a utilizar el modelo neuroHuMiX, un intestino en un chip que permite estudiar las interacciones entre el microbioma intestinal y el sistema nervioso entérico mediante cultivos de células bacterianas, epiteliales y neuronales.

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Los autores desean agradecer al Dr. Jared Sterneckert por proporcionarnos las células de la línea K7. También queremos agradecer a los colaboradores de larga data, el Dr. Frederic Zenhausern y Matthew W. Barret de la Universidad de Arizona, por su ayuda con los aspectos de ingeniería. También queremos agradecer a la Dra. Valentina Gálata por su ayuda en el diseño de la representación esquemática de neuroHuMiX. Este proyecto ha recibido financiación del Consejo Europeo de Investigación (ERC) en el marco del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea (acuerdo de subvención 863664). La Figura 1 se creó parcialmente con Biorender.com.

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</ol>

P.W. declara figurar como inventor en las patentes PCT/EP2013/056607, PCT/EP2016/062024, PCT/US2017/061602 y PCT/EP2019/081424. P.W., C.S. y L.G. declaran figurar como inventores en LU503075 de patentes.

Ahora se ha establecido que el microbioma intestinal humano influye en la salud y la enfermedad del huésped. A pesar de los conocimientos que sugieren la importancia de nuestro microbioma, especialmente en trastornos neurológicos como el Alzheimer o la enfermedad de Parkinson 3,13, sigue siendo en gran medida desconocido cómo interactúa el microbioma intestinal con el sistema nervioso entérico y, posteriormente, con el cerebro.
Hasta ahora no se dispone de un modelo representativo para estudiar las interacciones entre el microbioma intestinal y el sistema nervioso. Los estudios sobre el eje intestino-cerebro se han realizado tradicionalmente utilizando modelos murinos13. Los ratones y los humanos comparten el 85% de sus secuencias genómicas14, pero existen diferencias significativas a tener en cuenta al comparar ratones con humanos. En cuanto al intestino, es importante tener en cuenta que, en comparación con los humanos, los ratones son exclusivamente herbívoros. Como resultado, su tracto gastrointestinal difiere en longitud y características, como el "vaciamiento gástrico"14. Los cerebros murinos también muestran diferencias importantes, por lo que la estructura general entre ratones y humanos es diferente15. Es importante destacar que los seres humanos tienen tiempos de ciclo celular más largos de los progenitores neuronales15. En consecuencia, es importante desarrollar modelos representativos que incluyan células derivadas de humanos, incluidas las células intestinales y neuronales5. En este contexto, el desarrollo de una investigación más reproducible a través de modelos in vitro reduce la necesidad de utilizar modelos animales y mejora la reproducibilidad.
neuroHuMiX es una versión avanzadadel anterior modelo 9 de HuMiX. HuMiX es un modelo de intestino en un chip que permite cocultivos proximales y representativos de células epiteliales y bacterianas. La comunicación célula-célula es posible a través del cocultivo proximal y la difusión de factores y metabolitos secretados a través de membranas semipermeables. Sin embargo, para ampliar la utilidad del dispositivo inicial para estudiar el entorno intestinal humano, se requiere la introducción de un tipo de célula adicional. Para hacer frente a esto, neuroHuMiX, desarrollado con la introducción de ENs derivadas de iPSC, permite un cocultivo proximal de bacterias, células epiteliales intestinales y ENs. El modelo in vitro resultante nos permite abordar cuestiones relacionadas con el microbioma intestinal humano en relación con el sistema nervioso humano. El cocultivo de diferentes tipos de células, especialmente los cocultivos de células y bacterias de mamíferos, tiene varios desafíos, incluida la pérdida de viabilidad, la mala adhesión y la pérdida general de la confluencia16. Aquí, hemos demostrado que dentro de este dispositivo, somos capaces de co-cultivar tres tipos de células diferentes dentro del mismo sistema mientras mantenemos alta la viabilidad celular.
Un paso crítico en el protocolo es asegurar la confluencia de las células neuronales (80%-90% de confluencia celular y viabilidad) antes de inocular en el dispositivo. Dado que no es posible evaluar el crecimiento celular durante la ejecución, es de suma importancia asegurarse de que las células confluyan y crezcan bien antes de introducirlas en el modelo. Si bien esto puede ser un factor limitante, la viabilidad general y la confluencia observadas dentro del dispositivo son generalmente altas.
El dispositivo se conecta a través de líneas de tubería a una bomba peristáltica. Cada cámara celular tiene su línea de tubería específica. La tubería comprende una tubería de bomba que permite el uso de una bomba peristáltica para la perfusión del medio, así como una tubería que conecta la tubería de la bomba al dispositivo y una tubería que conecta el dispositivo a las botellas de salida/desecho. Se incluyen puertos de muestreo antes y después del dispositivo, para permitir la inoculación y el muestreo del medio de salida. Cada cámara se puede conectar a un medio diferente, lo que permite las mejores condiciones de cultivo para cada tipo de célula individual. Cada cámara puede abrirse o cerrarse en función de las necesidades específicas de suministro de medios. En el dispositivo, la cámara neuronal permanece cerrada durante la mayor parte del experimento, mientras que las cámaras bacterianas y epiteliales están abiertas todo el tiempo, lo que significa que obtienen medio fresco durante toda la ejecución experimental. Para asegurarse de que el medio fluya sin interrupción, es crucial que no quede aire en los tubos, conectores o en el dispositivo. Por lo tanto, es importante dejar que los dispositivos funcionen primero durante unos minutos en el paso de cebado. Esto a menudo resuelve el problema. De lo contrario, una de las otras líneas que están cayendo se puede cerrar durante un corto período de tiempo cerrando la llave de paso de tres vías del flujo de salida. Esto redirige el medio a la línea con la burbuja de aire, resolviendo así el problema empujando la burbuja hacia afuera a través del tubo.
Para cualquier experimento de cultivo celular, el medio es un componente clave, donde cada tipo de célula tiene su respectivo medio. En una configuración de cocultivo, el medio debe ser compatible no solo con el tipo de célula que crece en él, sino también con los otros tipos de células dentro del cocultivo. Esto no es diferente para el dispositivo, lo que plantea un desafío adicional, ya que tenemos tres compartimentos diferentes con tres tipos de células diferentes dentro de las células bacterianas, epiteliales y neuronales. Sin embargo, hemos demostrado que modificando los medios bacterianos, con la adición de un 5% de MRS a RPMI 1640 con un 10% de FBS, todos los tipos de células, en particular las células bacterianas y epiteliales, pueden ser cocultivados con éxito dentro del sistema. Sin embargo, en el dispositivo, los diferentes tipos de células se cocultivan en proximidad y, por lo tanto, no están en contacto directo entre sí. A pesar de que esto no es totalmente representativo del contacto directo entre las células en el intestino humano y, por lo tanto, es una limitación, la condición de cocultivo proximal y representativa es una fortaleza para los análisis posteriores. Intercambio de factores solubles entre las diferentes cámaras y tipos de células; Por lo tanto, las células siguen interactuando entre sí. Además, el hecho de que los tipos celulares puedan ser recolectados y analizados por separado nos permite estudiar el efecto de un microbioma sano y/o enfermo en diferentes tipos celulares (incluidas las células neuronales) y, por lo tanto, determinar/recuperar lecturas específicas del tipo celular. Otra limitación es que no se puede hacer un seguimiento de la morfología de las células durante el período experimental, ya que el dispositivo solo se puede abrir y comprobar las células al final de cada experimento.
Hasta donde sabemos, neuroHuMiX es el primer modelo de intestino en un chip que incluye EN. Se trata de un paso hacia la dilucidación de la comunicación entre la microbiota intestinal y el sistema nervioso entérico. Es un modelo que permite investigar la interacción entre una especie bacteriana, una capa epitelial y las EN. Su diseño permite estudiar el intercambio de factores solubles secretados por los diferentes tipos celulares y su efecto entre sí. En el futuro, sería importante no solo tener EN derivadas de iPSC, sino también células epiteliales derivadas de iPSC dentro del dispositivo, para hacer la transición del dispositivo a un modelo personalizado. Es importante destacar que este modelo personalizado podría utilizarse para probar prebióticos, probióticos y simbióticos 10,11 y, potencialmente, desarrollar enfoques terapéuticos y de cribado personalizados17. Con el tiempo, el neuroHuMiX personalizado podría arrojar luz sobre la "materia oscura" del microbioma intestinal humano y sus interacciones con el sistema nervioso a lo largo del eje microbioma intestinal-sistema nervioso, allanando el camino para la evaluación y las intervenciones terapéuticas.
Podemos concluir que poder tener un intestino en un chip que incluya el sistema neuronal entérico es crucial para avanzar en el estudio y la comprensión de las interacciones a lo largo del eje microbioma intestinal-sistema nervioso. NeuroHuMiX nos permite estudiar los efectos de las especies bacterianas sobre las células huésped y nos proporciona una buena base para mejorar aún más el modelo de una manera aún más representativa fisiológicamente.

El microbioma intestinal humano desempeña un papel crucial en la salud y la enfermedad humanas. Ha sido ampliamente estudiado durante la última década y media, y su papel potencial en la modulación de la salud y la enfermedad ya está establecido1. Se ha postulado que una alteración en el microbioma que conduce a una comunidad microbiana desequilibrada (disbiosis) está involucrada en la patogénesis de muchos trastornos crónicos, como la obesidad, la enfermedad inflamatoria intestinal y el cáncer colorrectal, o incluso enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Parkinson 2,3.
Aunque el microbioma intestinal humano se ha asociado con afecciones neurológicas, aún no está claro cómo el microbioma intestinal se comunica con el sistema nervioso entérico y cómo lo afecta. Dado que el sistema nervioso entérico humano no es fácilmente accesible para su estudio inmediato, hasta ahora se han utilizado modelos animales en experimentos4. Sin embargo, dadas las aparentes diferencias entre los modelos animales y los humanos5, el desarrollo de modelos in vitro que imitan el intestino humano es de interés inmediato. En este contexto, el floreciente y avanzado campo de las células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSCs) nos ha permitido obtener neuronas entéricas (ENs) representativas6. Las EN derivadas de iPSC permiten el estudio del sistema nervioso entérico en modelos de cultivo in vitro, como insertos de cultivo celular, organoides u órganos en un chip 7,8.
El modelo de diafonía humano-microbiana (HuMiX) es un modelo de intestino en un chip que imita el intestino humano9. El modelo inicial de HuMiX (en adelante, el dispositivo inicial) alojaba células epiteliales (Caco-2) y células bacterianas10,11. Sin embargo, para estudiar la relación entre el microbioma intestinal y el sistema nervioso, también se han introducido en el sistema las ENs6 derivadas de iPSC (Figura 1). El cocultivo proximal de células neuronales, epiteliales y bacterianas permite el análisis de los diferentes tipos celulares individualmente y el estudio de las interacciones entre los diferentes tipos celulares en un entorno similar al del intestino humano.
En los últimos años, se han logrado avances en el desarrollo de modelos para estudiar los órganos de maneras más representativas fisiológicamente mediante el uso de modelos de órganos en un chip (por ejemplo, intestino en un chip). Estos modelos son más representativos del entorno intestinal humano debido al suministro constante de nutrientes y a la eliminación de residuos, así como a la monitorización en tiempo real de, por ejemplo, los niveles de oxígeno o la integridad de la barrera 8,12. Estos modelos permiten específicamente el estudio de los efectos de las bacterias intestinales en las células huésped. Sin embargo, para poder utilizar los órganos en un chip para estudiar las interrelaciones entre el microbioma intestinal y el sistema nervioso, las células neuronales deben integrarse en dichos sistemas. Por lo tanto, el objetivo de seguir desarrollando HuMiX y establecer el sistema neuroHuMiX (en lo sucesivo, el dispositivo) era desarrollar un modelo de intestino en un chip, que incluye células neuronales entéricas en cocultivo proximal con células epiteliales intestinales y bacterias.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10712</td><td></td></tr><tr><td>Cánula de aireación (longitud: 1,10 diámetro: 30 mm)</td><td>VWR (B.Braun)</td><td>BRAU4190050</td><td></td></tr><tr><td>Agar-agar</td><td>Merck Millipore</td><td>1.01614.1000</td><td></td></tr><tr><td>Engarzado de aluminio</td><td>Glasger&auml; tebau Ochs</td><td>102050</td><td></td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplemento Menos Vitamina A (50x)</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Membrana Celular Bacteriana, tamaño de poro: 1 y micro; m</td><td>VWR (Whatman)</td><td>515-2084</td><td></td></tr><tr><td>Caco-2 celdas</td><td>DSMZ</td><td>ACC169</td><td></td></tr><tr><td>Contador de celdas & Analizador CASY,</td><td>OMNI, Life Sceince,</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHIR</td>, <td>Axon, Mechem BV</td><td></td>, CT99021 <td></td></tr><tr><td>Colágeno I, Cola de Rata,</td><td>Invitrogen</td><td>A1048301</td><td></td></tr><tr><td>Costar, 6 pocillos, Clear Flat Bottom, Placas de fijación ultrabajas</td><td>, Corning</td><td>3471</td><td></td></tr>, <tr><td>Difco, Lactobacilos, MRS, Caldo</td><td>BD, Biosciences</td><td>288130</td><td></td></tr>, <tr><td>Discofix, llave de paso de 3 vías</td><td>B. Braun</td><td>BRAU40951111</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12, sin glutamina</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>21331020</td><td></td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, D-PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>14190-169</td><td></td></tr><tr><td>Essential 6 Medio</td><td>Thermofisher Scientific A1516401</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 Medio</td><td>Thermofisher Scientific A1517001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hembra Cerradura Luer a conector de lengüeta</td><td>Qosina</td><td>11733</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino, FBS</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>PeproTech</td><td>450-10</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de células humanas, tamaño de poro: 50 nm</td><td>Sigma Aldrich (GE Healthcare)</td><td>WHA111703</td><td></td></tr><tr><td>Junta HuMiX Colágeno</td><td>Auer Precision</td><td>216891-003</td><td></td></tr> Junta <tr><td>HuMiX Fondo Sándwich Auer</td><td>Precision</td><td>216891-002</td><td></td></tr> Junta <tr><td>HuMiX Sandwich Top</td><td>Auer Precision</td><td>216891-001</td><td></td></tr><tr><td>iPSC</td><td>Max Planck Instituto de Biomedicina Molecular</td><td>K7 línea</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Laminina de Engelbreth-Holmswarm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td></td><td>LDN193189 Sigma Aldrich</td><td>SML0559</td><td></td></tr><tr><td>Limosilactobacillus reuteri</td><td>ATCC</td><td>23272</td><td></td></tr><tr><td>Vivo/Muerto BacLight Kit de viabilidad bacteriana</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>L7012</td><td></td></tr><tr><td>Luer macho con Spin Lock a la lengüeta</td><td>Qosina</td><td>11735</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de marprene (0,8 mm x 1,6 mm)</td><td>Watson-Marlow</td><td>902.0008.J16</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matriz calificada para hESC</td><td>Corning</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Mucina, de estómago porcino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>N2 Suplemento (100x)</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Needle (longitud: 120 mm; diámetro: 0,80 mm)</td><td>B.Braun (código de color: verde)</td><td>466 5643</td><td></td></tr><tr><td>Aguja (longitud: 40 mm; diámetro: 0,70 mm)</td><td>Henke Sass Wolf (código de color: negro)</td><td>4710007040</td><td></td></tr><tr><td>Aguja (longitud: 80 mm; diámetro: 0,60 mm)</td><td>B.Braun (código de color: azul)</td><td>466 5635</td><td></td></tr><tr><td>Medio neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 anticuerpo CD49d humano</td><td>Biolegend</td><td>304314</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>Watson-Marlow</td><td>205CA</td><td></td></tr><tr><td>Hidrobromuro de poli-L-ornitina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>Tapas de policarbonato (HuMiX)</td><td>Universidad de Arizona</td><td>HuMiX 1.0 / 2.0</td><td></td></tr><tr><td>Ácido retinoico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Tampón RLT (RNeasy Minikit)</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medio</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>72400-021</td><td></td></tr><tr><td>SB431542, inhibidor de ALK</td><td>Abcam</td><td>ab120163</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de suero</td><td>Glasger&auml; tebau Ochs</td><td>Jeringa 102091</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>309110</td><td></td></tr><tr><td>Solución de tripsina-EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 Dihidrocloruro</td><td>R& D Sistemas</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

un modelo de intestino en un chip para estudiar el eje microbioma intestinal-sistema nervioso

A Gut-on-a-Chip Model to Study the Gut Microbiome-Nervous System Axis

El cuerpo humano está colonizado por al menos el mismo número de células microbianas que de células humanas, y la mayoría de estos microorganismos se encuentran en el intestino. Aunque la interacción entre el microbioma intestinal y el huésped se ha estudiado ampliamente, la forma en que el microbioma intestinal interactúa con el sistema nervioso entérico sigue siendo en gran medida desconocida. Hasta la fecha, no existe un modelo in vitro fisiológicamente representativo para estudiar las interacciones entre el microbioma intestinal y el sistema nervioso. 
Para llenar este vacío, desarrollamos aún más el modelo de diafonía humano-microbiana (HuMiX) mediante la introducción de neuronas entéricas derivadas de células madre pluripotentes inducidas en el dispositivo. El modelo resultante, 'neuroHuMiX', permite el cocultivo de células bacterianas, epiteliales y neuronales a través de canales microfluídicos, separados por membranas semipermeables. A pesar de la separación de los diferentes tipos de células, las células pueden comunicarse entre sí a través de factores solubles, lo que brinda simultáneamente la oportunidad de estudiar cada tipo de célula por separado. Esta configuración permite obtener una primera visión de cómo el microbioma intestinal afecta a las células neuronales entéricas. Este es un primer paso fundamental para estudiar y comprender el eje microbioma intestinal humano-sistema nervioso.

En neuroHuMiX, cocultivamos tres tipos de células diferentes: células bacterianas, epiteliales y neuronales (Figura 1). Para asegurarnos de que todas las células eran viables, realizamos diferentes ensayos en los diferentes tipos de células. Por ejemplo, realizamos recuentos de UFC en células bacterianas, recuento celular y ensayos de viabilidad celular en las células epiteliales, mientras que las células neuronales se evaluaron mediante análisis microscópicos.
<img alt="Diagrama de interacción intestino-cerebro; Sistema de cultivo multicámara para análisis de experimentos biológicos." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64483/64483fig01.jpg" data-altupdatedat="1754907201000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: Representación esquemática de neuroHuMiX y su configuración experimental . (A) Las tres cámaras se mantienen entre dos tapas de PC para mantenerlas cerradas. Cada cámara se llena con un medio específico para las células que crecen en su interior. Las diferentes cámaras están separadas por membranas semipermeables que permiten la comunicación celular a través de factores solubles que pasan por las membranas. (B) Representación de la configuración de neuroHuMiX. Cada cámara está conectada a diferentes botellas de medios. Para la cámara bacteriana, durante los primeros 12,5 días, la cámara se conecta a RPMI + 10% FBS, antes de ser cambiada durante las últimas 36 h a RPMI + 10% FBS + 5% MRS. Abreviaturas: PC = policarbonato; P/L/F = poli L-ornitina/laminina/fibronectina; RPMI = medio de cultivo celular del Roswell Park Memorial Institute; MRS = Medio de cultivo De Man, Rogosa y Shapre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64483/64483fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Para determinar si las células estaban correctamente adheridas, al abrir los dispositivos, evaluamos la formación de una capa celular en la membrana recubierta de colágeno (Figura 6A). Para asegurarse de que las células del dispositivo eran viables, se realizó un recuento automatizado de contadores celulares (Figura 6B) y un recuento de células con ensayo de exclusión de azul de tripano (Figura 6C). Los ensayos se realizaron en células Caco-2 de tres configuraciones diferentes de HuMiX: (i) Caco-2 en cultivo con EN, (ii) Caco-2 en cultivo con L. reuteri y (iii) el dispositivo que involucra el cocultivo de los tres tipos de células. Las pruebas estadísticas utilizando un ANOVA de un factor no arrojaron diferencias significativas entre los tipos de células, lo que sugiere que las células Caco-2 seguían siendo viables en todas estas configuraciones iniciales de dispositivos y condiciones probadas en este estudio. Esto subraya el hecho de que la densidad bacteriana alcanzada durante el cocultivo de L. reuteri y los dos tipos de células humanas no tiene efectos citotóxicos en las células humanas.
<img alt="Cultivo celular en configuración de bioimpresión con resultados de viabilidad; Ensayos Casy y Trypan Blue diagramas de caja." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64483/64483fig06.jpg" data-altupdatedat="1754907201000" data-alt="Figure 6"> Figura 6: Evaluación de las células Caco-2 en la membrana recubierta de colágeno. (A) Capa de células Caco-2 en la membrana recubierta de colágeno después de la apertura. La flecha indica la membrana recubierta de colágeno, que está rodeada por un círculo discontinuo. Las células Caco-2 crecían en forma de espiral en la membrana. Viabilidad celular de células Caco-2 después de 14 días en HuMiX. Los recuentos celulares se obtuvieron utilizando (B) el contador celular automatizado y (C) el recuento celular del ensayo de exclusión de azul de tripano. Los recuentos de células Caco-2 se determinaron a partir de diferentes configuraciones de cultivo en el dispositivo inicial: cocultivo con neuronas entéricas (NE) (negro), cocultivo con L. reuteri (naranja) y en el dispositivo (ENs y L. reuteri) (azul). Se realizó un ANOVA de un factor, mostrando que no hay diferencias significativas entre las diferentes configuraciones de cultivo (ANOVA de un factor, p = 0,1234 [ns]; las barras de error indican error estándar). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64483/64483fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Para poder cultivar L. reuteri con células de mamíferos, primero optimizamos y adaptamos los medios de cultivo para su uso en el dispositivo. Descubrimos que una mezcla del 5% de MRS en RPMI 1640 (suplementada con un 10% de FBS) era óptima para el crecimiento de L. reuteri, mientras que no era citotóxica para las células de mamíferos utilizadas en estos ensayos. Posteriormente, se realizó un recuento de UFC para evaluar el crecimiento de L. reuteri cuando se cultivó en el dispositivo durante 24 h. El recuento de UFC se evaluó para dos configuraciones iniciales diferentes del dispositivo (Figura 7): L. reuteri cocultivada con Caco-2 y L. reuteri en el dispositivo . En ambas configuraciones, los recuentos de UFC fueron significativamente diferentes del inóculo HuMiX y de las células recolectadas (ANOVA de un factor, p = 0,0002), lo que indica el crecimiento de las células bacterianas dentro del dispositivo inicial.
<img alt="Gráfico de barras; análisis de UFC; comparación de grupos experimentales; significación estadística; resultado microbiológico." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64483/64483fig07.jpg" data-altupdatedat="1754907201000" data-alt="Figure 7"> Figura 7: Recuento de UFC de Limosilactobacillus reuteri del inóculo (diluido 1:100.000) y después de 24 h en HuMiX. Dos configuraciones diferentes: células de Caco-2 en cocultivo con L. reuteri y el dispositivo. Un ANOVA de un factor muestra una diferencia significativa (p = 0,0002 [***]) entre el inóculo y las células recolectadas, lo que significa que las bacterias están creciendo dentro de HuMiX. Las barras de error indican el error estándar. Abreviaturas: CB. HX = Caco-2 bacteria HuMiX; nHX = neuroHuMiX. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64483/64483fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Para evaluar si el cultivo de las EN dentro del dispositivo alteraría el fenotipo de las células, se observó la morfología macroscópica de las EN utilizando un microscopio de contraste de fase invertido. Durante este paso, se evaluaron tanto la confluencia como la morfología de la NE. El establecimiento de una red neuronal confluente indicó que las células se habían adherido bien a la tapa del PC del dispositivo recubierto. Es importante destacar que esto resalta la noción de que crecieron en cocultivo con Caco-2 y L. reuteri. El borde entre la red neuronal confluente y la espiral delineada por la junta era claramente evidente (Figura 8).
<img alt="Imagen de microscopio, morfología de cultivo celular, escala de 200 μm, análisis de investigación biológica." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64483/64483fig08.jpg" data-altupdatedat="1754907201000" data-alt="Figure 8"> Figura 8: Neuronas entéricas después de 14 días de cultivo en el dispositivo. En el lado izquierdo de la imagen, las neuronas han crecido hasta convertirse en una capa confluente en la espiral. El borde, entre la capa neuronal y el espacio sin células, es el borde de la espiral; Ampliado 10x, barra de escala = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64483/64483fig08large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Chip microfluídico, plástico transparente, utilizado en control de fluidos, análisis de laboratorio, dispositivo de investigación." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64483/64483fig02.jpg" data-altupdatedat="1754907201000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: Tapas utilizadas en el dispositivo. Las imágenes muestran las tapas superior (izquierda) e inferior (derecha) de la PC. Cada lado de la tapa del PC mide 6,4 cm. Abreviatura: PC = policarbonato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64483/64483fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Configuración de chip microfluídico, diseño de canal en espiral para experimento de separación de fluidos, análisis de laboratorio." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64483/64483fig03.jpg" data-altupdatedat="1754907201000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: Junta de la cámara epitelial en la tapa inferior de la PC. Vista superior de la junta de la cámara epitelial colocada en la tapa inferior de la PC (izquierda) y vista inferior (derecha) que muestra la alineación de la junta de la cámara epitelial con las entradas y salidas de la tapa inferior de la PC. Cada lado de las juntas, así como la tapa del PC, mide 6,4 cm. Abreviatura: PC = policarbonato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64483/64483fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Ensamblaje, diseño y construcción de dispositivos microfluídicos, diseño de canales en espiral, configuración experimental." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64483/64483fig04.jpg" data-altupdatedat="1754907201000" data-alt="Figure 4"> Figura 4: Montaje del dispositivo. (A) Diferentes piezas para el montaje de HuMiX: (1) tapa inferior de PC; (2) junta con membrana microporosa recubierta de colágeno, que se coloca encima de (1); (3) junta sándwich con una membrana nanoporosa recubierta de mucina en el medio y colocada encima de (2); (4) tapa superior de PC colocada encima de (3). Cada lado de las juntas y tapas de PC mide 6,4 cm. (B) Todas las piezas de (A) se colocan juntas. (C,D) Vista superior (izquierda) y lateral (derecha) del dispositivo ensamblado. B se coloca en el sistema de sujeción para cerrar el sistema. (C) Cada lado de la abrazadera superior mide 8 cm. Abreviatura: PC = policarbonato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64483/64483fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Diagrama de configuración de transferencia de fluidos intravenosos; tubos, conectores, válvula para sistema de infusión médica." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64483/64483fig05.jpg" data-altupdatedat="1754907201000" data-alt="Figure 5"> Figura 5: Piezas necesarias para la línea de tubería y la línea de tubería ensamblada para una cámara. (A) Diferentes partes para construir una línea de tubería: a. línea de tubería de bomba; b. llave de paso de tres vías; c. aguja de 40 mm; d. aguja de 80 mm; e. aguja de 120 mm; f. línea de tubo larga (20 cm); g. línea de tubo corta (8 cm); h. Luer macho; i. Luer femenino; J. Adaptador. (B) Línea de tubería ensamblada para la cámara bacteriana o epitelial. Para la cámara neuronal, la aguja de 120 mm tendría que cambiarse por una aguja de 80 mm. (C) Válvula llave de paso de tres vías girada para redirigir el flujo del medio desde el dispositivo al 'conector abierto' y cerrar la cámara. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64483/64483fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Día</td>
			<td>0</td>
			<td>2</td>
			<td>4</td>
			<td>6</td>
			<td>8</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td rowspan="6">Composición de medios</td>
			<td>100% E6</td>
			<td>100% E6</td>
			<td>75% E6</td>
			<td>50% E6</td>
			<td>25% E6</td>
			<td>100% N2</td>
		</tr><tr><td>+ LDN</td>
			<td>+ LDN</td>
			<td>25% N2</td>
			<td>50% N2</td>
			<td>75% N2</td>
			<td>+ LDN</td>
		</tr><tr><td>+ SB</td>
			<td>+ SB</td>
			<td>+ LDN</td>
			<td>+ LDN</td>
			<td>+ LDN</td>
			<td>+ SB</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>+ CHIR</td>
			<td>+ SB</td>
			<td>+ SB</td>
			<td>+ SB</td>
			<td>+ CHIR</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td></td>
			<td>+ CHIR</td>
			<td>+ CHIR</td>
			<td>+ CHIR</td>
			<td>+ RA</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>+ RA</td>
			<td>+ RA</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Molécula</td>
			<td>[concentración]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>LDN</td>
			<td>100 nM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>SB</td>
			<td>10 μM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>CHIR</td>
			<td>3 μM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Ácido retinoico (AR)</td>
			<td>1 μM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Composición de los medios.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Medio</td>
			<td>Componentes (concentraciones enumeradas en la tabla de materiales)</td>
			<td>Volumen (mL)</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">Medios N2 (50 ml)</td>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>48</td>
		</tr><tr><td>Suplemento de N2</td>
			<td>0.5</td>
		</tr><tr><td>L-glutamina</td>
			<td>0.5</td>
		</tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td>
			<td>0.5</td>
		</tr><tr><td>NEAA</td>
			<td>0.5</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">Medios N2B27/ENS (50 ml)</td>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>48</td>
		</tr><tr><td>Suplemento de N2</td>
			<td>0.5</td>
		</tr><tr><td>L-glutamina</td>
			<td>0.5</td>
		</tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td>
			<td>0.5</td>
		</tr><tr><td>B27-A</td>
			<td>0.5</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 2: Recetas de medios.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Temperatura de esterilización (°C)</td>
			<td>116</td>
		</tr><tr><td>Tiempo de esterilización (min)</td>
			<td>20</td>
		</tr><tr><td>Tiempo de secado (min)</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td>Pulsos</td>
			<td>3</td>
		</tr><tr><td>Temperatura final (°C)</td>
			<td>99</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 3: Funcionamiento del autoclave HuMiX. 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Rotaciones por minuto (rpm)</td>
			<td>Caudal medio (μL/min)</td>
		</tr><tr><td>0.5</td>
			<td>13</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>79</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>180</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 4: Caudales de la bomba peristáltica.

neuroHuMiX es un modelo avanzado de intestino en un chip para estudiar las interacciones de células bacterianas, epiteliales y neuronales en condiciones de cocultivo proximales y representativas. Este modelo permite desentrañar los mecanismos moleculares que subyacen a la comunicación entre el microbioma intestinal y el sistema nervioso.

Un modelo de intestino en un chip para estudiar el eje microbioma intestinal-sistema nervioso

The human body is colonized by at least the same number of microbial cells as it is composed of human cells, and most of these microorganisms are located ...

Este protocolo es importante ya que permite estudiar por primera vez el efecto de una especie bacteriana sobre las células del sistema nervioso entérico. Dado que el sistema nervioso entérico no es fácilmente accesible, este modelo permite estudiar el efecto del microbioma intestinal en las células del sistema nervioso entérico. En el futuro, este modelo se puede utilizar para ver cómo el microbioma intestinal de los pacientes enfermos afecta a las células del sistema nervioso entérico, por ejemplo, en la enfermedad de Parkinson.Un posible objetivo futuro sería conectar este modelo con otros modelos de órganos en chip para construir un modelo representativo del eje intestino-cerebro. La demostración visual de esta técnica es fundamental, ya que el protocolo incluye muchos pasos y cada paso es crucial para esta realización exitosa de este modelo. La demostración de este procedimiento estará a cargo de Catherine Sedrani, candidata a doctorado del Laboratorio de Ecología de Sistemas.Para comenzar, apriete los tornillos, asegurando las partes superior e inferior de la abrazadera, y transfiera la tapa inferior de policarbonato recubierta y seca de la placa de Petri cuadrada a la parte superior de la base de la abrazadera sosteniendo los cuatro tornillos en la esquina de la tapa. Utilice pinzas estériles para colocar la junta de la cámara epitelial con la membrana hacia arriba sobre la tapa de policarbonato. Alinee la junta y la tapa con tornillos, asegurándose de que los puertos de entrada y salida de las esquinas estén alineados con las aberturas de la junta.Coloque la junta de sándwich encima de la junta de colágeno con la parte superior hacia arriba. Y luego coloque la tapa superior de policarbonato encima de la junta del sándwich. Asegúrese de que las lengüetas de la tapa de la abrazadera estén alineadas con la abertura de entrada y salida de los conjuntos de membrana, y que los tornillos de la tapa inferior encajen en la abertura de la tapa superior.Para cerrar el dispositivo, coloque la tapa de la abrazadera encima de la tapa de policarbonato y cierre los pestillos. Para el cebado de las líneas de tubería, inserte las agujas de aireación con filtros en el tabique de cada botella de entrada y salida. Con unas pinzas limpias y estériles, inserte las agujas de 120 milímetros en los frascos de suero de 250 milímetros y las agujas de 80 milímetros en los frascos de suero de 15 milímetros.Inserte las agujas de 40 milímetros al final de cada línea de tubo en un frasco de suero de salida. Las agujas de 40 milímetros de las líneas de tubos epiteliales y neuronales están conectadas a la misma botella de salida para el descarte medio. La línea de tubos bacterianos va a la segunda botella de salida.Inserte las líneas de tubería de la bomba en los casetes de la bomba. Ajuste la bomba peristáltica para dirigir los medios desde el flujo de entrada a la botella de salida a una velocidad de cinco RPM y presione el botón de inicio para arrancar la bomba. Asegúrese de que las llaves de paso de tres vías de las líneas de tubería estén abiertas.Una vez que el medio caiga en las botellas de salida, asegúrese de que no haya fugas ni burbujas de aire en las líneas de tubería y los puntos de conexión. Cuando todas las líneas de tubos caigan en las botellas de salida, ajuste el caudal a dos RPM para conectar el dispositivo inicial. Para conectar una línea, cierre las válvulas de llave de paso de tres vías, comenzando por el lado de salida.Desconecte el tubo corto del conector del señuelo hembra y conéctelo al puerto de salida del dispositivo empujando el tubo sobre la lengüeta. Para una conexión segura y sin fugas, empuje el tubo completamente hacia abajo sobre el conector, asegurándose de que entre en contacto con la tapa. Abra la llave de paso una vez que una línea esté completamente conectada al dispositivo.Ajuste el caudal de la bomba a dos RPM y aumente la velocidad de la bomba a un máximo de 2,5 RPM para evitar fugas debido a la acumulación de presión. Deje que la bomba cebe las cámaras. Reduzca la velocidad de la bomba a 0,5 RPM una vez que todas las cámaras estén llenas con el medio de cultivo celular y no queden burbujas en el dispositivo.Para las células epiteliales, separe las células Caco-2 del matraz con tripsina EDTA. Vuelva a suspenderlos en RPMI 1640 más 10% FBS y cuéntelos en un contador de células de Neubauer utilizando el ensayo de exclusión de azul de tripano. Centrifugar la suspensión de células Caco-2 durante tres minutos a 300 G y desechar el sobrenadante para eliminar los disparos restantes en EDTA.Resuspender las células Caco-2 en RPMI 1640 más 10% FBS para obtener una suspensión de 0,35 millones de células por mililitro. Transfiera 1,5 mililitros de la suspensión de células Caco-2 a una jeringa estéril de dos mililitros y elimine las burbujas de aire restantes en la jeringa. Cierre las válvulas de llave de paso de tres vías en la tubería de las cámaras bacteriana y neuronal y desconecte la tubería de la bomba retirando los casetes con la tubería respectiva del rotor.Abra la tapa de la válvula de llave de paso de la tubería de entrada que conduce a la cámara epitelial y gire la válvula para redirigir el flujo del medio desde el dispositivo hasta el conector abierto. Deje que el medio fluya hasta que aparezca una gota del medio en el extremo abierto de la válvula de cierre. Inserte la jeringa con células epiteliales en el conector abierto utilizando el método de conexión gota-gota para evitar la introducción de burbujas de aire durante la inserción.Gire la válvula de la llave de paso para detener el flujo del medio desde el frasco de entrada y permitir el flujo desde la jeringa conectada hasta el dispositivo inicial. Desconecte la cámara epitelial de la bomba y presione lentamente la jeringa para inocular la cámara epitelial con 1,5 mililitros de suspensión celular. Cierre la válvula de la llave de paso de salida y desconecte la jeringa.Cierre el extremo abierto de la llave de paso con la tapa y mantenga la cámara cerrada durante al menos dos horas. Mientras tanto, inocular las células neuronales. Después de retirar el dispositivo de la incubadora y quitar las líneas de tubos, abra lentamente la abrazadera y retire la tapa.Retire la tapa superior de policarbonato con cuidado. Recoja el medio en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y colóquelo en hielo. Retire con cuidado la junta sándwich mientras recoge los medios de la cámara epitelial sin tocar la capa celular.Coloque la junta del sándwich en una placa de Petri cuadrada y agregue una solución estéril de cloruro de sodio al 0,9% y agua a la cámara bacteriana hasta que la cámara esté completamente cubierta. Retire lentamente la junta de colágeno mientras recoge los medios de la cámara neuronal. Después de transferir el medio a un tubo de microcentrífuga, coloque los tubos en hielo.Coloque la junta de colágeno en un plato cuadrado y agregue suavemente unos mililitros de PBS a la capa de Caco-2 hasta que la capa celular esté completamente cubierta. Coloque la tapa inferior de policarbonato en una placa de Petri cuadrada y agregue suavemente aproximadamente dos mililitros de PBS encima de las células neuronales para que no se sequen durante el proceso de muestreo. Centrifugar el tubo de medios durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.Después de transferir los sobrenadantes de cada tubo a un nuevo tubo de microcentrífuga, colóquelo en hielo seco inmediatamente. El recuento de UFC se evaluó para dos configuraciones iniciales de dispositivos diferentes. L. reuteri co-cultivado con Caco-2 y L.reuteri en el dispositivo de diafonía microbiana humana.En ambas configuraciones, los recuentos de UFC fueron significativamente diferentes del inóculo HuMix y de las células recolectadas, lo que indica el crecimiento de las células bacterianas dentro del dispositivo inicial. Para evaluar si el cultivo de las neuronas entéricas en el dispositivo altera el fenotipo celular, se observó su morfología macroscópica utilizando un microscopio de contraste de fase invertida. El establecimiento de una red neuronal confluente indicó que las células se habían adherido bien a la tapa de policarbonato de los dispositivos recubiertos.El borde entre la red neuronal confluente y la espiral delineada por la junta era claramente evidente. El potencial de la neuro húmica radica en responder a preguntas que antes eran difíciles de abordar, relacionadas con las interacciones entre el microbioma humano-intestinal y el sistema nervioso entérico debido a la falta de un modelo representativo.

a-gut-on-a-chip-model-to-study-the-gut-microbiome-nervous-system-axis

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Investigación

JoVE Journal

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