Name: Cultivo celular IDG-SW3 en matriz extracelular tridimensional (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-13T14:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Aprende a cultivar células IDG-SW3 en matriz extracelular tridimensional para estudiar osteogénesis y formación de dendritas. Este protocolo mejora el análisis de expresión génica mediante técnicas avanzadas de imagen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a la Dra. Lynda F. Bonewald por regalar la línea celular IDG-SW3. Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82070902, 82100935 y 81700778) y el Proyecto de Navegación de Shanghái "Innovación Científica y Tecnológica" (21YF1442000).

Este protocolo es adecuado para el cultivo de células en cuatro pocillos de placas de 24 pocillos. Si se preparan varias muestras o placas, las cantidades de los reactivos deben aumentarse en consecuencia.
1. Preparación de la mezcla de colágeno I
NOTA: El colágeno I y la matriz de la membrana basal se gelifican rápidamente a temperatura ambiente. Por lo tanto, el colágeno debe manipularse en hielo (2 °C a 8 °C). Todas las puntas y tubos utilizados deben estar preenfriados a menos que se indique lo contrario. Todos los procedimientos deben realizarse en una capucha de seguridad.
<ol><li>Coloque todos los reactivos y los tubos de centrífuga sobre hielo.</li>
	<li>Pipetear lentamente 0,48 ml de colágeno I (5 mg/ml) y 0,1 ml de medio esencial mínimo (MEM) 10x (con rojo de fenol) en un tubo de centrífuga estéril de 15 ml mantenido en hielo. Mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo suavemente.</li>
	<li>De acuerdo con la paleta de colores del indicador rojo fenol, use un volumen apropiado de 7.5% (p/v) NaHCO3 (aproximadamente 0.2 mL) para ajustar el indicador rojo fenol a naranja, lo que indica que el valor de pH está en el rango de 7.0-7.4. NOTA: Dependiendo del pH del medio, se utiliza un volumen de NaHCO3 para llevar el pH a aproximadamente 7,0-7,4. Además, el NaOH se utiliza para la neutralización del pH.</li>
	<li>Lleve el volumen final de la mezcla hasta 1 ml agregando un volumen apropiado de ddH2O. Mezcle bien pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo para prepararse para su uso. NOTA: El volumen final deddH2O dependerá de la cantidad de NaHCO 3 o NaOH utilizada en el paso1.3 .</li>
</ol>2. Preparación de la mezcla célula-matriz
<ol><li>Pipetear lentamente 0,9 ml de matriz de membrana basal en un nuevo tubo de centrífuga de 15 ml sobre el hielo.</li>
	<li>Cultivo de las células IDG-SW3 en un matraz T25 con 4 mL de medio completo (alfa-MEM que contiene 10% de suero fetal bovino [FBS]) suplementado con 50 U/mL de INF-γ a 33 °C.</li>
	<li>Una vez que las células IDG-SW3 alcancen el 90% de confluencia, retire el medio y lave las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4 durante todo el protocolo) con una pipeta. Digiera las células con 0,5 mL de ácido tripsina-etilendiaminotetraacético (EDTA) al 0,25% a 37 °C durante 30 s.</li>
	<li>Inactivar la tripsina añadiendo 3,5 mL de medio completo (alfa-MEM que contiene un 10% de suero fetal bovino [FBS]). Transfiera la suspensión celular de 4 ml a un tubo de centrífuga de 15 ml.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión celular a 300 × g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo celular en 1 mL del medio completo en hielo.</li>
	<li>Cuente las células con un hemocitómetro y ajuste la densidad celular final con el medio completo a 4 × 105 células/mL. Añadir 0,1 mL de la suspensión celular preparada a 0,9 mL de la matriz extracelular del paso 2.1. Mezcle bien pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. NOTA: Si se necesita un control libre de células, agregue 0,1 ml del medio completo a 0,9 ml de matriz extracelular como control negativo.</li>
</ol>3. Enchapado de la mezcla de células y gel
<ol><li>Mezcle suavemente las dos mezclas del paso 2.6 y el paso 1.4 a 2 ml pipeteando hacia arriba y hacia abajo sobre el hielo. Pipetear 0,5 ml de la mezcla final en cada pocillo (cuatro pocillos de una placa de 24 pocillos). Incubar a 37 °C durante 1 h para formar una mezcla de células y gel.</li>
	<li>Añadir 0,5 mL de medio osteogénico (medio completo que contiene 50 μg/mL de ácido ascórbico y 4 mM de β-glicerofosfato, también conocido como medio de inducción osteogénico)4 a la mezcla de célula y gel en cada pocillo para iniciar la diferenciación osteogénica a 37 °C. Considéralo como el Día 0.</li>
	<li>Cada 2 días, sustituya la mitad del medio por medio osteogénico fresco mantenido a 37 °C. Continuar el cultivo durante 35 días.</li>
</ol>4. Identificación de la viabilidad celular y de las dendritas celulares mediante un microscopio confocal
<ol><li>Tinción celular NOTA: El éster acetoximetílico de calceína (calceína AM) es un colorante permeado por células que se puede usar para determinar la viabilidad celular. El homodímero de etidio-I (EthD-1) no atraviesa la membrana de las células intactas/viables9. Por lo tanto, la calceína AM/EthD-1 se puede utilizar para identificar la viabilidad celular y las dendritas celulares.<ol><li>En el día 1 y el día 7 del cultivo, retire la solución madre de calceína AM (4 mM en DMSO) y la solución madre de EthD-1 (2 mM en DMSO/H2O 1:4 [v/v]) del congelador y deje que se calienten a temperatura ambiente. NOTA: La matriz mineralizada tiene una fuerte señal de autofluorescencia, por lo que la etapa de preosteocitos sin expresión de Dmp1 dentro de los 7 días posteriores al cultivo4 es más adecuada para la observación de la tinción celular.</li>
		<li>Agregue 4 μL de la solución madre de EthD-1 de 2 mM y 5 μL de la solución madre de calceína AM de 4 mM a 2 ml de solución salina tamponada con fosfato (D-PBS) de Dulbecco y mezcle bien. Esto da aproximadamente 2 μM de calceína AM y 4 μM de EthD-1 como soluciones de trabajo.</li>
		<li>Pipetear 0,5 ml de la solución de trabajo en los pocillos de la placa de 24 pocillos. Incubar durante 30-45 min a temperatura ambiente para teñir la matriz de célula y gel.</li>
		<li>Después de la incubación, agregue aproximadamente 0,5 ml de D-PBS fresco a una nueva placa de cultivo con fondo de vidrio de 35 mm. Cubra el plato para evitar la contaminación o el secado de las muestras.</li>
		<li>Con unas pinzas con punta de codo, transfiera con cuidado la matriz de gel celular teñida del paso 4.1.3 a la placa de cultivo de 35 mm del paso 4.1.4. Evite dañar o cortar la matriz de célula y gel.</li>
		<li>Observe las células marcadas bajo un microscopio láser de fluorescencia confocal.</li>
	</ol></li>
	<li>Equipo de escaneo microscópico<ol><li>Coloque el plato de 35 mm en el escenario. Seleccione las regiones de la matriz célula-gel que se van a escanear a través del ocular con un objetivo de 10x. No se recomiendan objetivos de mayor aumento debido al tamaño de las dendritas extendidas.</li>
		<li>Seleccione los filtros ópticos. La calceína se puede ver como verde con un filtro de paso de banda de fluoresceína estándar, y EthD-1 se puede ver como rojo con filtros para yoduro de propidio o tinte rojo de Texas. Seleccione el "modo de línea" para escanear y ajuste el "agujero de alfiler" a 2 μm.</li>
		<li>Seleccione una profundidad de datos de 8 bits y una resolución de imagen de 1.024 píxeles x 1.024 píxeles.</li>
		<li>Imagen mediante escaneo lineal secuencial con los ajustes óptimos del láser y del detector (mantenga una energía láser mínima para evitar un posible fotoblanqueo). NOTA: La configuración óptima del detector depende de las señales de fluorescencia finales.</li>
	</ol></li>
	<li>Recopilación de una "pila z" de imágenes<ol><li>De acuerdo con la señal del canal verde, defina las posiciones superior e inferior de la matriz de célula y gel que se escaneará enfocándose a través de la muestra mientras escanea continuamente, .</li>
		<li>Una vez que se hayan especificado la parte superior e inferior de la muestra, seleccione el marco de escaneo deseado. Comience a escanear. La muestra se escaneará de arriba a abajo con la configuración seleccionada del paso 4.2, generando una galería de imágenes.</li>
	</ol></li>
	<li>Identificación de la viabilidad celular.<ol><li>Seleccione un sector del paso 4.3. Los canales verde y rojo indican células vivas y muertas, respectivamente.</li>
	</ol></li>
	<li>Identificación de dendritas celulares.<ol><li>Seleccione el único canal verde para generar reconstrucciones 3D con el software de adquisición de imágenes. La información de profundidad se muestra como una serie de imágenes de pseudocolor del arco iris. Las dendritas ubicadas en la parte inferior del gel se muestran en rojo, mientras que las de la parte superior se muestran en azul.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Identificación de la apariencia mediante un microscopio estereoscópico
<ol><li>En el día 1, el día 7, el día 21 y el día 35 del cultivo, retire el medio de cultivo y lave los geles en la placa dos veces con D-PBS. Agregue 0,5 mL de paraformaldehído al 4% (v/v) en D-PBS al pocillo para fijar la matriz de célula y gel en la placa durante 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Retire el paraformaldehído del pocillo y lave la matriz de célula y gel dos veces más con D-PBS en la placa. Deje 0,5 ml de D-PBS en cada pocillo para la obtención de imágenes.</li>
	<li>Coloque la placa en la platina y seleccione la posición óptima a través del ocular con un objetivo de 0,5x. Visualice la vista de campo completo de la matriz de célula y gel en la placa individualmente utilizando la "exposición automática" bajo el campo brillante.</li>
</ol>6. Identificación de la deposición mineral con un ensayo XRF
<ol><li>En el día 35 del cultivo, compruebe si el nitrógeno líquido es suficiente. Inicie el sistema XRF. Abra la sala de muestras y transfiera los geles con pinzas con punta de codo desde la placa hasta el centro de la etapa de muestra del instrumento. Cierre la sala de muestras y espere 30 minutos para que el instrumento se enfríe antes de usarlo.</li>
	<li>Establezca el "Tiempo de exposición" en 35 ms, el "Rango de espectro" en 0-40 keV y la "Corriente eléctrica" en 770 μA para la configuración de adquisición.</li>
	<li>Elija de tres a cinco sitios de escaneo para el análisis moviendo la etapa de muestra.</li>
	<li>Seleccione los elementos (Ca y P) para la detección. Inicie la detección y exporte los resultados. NOTA: El Ca y el P son los elementos más abundantes en la hidroxiapatita.</li>
</ol>7. Identificación de la expresión génica funcional
<ol><li>En el día 1, el día 7, el día 21, el día 28 y el día 35 del cultivo, retire el medio de cultivo y lave la matriz de gel celular dos veces con D-PBS helado en la placa.</li>
	<li>Transfiera los geles con pinzas con punta de codo de la placa a un tubo de 2,0 ml (según el tiempo de cultivo, la matriz de célula y gel se reducirá gradualmente hasta aproximadamente 0,1 ml el día 35). Asegúrese de que se coloque un gel en un tubo. Añadir 1 ml de fenol-cloroformo y dos perlas de acero inoxidable estériles (4 mm, como matriz de lisado) en cada tubo. Coloque los tubos simétricamente en la ranura de muestra preenfriada del homogeneizador de batido mecánico.</li>
	<li>Ajuste el batido a una frecuencia de 55 Hz y una amplitud de 1 cm en cada 1 minuto de batido mecánico con una pausa de 10 s, con seis ciclos en total. Comienza a batir cuentas.</li>
	<li>Extraiga el ARN total de la matriz célula-gel mediante el método de fenol-cloroformo-isoamilachohol. Transcriba inversamente 2 μg de ARN total a ADNc con cebadores de hexámero aleatorios.</li>
	<li>Diseñe cebadores dirigidos a la β-actina, Pdpn, Dmp1, Sost y Fgf23 para la PCR en tiempo real (Tabla 2). β-actina es el gen de mantenimiento utilizado para la normalización. Los genes Pdpn10 y Dmp1 11 se expresan principalmente en preosteocitos y osteocitos mineralizados, mientras que Sost12 y Fgf23 13 se expresan principalmente en osteocitos maduros.</li>
	<li>Coloque el tubo en un termociclador con la tapa calentada ajustada a 105 °C y realice la amplificación por PCR utilizando los siguientes ajustes de ciclo de PCR: 95 °C durante 5 s y 60 °C durante 30 s durante 35 ciclos con un paso inicial de desnaturalización a 95 °C durante 5 min y un paso de extensión final a 60 °C durante 30 s. Analice los cambios de pliegue con el método ΔΔCt.</li>
</ol>

<ol><li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amazing+osteocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">The amazing osteocyte.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).</li>
<li>Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+osteocyte%3A+An+endocrine+cell+...+and+more%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">The osteocyte: An endocrine cell ... and more.</a> Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).</li>
<li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+osteocyte+in+bone+and+nonbone+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology+and+Metabolism+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">The role of the osteocyte in bone and nonbone disease.</a> Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. 46 (1), 1-18 (2017).</li>
<li>Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+line+IDG-SW3+replicates+osteoblast-to-late-osteocyte+differentiation+in+vitro+and+accelerates+bone+formation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).</li>
<li>Wang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+osteocyte+dendrite+formation+by+Sp7+and+its+target+gene+osteocrin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Control of osteocyte dendrite formation by Sp7 and its target gene osteocrin.</a> Nature Communications. 12 (1), 6271(2021).</li>
<li>Chicatun, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoid-mimicking+dense+collagen%2Fchitosan+hybrid+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Osteoid-mimicking dense collagen/chitosan hybrid gels.</a> Biomacromolecules. 12 (8), 2946-2956 (2011).</li>
<li>Kawasaki, K., Buchanan, A. V., Weiss, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomineralization+in+humans%3A+making+the+hard+choices+in+life%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Biomineralization in humans: making the hard choices in life.</a> Annual Review of Genetics. 43, 119-142 (2009).</li>
<li>Bosman, F. T., Stamenkovic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+structure+and+composition+of+the+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Functional structure and composition of the extracellular matrix.</a> Journal of Pathology. 200 (4), 423-428 (2003).</li>
<li>Papadopoulos, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+fluorescence+assay+for+the+determination+of+lymphocyte-mediated+cytotoxicity+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved fluorescence assay for the determination of lymphocyte-mediated cytotoxicity using flow cytometry.</a> Journal of Immunological Methods. 177 (1-2), 101-111 (1994).</li>
<li>Staines, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypomorphic+conditional+deletion+of+E11%2FPodoplanin+reveals+a+role+in+osteocyte+dendrite+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hypomorphic conditional deletion of E11/Podoplanin reveals a role in osteocyte dendrite elongation.</a> Journal of Cellular Physiology. 232 (11), 3006-3019 (2017).</li>
<li>Feng, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+DMP1+causes+rickets+and+osteomalacia+and+identifies+a+role+for+osteocytes+in+mineral+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism.</a> Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).</li>
<li>Winkler, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteocyte+control+of+bone+formation+via+sclerostin%2C+a+novel+BMP+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Osteocyte control of bone formation via sclerostin, a novel BMP antagonist.</a> EMBO Journal. 22 (23), 6267-6276 (2003).</li>
<li>Riminucci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-23+in+fibrous+dysplasia+of+bone+and+its+relationship+to+renal+phosphate+wasting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">FGF-23 in fibrous dysplasia of bone and its relationship to renal phosphate wasting.</a> Journal of Clinical Investigation. 112 (5), 683-692 (2003).</li>
<li>Dallas, S. L., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+transition+from+osteoblast+to+osteocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the transition from osteoblast to osteocyte.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1192, 437-443 (2010).</li>
<li>Robin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+3D+osteoblast+migration+and+bone+apatite+during+in+vitro+early+osteocytogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Involvement of 3D osteoblast migration and bone apatite during in vitro early osteocytogenesis.</a> Bone. 88, 146-156 (2016).</li>
<li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+mineralization+capacity+of+IDG-SW3+cells+in+3D+collagen+hydrogel+for+bone+healing+in+estrogen-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">High mineralization capacity of IDG-SW3 cells in 3D collagen hydrogel for bone healing in estrogen-deficient mice.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 864(2020).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Un punto crítico en este protocolo es que los pasos 1 y 2 deben realizarse en hielo para evitar la coagulación espontánea. En este método, la concentración final de colágeno I fue de 1,2 mg/mL. Por lo tanto, se debe calcular un volumen óptimo de ddH2O para que coincida con los diferentes colágenos de varios fabricantes.
In vivo, la osteocitogénesis implica un movimiento polar de los osteoblastos desde la superficie hacia el interior del hueso trabecular14<...

Los osteocitos son células terminalmente diferenciadas derivadas de osteoblastos 1,2. Una vez que el osteoblasto es enterrado por el osteoide, se somete a osteocitogénesis y expresa el gen Pdpn para formar preosteocitos, el gen Dmp1 para mineralizar el osteoide y los genes Sost y Fgf23 para funcionar como un osteocito maduro en el tejido óseo3. Aquí, se introduce un sistema de cultivo 3D para identificar la extensión de las dendritas y la expresión génica de marcadores en el proceso de osteocitogénesis.
Las células IDG-SW3 son una línea celular primaria inmortalizada derivada de ratones transgénicos y pueden expandirse o replicarse osteoblastos a la diferenciación tardía de osteocitos cuando se cultivan en diferentes medios4. En comparación con MLO-A5, MLO-Y4 y otras líneas celulares, es más probable que el perfil de expresión de las proteínas funcionales, la capacidad de realizar la deposición de sales de calcio y las respuestas a diversas hormonas en las células IDG-SW3 sean las mismas que las de los osteocitos primarios en el tejido óseo4.
En comparación con los sistemas 2D, los sistemas de cultivo 3D son más capaces de imitar el entorno de crecimiento celular in vivo, incluido el gradiente de nutrientes, la baja rigidez mecánica y el rango mecánico circundante (Tabla 1). La mayoría de los métodos anteriores para cultivar células osteoblásticas en un sistema 3D utilizaban colágeno I como componente único en las formulaciones 4,5,6, porque las fibras de colágeno I sirven como sitio de deposición de calcio y fósforo. Sin embargo, un constituyente indispensable en el osteoide, la matriz extracelular, contiene un gran grupo de factores celulares que promueven el crecimiento, la adhesión y la migración celular 7,8 y es transparente y conveniente para la observación por imágenes. Por lo tanto, este protocolo utiliza Matrigel (en adelante, matriz de membrana basal) como componente secundario para el estudio de osteocitogénesis.

<table><tbody><tr><td>0.25% Tripsina-etilendiaminaácido tetraacético</td><td>Hidrocona</td><td>SH30042.01</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 15 mL</td><td>Corning, NY, EE. UU.</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>7.5% (p/v) Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich, MO, EE. UU</td>. <td>S8761</td><td></td></tr><tr><td>ácido ascórbico</td><td>Sigma-Aldrich, MO, EE. UU.</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10483-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>suero fetal bovino</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>homogeneizador</td><td>BiHeng&nbsp; Biotecnología, Shanghái, China</td><td>Microscopía</td> de fluorescencia confocal láser SKSI <td></td></tr><tr><td></td><td>Carl&nbsp; Zeiss, Oberkochen, Alemania</td><td>LSM 800</td><td></td></tr><tr><td>Kit de imágenes de células vivas/muertas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37601</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>matrix Corning, NY, EE. UU</td><td>. 356234</td><td></td></tr><tr><td>MEM (10X), sin glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td> 21430079 <td></td></tr><tr><td>paraformaldehído Sigma-Aldrich</td><td>, MO, EE. UU</td>. SOLUCIÓN SALINA <td>tamponada</td> con fosfato 158127 <td></td></tr><tr><td></td><td>Hyclone</td><td>SH30256. </td> Microscopio estereoscópico FS <td></td></tr><tr><td></td><td>Carl&nbsp; Zeiss, Oberkochen, Alemania</td><td>Zeiss Axio ZOOM. V16</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>fluorescencia de rayos</td><td>X EDAX, EE. UU</td>. <td>EAGLE III</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glicerofosfato</td><td>Sigma-Aldrich, MO, EE. UU</td>. <td>G9422</td><td></td></tr></tbody></table>

cultivo celular idg-sw3 en matriz extracelular tridimensional

IDG-SW3 Cell Culture in a Three-Dimensional Extracellular Matrix

Se considera que los osteocitos son células no proliferativas que se diferencian terminalmente de los osteoblastos. Los osteoblastos incrustados en la matriz extracelular ósea (osteoide) expresan el gen Pdpn para formar dendritas celulares y transformarse en preosteocitos. Más tarde, los preosteocitos expresan el gen Dmp1 para promover la mineralización de la matriz y, por lo tanto, transformarse en osteocitos maduros. Este proceso se denomina osteocitogénesis. IDG-SW3 es una línea celular bien conocida para estudios in vitro de osteocitogénesis. Muchos métodos anteriores han utilizado colágeno I como el componente principal o único de la matriz de cultivo. Sin embargo, además del colágeno I, el osteoide también contiene una sustancia fundamental, que es un componente importante para promover el crecimiento, la adhesión y la migración celular. Además, la sustancia de la matriz es transparente, lo que aumenta la transparencia del gel formado por colágeno I y, por lo tanto, ayuda a la exploración de la formación de dendritas a través de técnicas de imagen. Así, en este trabajo se detalla un protocolo para establecer un gel 3D utilizando una matriz extracelular junto con colágeno I para la supervivencia de IDG-SW3. En este trabajo se analizó la formación de dendritas y la expresión génica durante la osteocitogénesis. Después de 7 días de cultivo osteogénico, se observó claramente una extensa red de dendritas bajo un microscopio confocal de fluorescencia. La PCR en tiempo real mostró que los niveles de ARNm de Pdpn y Dmp1 aumentaron continuamente durante 3 semanas. En la semana 4, el microscopio estereoscópico reveló un gel opaco lleno de partículas minerales, consistente con el ensayo de fluorescencia de rayos X (XRF). Estos resultados indican que esta matriz de cultivo facilita con éxito la transición de osteoblastos a osteocitos maduros.

Después de la tinción de células vivas/muertas, las células se visualizaron utilizando un microscopio láser confocal. Todas las células eran calceína AM positivas (color verde), y casi no había células EthD-1 positivas (color rojo) en el campo, lo que indica que el sistema de gel producido por este método es altamente adecuado para la osteocitogénesis (Figura 1A, izquierda). Para determinar mejor la distribución espacial de las células, se eligió una imagen en pseudocolor para mostrar las de...

Aquí, presentamos un protocolo para el cultivo de células IDG-SW3 en una matriz extracelular tridimensional (3D).

Cultivo celular IDG-SW3 en matriz extracelular tridimensional

Osteocytes are considered to be nonproliferative cells that are terminally differentiated from osteoblasts. Osteoblasts embedded in the bone extracellular ...

Detallamos un protocolo para establecer un sistema 3D utilizando una métrica extracelular junto con una de colágeno para analizar la formación y expresión génica a través de la osteogénesis. La métrica extracelular puede aumentar la transparencia del gel de colágeno de una forma y es adecuado para explorar la formación de dendritas para técnicas de imagen. Para comenzar, pipetee lentamente 0,9 mililitros de matriz de membrana basal en un nuevo tubo de centrífuga de 15 mililitros sobre hielo y déjelo a un lado.A continuación, retire de la incubadora un hilo dental T25 de células cultivadas con IDG SW3 en cuatro mililitros de medio completo suplementado con interferón gamma. Después de retirar el medio de cultivo, lave las células con PBS pH 7,4 con una pipeta. A continuación, tripsanar las células con 0,5 mililitros de tripsina EDTA al 0,25% a 37 grados centígrados durante 30 segundos.Inactiva la tripsina añadiendo 3,5 mililitros de medio completo. Transfiera cuatro mililitros de la pensión Celsius a un tubo de centrífuga de 15 mililitros. Gire la suspensión celular a 300 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender la paleta celular en un mililitro del medio completo en hielo. Cuente las células con un hemocitómetro y ajuste la densidad celular final con el medio completo a cuatro veces 10 a la quinta célula por mililitro. Añadir 0,1 mililitros de la suspensión celular preparada a los 0,9 mililitros de la matriz extracelular mantenida en hielo.Mezcle bien pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Mezcle suavemente un mililitro de la mezcla de matriz celular y un mililitro de la mezcla de colágeno previamente preparada pipeteando hacia arriba y hacia abajo sobre el hielo. Pipetear 0,5 mililitros de la mezcla final en cada pocillo de una placa de 24 pocillos e incubar a 37 grados centígrados durante una hora para formar una mezcla de gel celular.Después de la incubación, agregue 0,5 mililitros de medio osteogénico a la mezcla de gel celular en cada pocillo. Para iniciar la diferenciación osteogénica a 37 grados Celsius, considéralo como el día cero. Cada dos días, reemplace la mitad del medio con medio osteogénico fresco y continúe el cultivo durante 35 días.Retire las soluciones madre de calcio AM y etidio del congelador y deje que se calienten a temperatura ambiente. Agregue cuatro microlitros de los dos milimolares de etidio una solución madre y cinco microlitros de la solución madre de cuatro milimolares de calcio AM a dos mililitros de DPBS y mezcle bien para obtener dos micromolares de calcio AM y cuatro micromolares de etidio como solución de trabajo. Para realizar la tinción celular en el primer y séptimo día de cultivo, pipetee 0,5 mililitros de la solución de trabajo en los pocillos de la placa de 24 pocillos e incube durante 30 a 45 minutos a temperatura ambiente para teñir la matriz de gel celular.Agregue aproximadamente 0,5 mililitros de DPBS fresco a una nueva placa de cultivo con fondo de vidrio de 35 milímetros y cubra la placa para evitar la contaminación o el secado de las muestras. Con pinzas con punta de codo, transfiera con cuidado la matriz de gel celular teñida a la placa de cultivo que contiene DPBS sin dañar ni cortar la matriz de gel celular. Observe las células marcadas bajo un microscopio láser de fluorescencia confocal.Coloque la placa de cultivo que contiene la matriz de gel celular teñida en la platina del microscopio. Seleccione las regiones de la matriz de gel celular que se escanearán a través del ocular con un objetivo de 10x. Para configurar el escaneo del microscopio, seleccione los filtros ópticos.Vea el calcio como verde con un filtro de paso de banda fluorescente estándar y el de etidio como rojo con filtros para yoduro de propidio o tinte rojo de Texas. Seleccione el modo de línea para escanear, luego haga clic en el modo de adquisición para establecer las unidades aireadas en una au. Seleccione una profundidad de datos de 8 bits y una resolución de imagen de 1024 por 1024 píxeles.A continuación, seleccione el paso de línea y establezca la velocidad de escaneo en cinco. Para recopilar la pila Z de imágenes, defina las posiciones superior e inferior de la matriz de gel celular que se escaneará enfocándose a través de la muestra mientras escanea continuamente de acuerdo con la señal del canal verde. Una vez que se hayan especificado la parte superior e inferior de la muestra, seleccione el marco de escaneo deseado y comience a escanear.La muestra se escanea de arriba a abajo con la configuración seleccionada generando una galería de imágenes. Para identificar las células viables, seleccione un sector de imagen. Los canales verde y rojo indican células vivas y muertas respectivamente.Para identificar la dendrita celular, seleccione el único canal verde para generar reconstrucciones 3D con el software de adquisición de imágenes, una serie de imágenes de pseudo color del arco iris indican la información de profundidad. Las dendritas en la parte inferior de ella se muestran en rojo, mientras que las de la parte superior se muestran en azul. En diferentes días de cultivo, retire el medio de cultivo y lave los geles en la placa dos veces con DPBS.Agregue 0,5 mililitros o 4% de paraformaldehído en DPBS al pocillo para fijar la matriz de gel celular en la placa durante 10 minutos a temperatura ambiente. Retire el paraformaldehído en el pocillo y lave la matriz de gel celular dos veces más con DPBS en la placa como se demostró anteriormente, y deje 0,5 mililitros de DPBS en cada pocillo para obtener imágenes. Coloque la placa en la platina del microscopio estereoscópico y seleccione la posición óptima a través del ocular con un objetivo de 0,5x.Imagen, la vista de campo completo de la matriz de gel celular en la placa individualmente utilizando la exposición automática bajo el campo brillante. En el día 35 de cultivo, verifique los niveles de nitrógeno líquido e inicie el sistema XRF. Abra la sala de muestras y transfiera los geles con pinzas con punta de codo desde la placa hasta el centro de la etapa de muestra del instrumento.Cierre la sala de muestras y espere 30 minutos para que el instrumento se enfríe antes de usarlo. Ajuste el tiempo de exposición a 35 milisegundos. El rango de espectro de cero a 40 kilo electronvoltios y la corriente eléctrica a 770 microamperios para la configuración de adquisición.Al mover la etapa de la muestra, elija de tres a cinco sitios de escaneo para el análisis. Seleccione los elementos calcio y fósforo. Inicie la detección y exporte los resultados.En diferentes días de cultivo. Lave el medio de cultivo y la matriz de gel celular extraída dos veces con DPBS helado como se demostró anteriormente. Extraiga el ARN total de la matriz de gel celular utilizando el método de fenol cloroformo isoamílico.A continuación, transcriba inversamente dos microgramos de ARN total a ADNc con cebadores hexámeros aleatorios. Coloque el tubo en un termociclador y realice la amplificación por PCR. Después de la PCR, analice los cambios en el pliegue con el método de TC de dos deltas.La tinción de células muertas vivas visualizada bajo un microscopio láser confocal mostró que todas las células eran positivas para calcio AM y casi ninguna célula positiva para el epidio uno, lo que indica que el sistema de gel es muy adecuado para la osteocitogénesis. Las dendritas celulares se extendieron gradualmente en una red en el medio osteogénico hacia el séptimo día. Una imagen pseudo en color de la cultura del día siete muestra a los androides celulares a diferentes profundidades en la parte inferior y en la parte superior del gel.Se obtienen imágenes de campo completo del gel con células y del gel sin células en una placa de 24 pocillos en los momentos indicados. La transparencia de la matriz de gel continuó disminuyendo hasta que se volvió opaca en el día 35, a diferencia de la matriz de gel libre de células. El espectro XRF del gel opaco en el día 35 indicó que el gel estaba completamente lleno de depósitos de calcio y fósforo.La expresión de varios genes marcadores analizados por PCR en tiempo real mostró que los niveles de ARNm de podoplanina y proteína de matriz de dentina uno aumentaron continuamente desde el primer día hasta el día 21 y el nivel de ARNm disminuyó después del día 21. Los niveles de ARNm del factor de crecimiento de fibroblastos 23 y la esclerostina aumentaron continuamente durante todas las etapas. El colágeno uno y las métricas de la membrana basal se gelifican rápidamente y a temperatura ambiente.Por lo tanto, todas las puntas y tubos utilizados deben estar preenfriados a menos que se indique lo contrario. Se puede observar cualquier evento interesante durante la osteogénesis mediante técnicas de imagen. Es más fácil localizar la acción de la molécula durante la formación y elongación de las dendritas.

idg-sw3-cell-culture-in-a-three-dimensional-extracellular-matrix

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Se describe un método simple, rápido de generación de 3D, como los tejidos esferoides y su potencial aplicación para cuantificar las diferencias en las interacciones célula-célula.

Una simple gota colgante celular Cultura Protocolo para la generación de esferoides 3D

Este manuscrito describe una técnica basada en litografía suave para diseñar matrices uniformes de tres dimensiones (3D) los tejidos epiteliales de la geometría definida rodeadas por matriz extracelular. Este método es susceptible de una amplia variedad de tipos de células y contextos experimentales y permite la selección de alto rendimiento de repeticiones idénticas.

Ingeniería tridimensionales epiteliales tejidos embebidos dentro de la matriz extracelular

Las células cancerosas se incrustan en un gel de colágeno y luego se intercalan en un gel de fibrina acelular para generar un sistema de cultivo 3D en el que se puede monitorear la invasividad y la formación de tumores satélite.

Tridimensional Ensayo de Cultivo para explorar invasividad de las células del cáncer y la formación de tumores satélite

Este es un método para crear un andamio de cultivo celular de 3 dimensiones de la matriz extracelular pulmonar. pulmonar intacta se procesa en hidrogeles que pueden apoyar el crecimiento de células en tres dimensiones.

Los hidrogeles sintonizable de la matriz extracelular pulmonar por la 3D de Cultivos Celulares

La matriz extracelular específica del tejido (ECM) es un mediador clave de la función celular. Este artículo describe métodos para la síntesis de espumas y microportadores que son estables en cultivo sin la necesidad de reticulación química para aplicaciones en 3D avanzados en modelos de cultivo celular in vitro o como matrices biodegradables pro-regenerativas puros ECM-derivado.

La fabricación de espumas y microportadores derivados de la matriz extracelular como específica de tejido de cultivo celular y las plataformas de entrega

El objetivo de este protocolo es evaluar el efecto de los factores pro y anti migratory en migración de la célula dentro de una matriz tridimensional de fibrina.

Caracterización de la migración de la célula en tres dimensiones In Vitro herida ambientes

Aquí, presentamos un protocolo para obtener sistemas 3D-cultura en uno mismo-montaje de andamios péptido para promover la diferenciación de condrocitos articulares humanos dedifferentiated en tejido similar al cartílago.

Cultivo de células de mamífero en andamios tridimensionales péptido

Describimos un método para construir dispositivos para la cultura 3D y la experimentación con células y organoides multicelulares. Este dispositivo permite el análisis de las respuestas celulares a señales solubles en microambientes 3D con degradados de quimioattractant definidos. Los organoides son mejores que las células individuales en la detección de entradas ruidosas débiles.

Análisis 3D de las respuestas multicelulares a los degradados Quimioattractant

La invasión es un fenómeno biológico importante en el desarrollo y la progresión del cáncer. Este proceso está influenciado por las células no neoplásicas y los componentes del microambiente tumoral. El propósito de este estudio es describir un método alternativo para analizar la invasión de células tumorales in vitro utilizando cultivos tridimensionales (3D).

Estrategia alternativa para analizar la invasión celular in vitro de cultivos 3D

Aquí, demostramos cómo las células epiteliales cultivadas con fibroblastos en el sistema de dos capas basado en membranas nanofibrosas pueden adherirse y crecer de manera estable en la membrana.

Establecimiento de un módulo de cocultivo tridimensional de células epiteliales utilizando membranas nanofibrosas

Aprende a cultivar células IDG-SW3 en matriz extracelular tridimensional para estudiar osteogénesis y formación de dendritas. Este protocolo mejora el análisis de expresión génica mediante técnicas avanzadas de imagen.

Cultivo celular IDG-SW3 en matriz extracelular tridimensional

Explorar más videos