Name: Circuitos digitales genéticos basados en sistemas CRISPR-Cas y proteínas anti-CRISPR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Aprende a diseñar circuitos digitales genéticos en levadura utilizando sistemas CRISPR-Cas tipo 2 y 5 con proteínas anti-CRISPR. Este método permite construir redes transcripcionales sintéticas en Saccharomyces cerevisiae.

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Queremos agradecer a todos los estudiantes del laboratorio de Biología Sintética -SPST, TJU- por su ayuda general, junto con Zhi Li y Xiangyang Zhang por su asistencia en los experimentos de FACS.

<ol><li>Marchisio, M. A., Stelling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+design+of+digital+synthetic+gene+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Automatic design of digital synthetic gene circuits.</a> PLOS Computational Biology. 7 (2), 1001083(2011).</li>
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<li>Mandell, J. G., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+finger+tools%3A+custom+DNA-binding+domains+for+transcription+factors+and+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Zinc finger tools: custom DNA-binding domains for transcription factors and nucleases.</a> Nucleic Acids Research. 34, 516-523 (2006).</li>
<li>Bogdanove, A. J., Voytas, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAL+effectors%3A+customizable+proteins+for+DNA+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting.</a> Science. 333 (6051), 1843-1846 (2011).</li>
<li>Drinnenberg, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNAi in budding yeast.</a> Science. 326 (5952), 544-550 (2009).</li>
<li>Gander, M. W., Vrana, J. D., Voje, W. E., Carothers, J. M., Klavins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+logic+circuits+in+yeast+with+CRISPR-dCas9+NOR+gates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Digital logic circuits in yeast with CRISPR-dCas9 NOR gates.</a> Nature Communications. 8, 15459(2017).</li>
<li>Farzadfard, F., Perli, S. D., Lu, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunable+and+multifunctional+eukaryotic+transcription+factors+based+on+CRISPR%2FCas%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Tunable and multifunctional eukaryotic transcription factors based on CRISPR/Cas.</a> ACS Synthetic Biology. 2 (10), 604-613 (2013).</li>
<li>Nakamura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-CRISPR-mediated+control+of+gene+editing+and+synthetic+circuits+in+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Anti-CRISPR-mediated control of gene editing and synthetic circuits in eukaryotic cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 194(2019).</li>
<li>Louvion, J. F., Havaux-Copf, B., Picard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+GAL4-VP16+to+a+steroid-binding+domain+provides+a+tool+for+gratuitous+induction+of+galactose-responsive+genes+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Fusion of GAL4-VP16 to a steroid-binding domain provides a tool for gratuitous induction of galactose-responsive genes in yeast.</a> Gene. 131 (1), 129-134 (1993).</li>
<li>DiCarlo, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems.</a> Nucleic Acids Research. 41 (7), 4336-4343 (2013).</li>
<li>Gao, Y., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-processing+of+ribozyme-flanked+RNAs+into+guide+RNAs+in+vitro+and+in+vivo+for+CRISPR-mediated+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Integrative+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Self-processing of ribozyme-flanked RNAs into guide RNAs in vitro and in vivo for CRISPR-mediated genome editing.</a> Journal of Integrative Plant Biology. 56 (4), 343-349 (2014).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li>
<li>Fonfara, I., Richter, H., Bratovic, M., Le Rhun, A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRISPR-associated+DNA-cleaving+enzyme+Cpf1+also+processes+precursor+CRISPR+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA.</a> Nature. 532 (7600), 517-521 (2016).</li>
<li>Yu, L., Marchisio, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+cerevisiae+synthetic+transcriptional+networks+harnessing+dCas12a+and+Type+V-A+anti-CRISPR+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces cerevisiae synthetic transcriptional networks harnessing dCas12a and Type V-A anti-CRISPR proteins.</a> ACS Synthetic Biology. 10 (4), 870-883 (2021).</li>
<li>Zhang, Y., Marchisio, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+bare+dSpCas9%2C+scaffold+gRNA%2C+and+type+II+anti-CRISPR+proteins+highly+favors+the+control+of+gene+expression+in+the+yeast+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Interaction of bare dSpCas9, scaffold gRNA, and type II anti-CRISPR proteins highly favors the control of gene expression in the yeast S. cerevisiae.</a> ACS Synthetic Biology. 11 (1), 176-190 (2022).</li>
<li>Sheff, M. A., Thorn, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+cassettes+for+fluorescent+protein+tagging+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Optimized cassettes for fluorescent protein tagging in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 21 (8), 661-670 (2004).</li>
<li>Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRdirect%3A+software+for+designing+CRISPR%2FCas+guide+RNA+with+reduced+off-target+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites.</a> Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).</li>
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<li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+anti-CRISPR+protein+disables+type+V+Cas12a+by+acetylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An anti-CRISPR protein disables type V Cas12a by acetylation.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 26 (4), 308-314 (2019).</li>
</ol>

Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.

El protocolo mostró un posible flujo de trabajo completo para los circuitos digitales de genes sintéticos, siguiendo el ciclo de ingeniería biológica "Diseñar-Construir-Probar-Aprender" (DBTL) y con respecto a los experimentos de laboratorio seco y laboratorio húmedo. Aquí, nos centramos en el sistema CRISPR-Cas, principalmente dSpCas9, denAsCas12a, dLbCas12a y las proteínas anti-CRISPR correspondientes, diseñando y construyendo en S. cerevisiae pequeñas redes transcripcionales. Algunos de ellos imitaban las pue...

En 2011, los investigadores propusieron un método computacional y desarrollaron una pieza correspondiente de software para el diseño automático de circuitos genéticos sintéticos digitales1. Un usuario tenía que especificar el número de entradas (tres o cuatro) y rellenar la tabla de verdad del circuito; Esto proporcionó toda la información necesaria para derivar la estructura del circuito utilizando técnicas de la electrónica. La tabla de verdad se tradujo a dos fórmulas booleanas a través del método 2 del mapa de Karnaugh. Cada fórmula booleana está hecha de cláusulas que describen operaciones lógicas (suma o multiplicación) entre (parte de) las entradas del circuito y sus negaciones (los literales). Las cláusulas, a su vez, se suman (OR) o se multiplican (AND) para calcular la salida del circuito. Cada circuito se puede realizar de acuerdo con cualquiera de sus dos fórmulas correspondientes: una escrita en forma POS (producto de sumas) y la otra en representación SOP (suma de productos). El primero consiste en una multiplicación de cláusulas (es decir, puertas booleanas) que contienen una suma lógica de los literales. Este último, en cambio, es una suma de cláusulas donde los literales se multiplican.
Los circuitos eléctricos se pueden realizar, en una placa de pruebas, conectando físicamente diferentes puertas juntas. La corriente eléctrica permite el intercambio de señales entre puertas, lo que conduce al cálculo de la salida.
En biología, la situación es más compleja. Una puerta booleana se puede realizar como una unidad de transcripción (TU; es decir, la secuencia "promotor-codificante de la región-terminador" dentro de las células eucariotas), donde la transcripción o la traducción (o ambas) están reguladas. Así, al menos dos tipos de moléculas establecen un cableado biológico: las proteínas del factor de transcripción y los ARN antisentido no codificantes1.
Un circuito digital de genes está organizado en dos o tres capas de puertas, a saber: 1) la capa de entrada, que está hecha de puertas SÍ (tampón) y NO y convierte los productos químicos de entrada en moléculas de cableado; 2) la capa interna, que consiste en tantas TU como cláusulas hay en la fórmula booleana correspondiente. Si el circuito está diseñado de acuerdo con la fórmula SOP, cada cláusula en la capa interna producirá la salida del circuito (por ejemplo, fluorescencia) en una llamada arquitectura de salida distribuida. Si se utiliza la fórmula del producto de suma (POS), entonces se requiere una capa final 3), que contendrá una sola puerta multiplicativa que recoge las moléculas de cableado de la capa interna.
En general, en biología sintética, se pueden diseñar muchos esquemas diferentes para el mismo circuito. Difieren en el número y el tipo de TU y moléculas de cableado. Para elegir la solución más fácil de implementar en celdas de levadura, cada diseño de circuito se asocia con una puntuación de complejidad S, definida como
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64539/64539eq01.jpg" style="margin: auto;">
donde A representa el número de activadores, R representa el número de represores y a es la cantidad de moléculas de ARN antisentido. Si los activadores o represores están ausentes del circuito, su contribución a S es cero. Por lo tanto, es más difícil realizar un esquema de circuito en el laboratorio (S alta) cuando requiere un alto número de factores de transcripción ortogonales. Esto significa que los nuevos activadores y represores deben diseñarse de novo para realizar el cableado completo dentro de los circuitos digitales. En principio, las nuevas proteínas de unión al ADN se pueden ensamblar utilizando las proteínas Zinc Finger3 y los efectores TAL4 como plantillas. Sin embargo, esta opción parece demasiado ardua y lenta; por lo tanto, uno debe confiar principalmente en pequeños ARN y regulación de traducción para finalizar circuitos genéticos complejos.
Originalmente, este método fue desarrollado para fabricar circuitos digitales en bacterias. De hecho, en las células eucariotas, en lugar de ARN antisentido, es más adecuado hablar de microARN (miARN) o pequeños ARN interferentes (siRNAs)5. Sin embargo, la vía del ARNi no está presente en la levadura S. cerevisiae. Por lo tanto, uno debe optar por redes completamente transcripcionales. Supongamos que un circuito necesita cinco activadores y cinco represores; su puntuación de complejidad sería S = 32. La complejidad del circuito puede reducirse reemplazando los 10 factores de transcripción con un solo dCas96 (Cas9 deficiente en nucleasa) fusionado a un dominio de activación (AD). Como se muestra en7, dCas9-AD funciona como un represor en la levadura cuando se une a un promotor entre la caja TATA y el TSS (sitio de inicio de la transcripción) y como un activador cuando se une bien aguas arriba de la caja TATA. Por lo tanto, se pueden reemplazar 10 factores de transcripción con una sola proteína de fusión dCas9-AD y 10 sgRNAs (ARN guía únicos) para una puntuación de complejidad total de S = 11. Es rápido y fácil sintetizar diez sgRNAs, mientras que, como se comentó anteriormente, el ensamblaje de 10 proteínas exigiría un trabajo mucho más largo y complicado.
Alternativamente, se podrían usar dos proteínas dCas ortogonales (por ejemplo, dCas9 y dCas12a): una para fusionarse con un AD y la otra desnuda o en combinación con un dominio de represión. La puntuación de complejidad aumentaría en una sola unidad (S = 12). Por lo tanto, los sistemas CRISPR-dCas son la clave para la construcción de circuitos digitales de genes muy intrincados en S. cerevisiae.
Este documento caracteriza profundamente la eficiencia de los represores y activadores basados en dCas9 y dCas12a en levadura. Los resultados muestran que no demandan una gran cantidad de sgRNA para optimizar su actividad, por lo que los plásmidos episomales se evitan preferentemente. Además, los activadores basados en dCas9 son mucho más efectivos cuando se usa un ARN de andamio (scRNA) que recluta copias del VP64 AD. Por el contrario, dCas12a funciona bien cuando se fusiona directamente con el fuerte VPR AD. Además, un promotor activado sintético exige un número variable de sitios diana, dependiendo de la configuración del activador (por ejemplo, tres cuando se utiliza dCas12a-VPR, seis para dCas9-VP64 y solo uno con dCas9 y un scRNA). Como represor, dCas12a parece más incisivo cuando se une a la región codificante que al promotor.
Sin embargo, como inconveniente, CRISPR-dCas9 / dCas12a no interactúan directamente con los productos químicos. Por lo tanto, es posible que no sean útiles en la capa de entrada. Por esta razón, se han investigado diseños alternativos de puertas booleanas que contienen proteínas anti-CRISPR (Acrs). Acrs actúan sobre las proteínas (d)Cas e inhiben su funcionamiento8. Por lo tanto, son un medio para modular la actividad de los sistemas CRISPR-(d)Cas. Este artículo analiza a fondo las interacciones entre Acrs tipo II y (d)Cas9, así como Acrs tipo V y (d)Cas12a en S. cerevisiae. Dado que los Acr son mucho más pequeños que las proteínas Cas, se construyó una puerta NOT que responde al estrógeno β-estradiol fusionando el dominio de unión hormonal del receptor de estrógeno humano9-HBD (hER) con AcrIIA4. Además, se realizaron un puñado de puertas SÍ y NO que expresaban dCas12a (-AD) constitutivamente y AcrVA en la inducción con galactosa. En la actualidad, estas puertas sirven solo como prueba de concepto. Sin embargo, también representan el primer paso hacia un replanteamiento profundo del algoritmo para llevar a cabo el diseño automático computacional de circuitos digitales de genes sintéticos en células de levadura.

<table><tbody><tr><td>Tubos de PCR de 8 tiras de 0,1 mL</td><td>NEST</td><td>403112</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de PCR de 0,2 mL</td><td>Axygen</td><td>PCR-02-C</td><td></td></tr><tr><td>Microtubos de 1,5 mL</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 15 mL&nbsp;</td><td>BIOFIL</td><td>CFT011150</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Microtubos</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 50 mL&nbsp;</td><td>BIOFIL</td><td>CFT011500</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa-grado de biología molecular</td><td>Invitrogen</td><td>75510-019</td><td></td></tr><tr><td>Sal sódica de ampicilina</td><td>Solarbio</td><td>69-52-3</td><td></td></tr><tr><td>Biosystems aplicado: veriti termociclador de 96 pocillos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4375786</td><td></td></tr><tr><td>AxyPrep Kit de extracción de gel de ADN</td><td>Axygen</td><td>AP-GX-250</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSuite CS& amperio; Perlas de investigación T</td><td>BD</td><td>650621</td><td>Perlas fluorescentes</td></tr><tr><td>BD FACSCitómetro de flujo de Verse&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td> BD <td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Sorvall ST 16R</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004380</td><td></td></tr><tr><td>E. coli células competentes (cepa DH5&alpha;)</td><td>Life Technologies</td><td>18263-012</td><td></td></tr><tr><td>ECL seleccionar reactivo de detección de Western Blotting</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2235</td><td></td></tr><tr><td>Aparato de electroforesis</td><td>Beijing JUNYI Electroforesis Co., Ltd</td><td>JY300C</td><td></td></tr><tr><td>Tapas planas de 8 tiras</td><td>NEST</td><td>406012</td><td></td></tr><tr><td>Empresa de síntesis génica</td><td>Azenta Life Sciences</td><td></td><td>https://web.azenta.com/zh-cn/azenta-life-sciences</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario adsorbido cruzado anti-IgG (H+L) anti-ratón de cabra Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A-11004</td><td></td></tr><tr><td>HiFiScript Kit de síntesis de ADNc</td><td>CWBIO</td><td>CW2569M</td><td>Kit utilizado en el paso 6.2.2.1</td></tr><tr><td>Solución de lisado (Zymoliasa)</td><td>zymoresearch</td><td>E1004-A</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia Nikon Eclipse 80i</td><td>Nikon</td><td>- </td><td>Microscopio de fluorescencia</td></tr><tr><td>Puntas de pipeta&mdash; 10 &mu; L</td><td>Axygen</td><td>T-300-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta&mdash; 1000 &mu; L</td><td>Axygen</td><td>T-1000-B-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta&mdash; 200 &mu; L</td><td>Axygen</td><td>T-200-Y-R-S</td><td></td></tr><tr><td>pRSII403</td><td>Addgene</td><td>35436</td><td></td></tr><tr><td>pRSII404</td><td>Addgene</td><td>35438</td><td></td></tr><tr><td>pRSII405</td><td>Addgene</td><td>35440</td><td></td></tr><tr><td>pRSII406</td><td>Addgene</td><td>35442</td><td></td></tr><tr><td>pRSII424</td><td>Addgene</td><td>35466</td><td></td></tr><tr><td>pTPGI_dSpCas9_VP64&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>49013</td><td></td></tr><tr><td>Q5 ADNomerasa de alta fidelidad</td><td>New England Biolabs</td><td>M0491</td><td></td></tr><tr><td>Enzima de restricción-Acc65I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0599</td><td></td></tr><tr><td>Enzima de restricción-BamHI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136</td><td></td></tr><tr><td>Enzima de restricción-SacI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3156</td><td></td></tr><tr><td>Enzima de restricción-XhoI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146</td><td></td></tr><tr><td>Roche LightCycler 96&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Roche-Real-Time PCR Instrument</td></tr><tr><td>S. cerevisiae CEN. PK2-1C</td><td>:</td><td></td> <td>la cepa principal. El genotipo es: MATa; his3D1; leu2-3_112; URA3-52; TRP1-289; MAL2-8c; Kit</td></tr><tr><td>de bucle de vástago</td> SUC2 <td>SparkJade</td><td>AG0502</td><td>Kit utilizado en el paso 6.2.1.3</td></tr><tr><td>Termociclador T100</td><td>BIO-RAD</td><td>186-1096</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN ligasa</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>T5 Exonucleasa</td><td>New England Biolabs</td><td>M0363</td><td></td></tr><tr><td>Taq ADN ligasa</td><td>New England Biolabs</td><td>M0208</td><td></td></tr><tr><td>Taq ADN polimerasa</td><td>New England Biolabs</td><td>M0495</td><td></td></tr><tr><td>TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(2x) (SYBR Green I dye)</td><td>Takara</td><td>RR820Q</td><td></td></tr><tr><td>YeaStar RNA kit</td><td>Zymo Research</td><td>R1002</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8875</td><td></td></tr></tbody></table>

circuitos digitales genéticos basados en sistemas crispr-cas y proteínas anti-crispr

Gene Digital Circuits Based on CRISPR-Cas Systems and Anti-CRISPR Proteins

Las puertas booleanas de genes sintéticos y los circuitos digitales tienen una amplia gama de aplicaciones, desde el diagnóstico médico hasta el cuidado del medio ambiente. El descubrimiento de los sistemas CRISPR-Cas y sus inhibidores naturales, las proteínas anti-CRISPR (Acrs), proporciona una nueva herramienta para diseñar e implementar circuitos digitales de genes in vivo . Aquí, describimos un protocolo que sigue la idea del ciclo de ingeniería biológica "Diseñar-Construir-Probar-Aprender" y hace uso de dCas9/dCas12a junto con sus correspondientes Acrs para establecer pequeñas redes transcripcionales, algunas de las cuales se comportan como puertas booleanas, en Saccharomyces cerevisiae. Estos resultados señalan las propiedades de dCas9/dCas12a como factores de transcripción. En particular, para lograr la activación máxima de la expresión génica, dSpCas9 necesita interactuar con un ARN de andamio diseñado que recolecta múltiples copias del dominio de activación VP64 (AD). Por el contrario, dCas12a se fusionará, en el extremo C, con el fuerte VP64-p65-Rta (VPR) AD. Además, la actividad de ambas proteínas Cas no se ve reforzada por el aumento de la cantidad de sgRNA/crRNA en la célula. Este artículo también explica cómo construir puertas booleanas basadas en la interacción CRISPR-dCas-Acr. El dominio de unión a hormonas fusionado AcrIIA4 del receptor de estrógeno humano es el núcleo de una puerta NOT que responde al β-estradiol, mientras que los AcrVA sintetizados por el promotor GAL1 inducible permiten imitar las puertas SÍ y NO con galactosa como entrada. En estos últimos circuitos, AcrVA5, junto con dLbCas12a, mostró el mejor comportamiento lógico.

Expresión de sgRNA/crRNA por un promotor de tipo ARN polimerasa III Primero, este trabajo abordó la ingeniería del circuito de activación transcripcional (circuito 1) que se muestra en la Figura 1A. Contenía tres componentes básicos: 1) el gen que codifica para yEGFP (el informador), que fue precedido por una serie de diferentes promotores sintéticos que proporcionaron sitios objetivo para dCas9 / dCas12a-AD; 2) una versión optimizada para codones de levadura de dCas9 o d...

Los sistemas CRISPR-Cas y las proteínas anti-CRISPR se integraron en el esquema de puertas booleanas en Saccharomyces cerevisiae. Los nuevos circuitos lógicos pequeños mostraron un buen rendimiento y profundizaron la comprensión de los factores de transcripción basados en dCas9 / dCas12a y las propiedades de las proteínas anti-CRISPR.

Circuitos digitales genéticos basados en sistemas CRISPR-Cas y proteínas anti-CRISPR

Synthetic gene Boolean gates and digital circuits have a broad range of applications, from medical diagnostics to environmental care. The discovery of the ...

Nuestro protocolo explica cómo diseñar, construir y analizar circuitos digitales de genes de levadura que utilizan sistemas CRISPR dCas tipo dos y tipo cinco y las proteínas anti-CRISPR correspondientes. Es una suspensión de ensamblaje porque reúne cero procedimientos estándar para ensamblar y probar redes transcripcionales sintéticas en servicios. Para comenzar, prepare una mezcla de reacción que contenga de 20 a 40 nanogramos de plantilla de ADN, un microlitro de imprimación directa, un microlitro de cebador inverso, cinco microlitros de mezcla de DNTP, 0.5 microlitros de ADN polimerasa, 10 microlitros de tampón de reacción de ADN polimerasa 5x y agua destilada doble hasta un volumen total de 50 microlitros.Amplíe las secuencias de ADN utilizando el programa de PCR de toma de contacto en un termociclador como se describe en el manuscrito. Aislar los productos de PCR mediante electroforesis en gel y diluir las secuencias de ADN del gel de agarosa a través de un kit de extracción de gel de ADN. Usando el método de ensamblaje de Gibson, inserte los productos de PCR purificados en el vector lanzadera abierto de corte dejando entrar la mezcla de ADN equimolar a 50 grados centígrados durante una hora.Construya el vector aceptor dCas12a mediante PCR de toma de contacto y el método de ensamblaje de Gibson como se demostró anteriormente. Inserte las proteínas dCas12a optimizadas para codones de levadura en los dos vectores aceptores recién construidos mediante digestión con BamH1 y Xhol1 y ligadura con ADN ligasa T4. Del mismo modo, construya los plásmidos basados en el vector lanzadera pRS2403 para expresar las proteínas anti-CRISPR a través de PCR de contacto y el método de ensamblaje de Gibson.Para realizar la detección de células de microscopía, coloque dos microlitros de la solución celular en un portaobjetos de vidrio y cúbralo con un cubreobjetos. Observe las células bajo un microscopio de fluorescencia encendiendo la fuente de luz fluorescente, el microscopio y la computadora. Después de anotar el número de fuente de luz fluorescente, abra el software del microscopio en la computadora.Coloque la diapositiva en el escenario del microscopio y elija la lente del objetivo 40x mientras observa las células bajo la luz verde. Mueva la perilla de enfoque del curso hasta que aparezca el contorno de las células de levadura y la perilla de enfoque fino para enfocar las células. Para detectar las células, después de cerrar el campo de visión del microscopio, cambie a la pantalla de la computadora y haga clic en vivo.Espere de tres a cinco segundos. Haga clic en capturar para tomar una foto y guardar la imagen. A continuación, apague la computadora, el microscopio y la fuente de luz fluorescente.Encienda la máquina FACS 20 minutos antes de las mediciones para calentar el láser y mezcle 20 microlitros del cultivo celular con 300 microlitros de agua destilada doble. Ejecute el software FACS en el ordenador conectado a la máquina FACS y cree un nuevo experimento. A continuación, establezca los parámetros de medición.A continuación, seleccione el filtro de acuerdo con las longitudes de onda de excitación y emisión de las muestras y establezca el número de celda de adquisición en 10, 000. Ajuste el voltaje del filtro FITC midiendo la intensidad de las perlas fluorescentes, asegurándose de que la diferencia relativa en la intensidad de las perlas entre dos experimentos consecutivos no exceda el 5%Lave la máquina con agua destilada doble durante unos segundos para eliminar cualquier posible exceso de perlas. Mida la intensidad de fluorescencia de la muestra y haga clic en la vista previa mientras espera de tres a cinco segundos para la estabilidad de la inyección de la muestra.Finalmente haga clic en adquirir. Mide las cuentas de nuevo al final del experimento. Después de comprobar si la diferencia relativa entre las dos medidas de perlas supera el 5%Exporte los datos FACS como archivos FCS.Abra R studio y cargue el script BDverse_analysis. R para analizar los archivos FCS. Establezca el nombre del experimento como ename, la ruta del directorio donde se almacenan los archivos FCS como dir_d y los archivos de resultados se crearán como dir_r.A continuación, configure el canal de fluorescencia. Establezca el número de muestras que se midieron. Las dimensiones de los diagramas de puntos y la longitud máxima de los ejes x e y para gráficos de barras y diagramas de caja.Elija el método de calificación eliminando el hashtag de las líneas correspondientes. Seleccione el objeto flowSet gated correspondiente al método de compuerta elegido y la resolución del diagrama de puntos, que debe ser al menos igual a 256. Descomente las dos instrucciones de filtrado para eliminar las mediciones donde la fluorescencia es negativa y para eliminar los valores atípicos debidos a otros experimentos como se describe en el manuscrito.Presione source y ejecute el script. Todos los archivos que contienen los resultados del análisis se crean en dir_r. La mejor eficiencia de activación de dSpCas9-VP64 se logró cuando había seis sitios de destino lexOp en el promotor sintético.Mientras que para dCas12a-VPR mayor eficiencia de activación cuando se insertaron tres copias de lexOp en el promotor sintético. La activación por ARN CRISPR y ARN guía único localizado en un plásmido integrativo fue de 1,4 a 2,4, y de 1,1 a 1,5 veces mayor que cuando se colocó en un plásmido episomal. Los resultados de RT-qPCR mostraron que un vector episomal produjo un nivel mucho más alto de ARN guía única ARN CRISPR que el vector integrador, independientemente del sistema de expresión.Se probó la eficiencia de activación del complejo dSpCas9 y el ARN de andamio que recluta MCP-VP64. El ARN del andamio que contenía un solo tipo salvaje y una horquilla F6MS2 dio una activación de 5,27 y 4,3 veces respectivamente. Sin embargo, la combinación de las dos horquillas resultó en 7,54 veces con la mayor eficiencia de activación.Se utilizaron cuatro promotores diferentes para impulsar la expresión de tres tipos de anti CRISPR tipo dos, lo que demuestra que funcionaban de manera dependiente de la dosis. Un promotor fuerte redujo el nivel de fluorescencia a 0.21, 0.11 y 0.13 de su valor, respectivamente. La curva de valoración muestra que el circuito se comporta como una marcha de nudo con una relación de encendido a apagado cercana a 2.3.El tipo cinco anti-CRISPR A reduce la expresión de fluorescencia de denAS-Cas12a y dLB-Cas12a como activadores del 19% al 71%Se estudió la relación entre activadores y represores, donde el Acr-VA mostró grandes fluctuaciones en su rendimiento cuando fue producido por pGAL1 bajo pTEF1 y el CYC1t-pCYC1noTata tipo cinco anti-CRISPR-A1 mostró cierta represión en el dLB Cas12a desnudo solamente. La máquina FACS es frágil, por lo que debe manipularse con cuidado. La solución celular nunca debe ser demasiado densa y la máquina debe mantenerse limpia.

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Investigación

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Bioengineering

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