Name: Ingeniería de mutaciones de ganancia de función heterocigotas oncogénicas en células madre y progenitoras hematopoyéticas humanas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-10T14:50:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Aprende a modelar mutaciones heterocigotas de ganancia de función en células madre y progenitoras hematopoyéticas humanas usando CRISPR/Cas9 y rAAV. Este método permite estudiar la transformación leucémica con precisión.

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Este trabajo es apoyado por subvenciones del Fondo Austríaco para la Ciencia (FWF; número P32783 e I5021) a A.R. La Sociedad Austriaca de Medicina Interna (Joseph Skoda Fellowship), la Sociedad Austriaca de Hematología y Oncología (OeGHO; Beca de Investigación Clínica), y MEFOgraz. T.K. es miembro especial de la Sociedad de Leucemia y Linfoma.

Los autores no tienen nada que revelar.

La manipulación genética eficiente y precisa de las HSPC primarias humanas representa una gran oportunidad para explorar y comprender los procesos que influyen en la hematopoyesis normal y, lo que es más importante, en la transformación leucémica de las células hematopoyéticas.
En este protocolo, se describió una estrategia eficiente para diseñar HSPC humanas para expresar mutaciones GOF heterocigotas recurrentes. Este procedimiento aprovechó la tecnología CRISPR / Cas9 y los vectores rAAV6 como donantes para plantillas de ADN para insertar con precisión secuencias de ADN WT y mutantes en sus loci genéticos endógenos. El acoplamiento de los ADNc diseñados (WT y mutante) con proteínas reporteras fluorescentes separadas permite el enriquecimiento y el seguimiento de células con un estado heterocigoto definitivo.
Esta estrategia presenta varias ventajas en comparación con los métodos basados en lentivirus (VI) utilizados con frecuencia. Una ventaja principal es que el sistema basado en CRISPR / Cas9 permite una edición precisa en los loci endógenos, lo que resulta en la preservación de los promotores endógenos y los elementos reguladores. Esto conduce a la homogeneidad en la expresión del gen editado en las células, un objetivo difícilmente alcanzable cuando se utiliza un método basado en VI. La transferencia génica con vectores del VI conduce a la integración semialeatoria del gen con preferencia por sitios transcripcionalmente activos34. Esto puede traducirse en la sobreexpresión del gen transferido y la heterogeneidad entre las células editadas, lo que eventualmente resulta en dificultades para investigar y analizar el papel de las mutaciones y las interacciones génicas. Una segunda ventaja es que el sistema descrito, al ser un sistema de edición específico del sitio, elimina los riesgos de mutagénesis insercional35.
La estrategia del reportero fluorescente dual permite el enriquecimiento preciso y el seguimiento de las células que se editaron con éxito en ambos alelos, con un alelo que integra el ADNc WT y el otro alelo que integra las secuencias de ADNc mutadas. Las celdas que solo expresan un solo reportero representan solo la integración monoalélica o la integración bialélica de plantillas HDR con el mismo reportero fluorescente. Ambos escenarios solo pueden distinguirse con precisión si se producen clones derivados de células individuales y se analizan individualmente. Sin embargo, las HSPC solo tienen una capacidad proliferativa limitada in vitro, y cuando se mantienen en cultivo durante largos períodos de tiempo, las HSPC comienzan a diferenciarse en progenie más madura y pierden su capacidad de autorrenovación e injerto. Esto hace que la selección y expansión de clones unicelulares que albergan la mutación heterocigótica deseada sea inviable. La aplicación de la estrategia de proteína fluorescente dual y el enriquecimiento por citometría de flujo para células portadoras de la mutación heterocigota permite evitar los problemas inducidos por el cultivo in vitro extendido.
En este ejemplo específico, se demostró con éxito que las HSPC podrían diseñarse y clasificarse de manera eficiente para obtener poblaciones puras de HSPC portadoras de la mutación heterocigótica CALRDEL/WT.
Sin embargo, este sistema no se limita a la ingeniería de mutaciones heterocigotas de cambio de marco, sino que también se puede adoptar fácilmente para crear otros tipos de mutaciones, incluidas las mutaciones sin sentido y sin sentido. Mediante la aplicación de diferentes combinaciones de AAVs que contienen WT o secuencias mutadas con diferentes proteínas reporteras fluorescentes, este sistema también se puede utilizar para la introducción de mutaciones homocigotas (transducción simultánea con dos rAAVs ambos portadores de ADNc mutante pero diferentes reporteros fluorescentes) o incluso la corrección de mutaciones (transducción simultánea con dos AAVs ambos portadores de ADNc WT pero diferentes reporteros fluorescentes). Además, es importante mencionar que esta estrategia no se limita a la introducción de mutaciones oncogénicas de GOF. De hecho, el protocolo descrito se puede utilizar para múltiples estrategias alternativas, incluyendo la eliminación de genes, el reemplazo de genes 36,37, el knock-in dirigido de transgenes (es decir, receptores de antígenos quiméricos)38, e incluso para la corrección de mutaciones causantes de enfermedades11,39.
La estrategia de combinar CRISPR/Cas9 y AAV6 con múltiples reporteros fluorescentes también ha demostrado ser aplicable en muchos otros tipos de células, incluidas las células T, las células dendríticas plasmocitoides, las células madre pluripotentes inducidas, las células madre neuronales y las células madre de las vías respiratorias 24,38,40,41,42,43,44 . Esta estrategia se puede implementar para la producción de células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) superiores. Por ejemplo, recientemente se publicó que la eliminación mediada por CRISPR/Cas9 del gen TGFBR2 en las células T con CAR aumenta en gran medida su función en el microambiente tumoral supresor rico en TGF-β45. Tal enfoque podría proporcionar un protocolo de un solo paso tanto para diseñar las células T para expresar el CAR como para eliminar el gen TGFBR2 por sitio insertando específicamente el CAR en ambos alelos del gen TGFBR2. Además, este enfoque también podría ser útil para generar células T CAR universales mediante la integración de la CAR en el gen de la constante alfa del receptor de células T (TRAC)46,47.
Para aumentar la reproducibilidad y garantizar una edición eficiente de las células, se deben tener en cuenta algunas consideraciones importantes. Los principales puntos críticos para garantizar la edición exitosa de las células residen en (i) la selección del sgRNA, (ii) el diseño de la plantilla HDR y (iii) la producción de rAAV6.
La selección de un sgRNA de buen rendimiento es crucial, ya que determinará el número máximo de alelos en los que se puede integrar la plantilla HDR. Debido a los numerosos programas que ahora están disponibles, la búsqueda de sgRNAs candidatos se ha simplificado. Al seleccionar la región de interés, el software puede proponer una serie de sgRNAs con una puntuación en el objetivo y una puntuación fuera del objetivo que indican las posibilidades de edición en el locus deseado y loci no deseados, respectivamente. Estas puntuaciones se calculan en base a modelos de puntuación publicados anteriormente48,49. Aunque este es un buen punto de partida para seleccionar un sgRNA de buen rendimiento, el rendimiento del sgRNA debe confirmarse ya que su rendimiento previsto in silico no siempre corresponde a un sgRNA eficiente in vitro. Por lo tanto, se recomienda encarecidamente diseñar y probar al menos tres sgRNAs para aumentar las posibilidades de encontrar el mejor sgRNA. Una vez que se ha identificado un verdadero sgRNA de buen rendimiento, se sugiere continuar con el diseño de la plantilla HDR.
Se deben tener en cuenta las precauciones al diseñar la plantilla HDR. Los brazos de homología izquierda y derecha (LHA y RHA, respectivamente) deben abarcar 400 pb aguas arriba y aguas abajo del sitio de corte de sgRNA, respectivamente, ya que las HA más cortas podrían resultar en frecuencias HDR reducidas. El tamaño del ADNc que se puede introducir a través de HDR depende de las capacidades de empaquetado de los AAV, que es de aproximadamente 4,7 kb. Debido a los numerosos elementos obligatorios dentro de la plantilla HDR (LHA, RHA, SA, PolyA, promotor y secuencia de reportero fluorescente), el espacio restante para el ADNc mutado o WT es limitado. Esto no es problemático si la mutación deseada se encuentra cerca del extremo 3' de un gen o en genes con un CDS corto general. Sin embargo, en los casos en que la mutación se localiza cerca del lado de inicio transcripcional (TSS) de los genes con un CDS largo (que excede el espacio de empaquetamiento restante del AAV), este enfoque descrito puede no ser factible. Para evitar este problema, Bak y sus colegas han desarrollado recientemente una estrategia que se basa en dividir la plantilla HDR en dos AAV. Esta estrategia se basa en dos integraciones separadas mediadas por HDR para obtener la integración final perfecta de un gen grande50.
La calidad del virus y su título son factores adicionales que pueden hacer o deshacer la ingeniería genómica exitosa de las células. Para un rendimiento óptimo, es importante no dejar que el HEK293T alcance la confluencia completa mientras se mantiene en cultivo. Idealmente, las células HEK293T deben dividirse cuando se alcanza una confluencia del 70% -80%. Además, el HEK293T no debe cultivarse durante largos períodos de tiempo, ya que esto puede disminuir su capacidad para producir virus. Las nuevas células HEK293T deben descongelarse después de 20 pasajes. La obtención de altos títulos de virus es importante para aumentar la eficiencia y la reproducibilidad de los experimentos. Los títulos virales bajos se traducirán en grandes volúmenes de solución de rAAV necesarios para la transducción de las HSPC. Como regla general, la solución de rAAV añadida a las células nucleofectadas no debe exceder el 20% del volumen total del medio de retención de HSPC. Los volúmenes más altos de solución AAV pueden conducir a una mayor muerte celular, menor proliferación y eficiencias de transducción deterioradas. En el caso de títulos bajos del virus, se recomienda, por lo tanto, concentrar aún más el virus.
En resumen, este protocolo ofrece un enfoque reproducible para manipular HSPC humanos de manera precisa y eficiente mediante el uso simultáneo de plantillas de donantes CRIPSR / Cas9 y rAAV6 con reporteros fluorescentes duales adicionales. Este enfoque ha demostrado ser una gran herramienta para estudiar la biología normal de las células madre hematopoyéticas y las contribuciones que las mutaciones hacen a la leucemogénesis.

Con el desarrollo de la tecnología de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR) / Cas9, se ha agregado un instrumento nuevo y extremadamente poderoso al conjunto de herramientas de los científicos. Esta tecnología permite la ingeniería precisa del genoma y ha demostrado ser extremadamente útil no sólo para fines de investigación (revisada en Hsu et al.1), sino que más recientemente también se ha traducido con éxito en el ámbito clínico 2,3,4. Las estrategias de edición de CRISPR/Cas9 se basan en la actividad de una proteína Cas9 y un ARN guía simple (sgRNA)5,6,7. En la célula huésped, la proteína Cas9 se guía a un sitio específico en el ADN que es complementario a la secuencia sgRNA e introducirá una ruptura de doble cadena de ADN (DSB). Una vez que se genera un DSB, hay dos mecanismos de reparación principales y competitivos que pueden ocurrir: la unión final no homóloga (NHEJ) y la reparación dirigida por homología (HDR). NHEJ es un mecanismo de reparación propenso a errores, predominantemente utilizado que conduce a inserciones y deleciones (indels), mientras que HDR, al usar la cromátida hermana como plantilla de reparación, es muy preciso pero limitado a la fase S o G2 del ciclo celular8. En ingeniería genómica, HDR se puede utilizar para la modificación específica del ADN al proporcionar una plantilla de donante que está flanqueada por brazos de homología idénticos a ambos extremos de ADN del DSB inducido por Cas9 (Figura 1). El tipo de plantilla de donante que se utiliza para HDR puede tener un gran impacto en la eficiencia de edición. Para la ingeniería genética en HSPC humanas, el virus adenoasociado serotipo 6 (AAV6) ha sido descrito recientemente como un excelente vehículo para la entrega de plantillas de ADN monocatenario 9,10.
La ingeniería del genoma CRISPR/Cas9 se puede emplear terapéuticamente para corregir mutaciones perjudiciales11, pero también se puede utilizar para introducir mutaciones patogénicas en el ADN para modelar el desarrollo del cáncer12. El cáncer de la sangre, como la leucemia, se desarrolla a través de la adquisición secuencial de mutaciones somáticas en HSPC sanas13,14. Los eventos genéticos tempranos conducen a una ventaja proliferativa clonal, resultando en hematopoyesis clonal de potencial indeterminado (CHIP)15,16. La adquisición adicional de mutaciones eventualmente conducirá a la transformación leucémica y al desarrollo de la enfermedad. Las mutaciones somáticas se pueden encontrar en genes que controlan la autorrenovación, supervivencia, proliferación y diferenciación17.
La introducción de mutaciones individuales a través de la ingeniería genómica en HSPC saludables permite modelar con precisión este proceso leucemogénico paso a paso. El número limitado de mutaciones recurrentes encontradas en neoplasias mieloides como la leucemia mieloide aguda (LMA)18,19 hace que esta enfermedad sea particularmente susceptible de ser recapitulada utilizando herramientas de ingeniería genómica.
Las mutaciones somáticas pueden surgir en un solo alelo (mutaciones monoalélicas/heterocigotas) o en ambos alelos (mutaciones bialélicas/homocigotas) y pueden tener efectos profundos en la función del gen, lo que podría causar una pérdida de función (LOF) o una ganancia de función (GOF). Las mutaciones LOF conducen a un LOF reducido (si un alelo está afectado) o completo (si ambos alelos están afectados) del gen, mientras que las mutaciones GOF conducen a una mayor activación o función nueva del gen. Las mutaciones GOF son típicamente heterocigotas20.
Es importante destacar que la cigosidad (hetero vs. homocigotos) tiene implicaciones importantes para el intento de modelar fielmente una mutación; por lo tanto, la manipulación dirigida de un solo alelo de un gen es necesaria para diseñar mutaciones GOF heterocigotas en hotspots. La NHEJ propensa a errores conduce a indeles de diferentes longitudes21 que pueden conducir a consecuencias biológicas variables e impredecibles. Sin embargo, dado que NHEJ es el programa de reparación predominante empleado por las células después de la introducción de un DSB, la mayoría de las plataformas CRISPR/Cas9 utilizadas actualmente para manipular HSPCs no permiten predecir con precisión el resultado genético22,23. En contraste, la introducción de una rotura de doble cadena mediada por CRISPR/Cas9 (DSB), combinada con el uso de plantillas de donantes de ADN basadas en vectores de virus adenoasociados recombinantes (rAAV) para la ingeniería del genoma a través de HDR, permite la inserción de mutaciones específicas de alelos en HSPC humanas11,24. La integración simultánea de una secuencia mutante y una secuencia de tipo salvaje (WT) junto con distintos reporteros fluorescentes en los alelos individuales se puede realizar para seleccionar un genotipo heterocigoto (Figura 2). Esta estrategia se puede aprovechar como una herramienta poderosa para caracterizar con precisión los efectos de las mutaciones recurrentes, leucémicas y heterocigotas del punto caliente GOF sobre la función de HSPC, el inicio de la enfermedad y la progresión.
En este artículo, se proporciona un protocolo detallado para la ingeniería eficiente de mutaciones GOF heterocigotas mutadas recurrentemente en HSPC humanas primarias. Esta estrategia combina el uso de CRISPR/Cas9 y una transducción dual AAV6 para proporcionar plantillas de donantes de ADN mutante y WT para la generación prospectiva de la mutación GOF heterocigótica. Como ejemplo, se mostrará la ingeniería de las mutaciones recurrentes de tipo 1 (deleción de 52 pb) en el gen de la calreticulina (CALR) 25. La mutación heterocigótica GOF en el exón 9 de la CALR se encuentra recurrentemente en trastornos mieloproliferativos como la trombocitemia esencial (TE) y la mielofibrosis primaria (FMP)26. CALR es una proteína residente en retículo endoplásmico que tiene principalmente una función de control de calidad en el proceso de plegamiento de proteínas recién sintetizadas. Su estructura se puede dividir en tres dominios principales: un dominio amino (N)-terminal y un dominio P rico en prolina, que están involucrados en la función chaperona de la proteína, y un dominio C, que está involucrado en el almacenamiento y regulación del calcio27,28. Las mutaciones CALR causan un desplazamiento de marco +1, lo que lleva a la transcripción de un nuevo extremo C-terminal extendido y la pérdida de la señal de retención del retículo endoplásmico (ER) (KDEL). Se ha demostrado que la CALR mutante se une al receptor de trombopoyetina (TPO), lo que lleva a la señalización independiente de TPO con aumento de la proliferación29.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64558/64558fig01v2.jpg"> Figura 1: Reparación de NHEJ y HDR. Representación esquemática simplificada de los mecanismos de reparación NHEJ y HDR tras la introducción de una ruptura de doble cadena en el ADN. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64558/64558fig01largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64558/64558fig02.jpg"> Figura 2: Descripción esquemática de la estrategia de edición HDR bialélica. Representación esquemática que muestra la integración de las plantillas de donantes en los alelos objetivo seguida de su traducción en ARNm funcionales. Los cuadros punteados de color naranja indican las regiones correspondientes al brazo de homología izquierdo (LHA) y al brazo de homología derecho (RHA). El tamaño ideal de las HA es de 400 pb cada una. El cuadro punteado verde representa la región correspondiente a la secuencia SA. El tamaño del SA es de 150 pb. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64558/64558fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Matraz de cultivo celular de 175 cm2, tapón de ventilación, tratado con TC</td><td>Corning</td><td>431080</td><td></td></tr><tr><td>platos de 150 mm x 25 mm</td><td>Corning</td><td>430599</td><td></td></tr><tr><td>293T</td><td>DSMZ</td><td>ACC 635</td><td>https://www.dsmz.de/collection/catalogue/details/culture/ACC-635</td></tr><tr><td>4D Nucleofector Core Unit</td><td>Lonza-Para</td><td></td> <td>la nucleofección de HSPCs humanas, utilice el programa DZ-100.</td></tr><tr><td>4D Nucleofector X Unidad</td><td>Lonza-500</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ml Tubo de centrífuga</td><td>Corning</td><td>431123</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>AAVpro Kit de purificación</td><td>Takara</td><td>6666</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. Cas9 Nucleasa V3</td><td>Tecnologías de ADN integradas (IDT)</td><td>1081058</td><td></td></tr><tr><td>Avanti JXN-30 Ultracentrífuga</td><td>Beckman Herramienta</td><td></td> de diseño de sgRNA de Coulter-Benchling <td></td></tr><tr><td></td><td>Herramienta en línea para el diseño de sgRNA: http://www.benchling.com/crispr</td>Albúmina sérica bovina (BSA)Sigma-Aldrich A7906-100G C1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad-Synthetic sgRNA químicamente modificado Synthego <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Sitio web: https://www.synthego.com/products/crispr-kits/synthetic-sgrna Secuencia para el intrón 7 dirigido al sgRNA de CALR: 5'-CGCCTGTAATCCTCGCCCAG-3' &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Se agrega un andamio SpCas9 de 80 nucleótidos a la secuencia de ARN de 20 nucleótidos para completar el sgRNA. Las modificaciones químicas de 2'-O-Metilo se agregan a la primera y última 3 bases y se agregan enlaces de fosforotiato 3' en las primeras 3 y últimas 2 bases. &nbsp; &nbsp; &nbsp; *Alternativamente, los sgRNAs sintéticos modificados químicamente pueden adquirirse de IDT (https://eu.idtdna.com/site/order/oligoentry/index/crispr) y Trilink (https://www.trilinkbiotech.com/custom-oligos)</td></tr><tr>Herramienta <td></td><td></td> de <td>diseño de sgRNAs CHOPCHOP</td><td>Herramienta en línea para el diseño de sgRNA: http://chopchop.cbu.uib.no</td></tr><tr><td>Costar 24-well Placas transparentes de pocillos múltiples tratadas con TC</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>CRISPick Herramienta de diseño de sgRNA</td><td></td><td></td><td>Herramienta en línea para el diseño de sgRNA: https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public</td></tr><tr>Herramienta <td></td><td></td> de<td>diseño de sgRNA CRISPOR</td><td>Herramienta en línea para el diseño de sgRNA:</td></tr><tr><td>http://crispor.tefor.net ddPCR Placas de 96 pocillos</td><td>Bio-Rad</td><td>12001925</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Supermix para sondas (sin dUTP)</td><td>Cartuchos Bio-Rad</td><td>1863024</td><td></td></tr><tr><td>DG8 para el generador de gotas QX200/QX100&nbsp;</td><td>Juntas Bio-Rad</td><td>1864008</td><td></td></tr><tr><td>DG8 para generador de gotas QX200/QX100&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1863009</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>Aceite de generación de gotas para sondas</td><td>Bio-Rad</td><td>1863005</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Medio Eagle Modificado (DMEM) con alta glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato (DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria Fusion</td><td>BD Biosciences-Falcon</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>5 mL</td><td>Corning</td><td>de</td> fondo redondo 352054 <td></td></tr><tr><td>suero fetal bovino (FBS) Good Forte (inactivado por calor), 500 ml</td><td>Pan Biotech</td><td>P40-47500</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 10.8.0</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>GenAgarose L.E.</td><td>Inno-train</td><td>GX04090</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0321</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>New England Biolabs Inc. (NEB)</td><td>E2611L</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>solución HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ICE</td><td>Synthego</td><td></td><td>https://ice.synthego.com</td></tr><tr><td>Herramienta de optimización de codones IDT</td><td>https://www.idtdna.com/pages/tools/codon-optimization-tool</td><td>IDT</td><td></td></tr><tr>Herramienta <td></td><td></td> de<td>diseño de sgRNA</td><td>IDT Herramienta en línea para el diseño de sgRNA:</td></tr><tr><td>https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_CUSTOM Caldo LB (Lennox) EZMix en polvo medio de crecimiento microbiano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7658-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Caldo LB con agar (Lennox) EZMix en polvo medio de crecimiento microbiano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7533-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Midori Green Advance</td><td>Nippon Genetics</td><td>MG04</td><td></td></tr><tr><td>Kit de minipreparación de plásmido Monarch</td><td>NEB</td><td>T1010L</td><td></td></tr><tr><td>Kit de extracción de gel de ADN Monarch</td><td>NEB</td><td>T1020L</td><td></td></tr><tr><td>NEB 5-alfa E. coli competente (alta eficiencia)</td><td>NEB</td><td>C2987U</td><td></td></tr><tr><td>Agua sin nucleasas, 5X100 ml</td><td>Ambion</td><td>AM9939</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Midi</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740410</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM, Medio Sérico Reducido, 500 ml</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>P3 Primary Cell 4D-Nucleofetor&nbsp; X Kit L</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3024</td><td>La solución Lonza Primary P3 se suministra como una solución de 2,25 mL de nucleofactor de célula primaria P3 y un suplemento de 0,5 mL 1. Para reconstituir, agregue el Suplemento 1 a la Solución Nucleofectora de Células Primarias P3 y mezcle.</td></tr><tr><td>pAAV-MCS2</td><td>Addgene</td><td>46954</td><td></td></tr><tr><td>Placa PCR Lámina de sellado térmico, perforable</td><td>Bio-Rad</td><td>1814040</td><td></td></tr><tr><td>pDGM6</td><td>Addgene</td><td>110660</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (P/S)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenina (PEI)</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td>Agregue 50 mL de PBS 4.5 pH (hecho con HCl) a 50 mg de PEI en un tubo. Disuelva colocando el tubo en un recipiente de 70 grados; C Baño de agua y vórtice cada 10 minutos hasta que la solución se disuelva. Una vez que la solución haya alcanzado RT, filtre la esterilización a través de un 0.22 &mu; Filtro M, marca 1120 &mu; L alícuotas, y almacenar a -80°C.</td></tr><tr><td>Tubo de ensayo de poliestireno, con imprimaciones de tapa</td><td></td><td></td><td></td>a presión</tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Los Eurofins-Primers</td><td></td> <td>se encargaron a Eurofins (eurofinsgenomics.eu) como oligonucleótidos personalizados sin sal sin modificar. Los cebadores se diseñaron mediante el uso de PRIMER-Blast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Imprimación 1 Fwd:&nbsp; &nbsp; &nbsp; AAGTGATCCGTTCGCCATGAC; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Primer 2 Rev CALR WT específico: ACGTCCTCTTCCTCTCTCTC; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Primer 2 Rev CALR DEL específico: CCAACCCTGGAGACACGCTTC</td></tr><tr><td>PrimeTime qPCR Primer Assay</td><td>IDT-PrimeTime</td><td></td> <td>qPCR Probe Assays (1 sonda/2 cebadores)&nbsp; que se pueden pedir a IDT (https://eu.idtdna.com/site/order/qpcr/assayentry). Escala: Std - ensayo qPCR 500 reacciones; Primer 1 delantero (5'-3') : GGAACCCCTAGTGATGGAGTT; Imprimación 2 Reverso (5'-3'): CGGCCTCAGTGAGCGA; Sonda (5'-3'): CACTCCCTCTCTGCGGCGGCGG; 5' Tinte/3' Quencher: FAM/ZEN/IBFQ; Relación cebador/sonda: 3.6</td></tr><tr><td>PX1 PCR Sellador</td><td>de placas Bio-Rad</td><td>1814000</td><td></td></tr><tr><td>QuantaSoft Software</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución de extracción rápida de ADN Lucigen</td><td></td><td>QE0905T</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Generador de gotas&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1864002</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Lector de gotas</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ligando Flt3 humano recombinante</td><td>Peprotech</td><td>300-19</td><td></td></tr><tr><td>Humano recombinante IL-6</td><td>Peprotech</td><td>200-06</td><td></td></tr><tr><td>SCF humano recombinante</td><td>Peprotech</td><td>300-07</td><td></td></tr><tr><td>TPO humano recombinante</td><td>Peprotech</td><td>300-18</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>SnapGene</td><td>Dotmatics Software de</td><td></td><td>clonación molecular https://www.snapgene.com *Alternativamente, también se pueden utilizar Benchling (https://www.benchling.com) y Geneious (https://www.geneious.com).</td></tr><tr><td>Medio de crecimiento Soc</td><td>NEB</td><td>B9020S</td><td></td></tr><tr><td>Butirato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5887-1G</td><td></td></tr><tr><td>Stem Regenin 1 (SR1)</td><td>Biogems</td><td>1224999</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM II</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>9655</td><td></td></tr><tr><td>Tampón TAE (Tris-acetato-EDTA) 50X</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>B49</td><td></td></tr><tr><td>TIDE</td><td></td><td></td><td>http://shinyapps.datacurators.nl/tide/</td></tr> <tr><td>Azul tripán 0,4%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-100ML</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE (con rojo fenol), 500 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>16605-028</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0,5: EDTA, pH 8,0, 100 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>UM171</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72914</td><td></td></tr><tr><td>Herramienta de optimización de codones Vector Builder</td><td>Vector Builder</td><td></td><td>https://en.vectorbuilder.com/tool/codon-optimization.html</td></tr></tbody></table>

ingeniería de mutaciones de ganancia de función heterocigotas oncogénicas en células madre y progenitoras hematopoyéticas humanas

Engineering Oncogenic Heterozygous Gain-of-Function Mutations in Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

A lo largo de su vida, las células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) adquieren mutaciones somáticas. Algunas de estas mutaciones alteran las propiedades funcionales de HSPC como la proliferación y la diferenciación, promoviendo así el desarrollo de neoplasias hematológicas. Se requiere una manipulación genética eficiente y precisa de las HSPC para modelar, caracterizar y comprender mejor las consecuencias funcionales de las mutaciones somáticas recurrentes. Las mutaciones pueden tener un efecto perjudicial en un gen y provocar pérdida de función (LOF) o, en marcado contraste, pueden mejorar la función o incluso conducir a nuevas características de un gen en particular, denominadas ganancia de función (GOF). En contraste con las mutaciones LOF, las mutaciones GOF ocurren casi exclusivamente de manera heterocigótica. Los protocolos actuales de edición del genoma no permiten la orientación selectiva de alelos individuales, lo que dificulta la capacidad de modelar mutaciones GOF heterocigóticas. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado sobre cómo diseñar mutaciones heterocigotas de puntos calientes GOF en HSPC humanas combinando la reparación dirigida por homología mediada por CRISPR / Cas9 y la tecnología AAV6 recombinante para una transferencia eficiente de plantillas de donantes de ADN. Es importante destacar que esta estrategia hace uso de un sistema de reportero fluorescente dual para permitir el seguimiento y la purificación de HSPC editados con éxito de forma heterocigótica. Esta estrategia se puede emplear para investigar con precisión cómo las mutaciones GOF afectan la función de HSPC y su progresión hacia neoplasias hematológicas.

Al aplicar el protocolo descrito anteriormente, las mutaciones heterocigotas tipo 1 de CALR se introdujeron de forma reproducible en HSPC derivadas de la sangre del cordón umbilical. Esta mutación consiste en una deleción de 52 pb en el exón 9 (el último exón de CALR), que resulta en un desplazamiento de fotograma +1, lo que lleva a la traducción de un nuevo dominio C-terminal cargado positivamente26,33. Para introducir la mutación CALR en el locus del gen endógeno, se adoptó una estrategia de orientación intrónica aguas arriba del exón 9, ya que esto evitaría cualquier cambio no deseado en la secuencia de codificación en los casos en que el DSB inducido por Cas9 no se reparó a través del mecanismo HDR. En este caso específico, se diseñó un sgRNA para el intrón 7 debido a la disponibilidad de secuencias altas en el objetivo y bajas fuera del objetivo en combinación con brazos de homología favorables (falta de repeticiones de secuencia; Figura 5A).
Luego se diseñaron dos plantillas de donantes y se empaquetaron en vectores AAV6. Para permitir el empalme correcto de los exones endógenos al ADNc integrado, las plantillas de donantes contienen (i) una secuencia SA que incluye el sitio de empalme 3', el punto de ramificación y el tracto de polipirimidina, (ii) la secuencia de ADNc optimizada para codones de los exones 8-9, ya sea que contenga el WT (CALR WT) o la secuencia mutada (CALRDEL) ) que incluye un codón de parada, iii) una señal poliA del virus simio 40 (SV40), iv) una secuencia que codifica una proteína fluorescente bajo el control del promotor interno separado, el promotor del virus formador del foco del bazo (SFFV), seguida de v) una señal poliA de la hormona del crecimiento bovino (bGH). La plantilla de donante que contiene el ADNc de CALR WT se diseñó para contener un casete GFP, mientras que la plantilla de donante que contiene la secuencia de ADNc de CALRDEL se diseñó para contener un casete de BFP. Todo el constructo estaba flanqueado por un HA izquierdo y derecho (Figura 5A).
Dos días después de la transfección con el complejo RNP y la transducción con los virus rAAV6, las células fueron analizadas por citometría de flujo. Se pudieron detectar cuatro poblaciones principales: (i) células que no expresan ni GFP ni BFP, que representan células sin edición genómica basada en HDR, (ii) células positivas solo para GFP, que representan aquellas que habían integrado solo la construcción WT, (iii) células positivas solo para BFP, que representan aquellas que habían integrado solo la construcción mutada, y (iv) células GFP y BFP doblemente positivas, representando las células que habían integrado tanto el WT como las secuencias mutadas (Figura 5B). Para obtener poblaciones puras de HSPC portadoras de la mutación heterocigótica tipo 1 CALR , las células doble positivas se clasificaron por citometría de flujo. Las HSPC en las que se eliminaron dos secuencias WT se utilizaron como células de control (GFP+ mCherry+; Figura 5B). Una alternativa válida para usar como células de control serían las HSPC con una integración bialélica de las proteínas fluorescentes en un locus de puerto seguro (es decir, AAVS1; no se muestra). El recuento de células por exclusión de azul de tripano realizado en las HSPC clasificadas indicó que más del 90% de las células eran viables.
La integración perfecta de los constructos en el objetivo se confirmó mediante la aplicación de la estrategia de PCR in-out (Figura 6A). En este caso específico, realizamos dos PCR de entrada y salida separadas, una para la secuencia CALRWT knocked-in (carril 1 de la electroforesis en gel en la Figura 6A) y otra para la secuencia CALR DEL golpeada (carril 2 de la electroforesis en gel de la Figura 6A). La secuenciación de Sanger realizada sobre el ADN extraído de las bandas de gel confirmó la correcta inserción de las secuencias WT y mutadas en las CALRDEL/WT HCP (Figura 6B).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64558/64558fig05.jpg"> Figura 5: Generación de HSPCs portadoras de la mutación heterocigótica CALR . (A) Esquema representativo que representa la estrategia de edición para la inserción de la mutación CALR heterocigótica. El complejo RNP se dirige al intrón entre el exón 7 y el exón 8 del gen CALR . Dos AAV, uno que contiene los exones mutados 8-9 y un BFP y el otro que contiene los exones WT 8-9 y un GFP, servirán como plantillas de reparación del donante y promoverán la integración de la secuencia mutada en un alelo y la integración de la secuencia WT en el alelo restante. (B) Gráficos de citometría de flujo representativos que representan la expresión de GFP y BFP o GFP y mCherry 48 h después de la transfección y transducción de HSPC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64558/64558fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64558/64558fig06.jpg"> Figura 6: Validación de la mutación CALR heterocigótica exitosa en HSPCs . (A) Electroforesis en gel de los productos de la PCR in-out realizada en ADN genómico extraído de controles AAV, CALR WT/WT y CALRDEL/WT. Se utilizó una escalera de ADN de 100 pb. Abreviatura: NTC = control sin plantilla. (B) Resultados de secuenciación de Sanger obtenidos de las PCR in-out realizadas en CALRDEL/WT confirmando la integración exitosa del WT y secuencias mutadas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64558/64558fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Se necesitan nuevas estrategias para modelar fielmente las mutaciones somáticas en células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) para estudiar mejor la biología de las células madre hematopoyéticas y las neoplasias hematológicas. Aquí, se describe un protocolo para modelar mutaciones heterocigotas de ganancia de función en HSPC combinando el uso de CRISPR / Cas9 y la transducción dual de donantes rAAV.

Ingeniería de mutaciones de ganancia de función heterocigotas oncogénicas en células madre y progenitoras hematopoyéticas humanas

Throughout their lifetime, hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) acquire somatic mutations. Some of these mutations alter HSPC functional ...

Este método permite el modelado preciso de mutaciones leucemogénicas recurrentes de ganancia de función en células madre y progenitoras hematopoyéticas humanas primarias y, por lo tanto, investigar el papel en la transformación leucémica. La principal ventaja de esta técnica es que la ingeniería de mutaciones basada en CRISPR-Cas9 se combina con la introducción de un reportero fluorescente. Esto permite de forma única la identificación, el enriquecimiento y el seguimiento de poblaciones celulares puras mutadas heterocigotamente.Demostrando el procedimiento estará Tommaso Sconocchia, un investigador postdoctoral de mi laboratorio. Para comenzar, diseñe el ARN guía único utilizando la herramienta de diseño Benchling en línea seleccionando la opción de creación más. Luego, haga clic en la opción "secuencia de ADN" seguida de importar secuencias de ADN" e importar desde bases de datos.Luego ingrese el gen deseado y seleccione "humano" como la especie. Haga clic en la opción "buscar" y seleccione la importación de transcripción correcta. Seleccione la región de interés en la que desea introducir la ruptura de doble hebra.Luego seleccione la opción CRISPR "en el lado derecho de la pantalla, seguido de guías de diseño y análisis. A continuación, seleccione una sola guía" mientras mantiene la longitud de la guía en 20 pares de bases y la secuencia PAM para editar con SP-Cas9. Elija una guía con una puntuación alta en el objetivo y una puntuación alta fuera del objetivo y solicite el ARN guía único como un ARN guía único sintético modificado químicamente de un proveedor comercial.Para diseñar la plantilla HDR, importe la secuencia genómica y la secuencia de codificación en el software para la clonación molecular. A partir del archivo de secuencia genómica, diseñe el brazo de homología izquierdo seleccionando, idealmente, 400 pares de bases en el extremo primo de los cinco saltos de doble cadena y pegue esta secuencia en un nuevo archivo. A partir del archivo de secuencia genómica, diseñe la secuencia aceptora de empalme seleccionando los últimos 150 pares de bases del intrón objetivo y pegándolo después del brazo de homología izquierdo.En el archivo de secuencia de codificación, seleccione el ADNc que le interese. Codon optimiza el ADNc e insértalo después de la secuencia aceptora de empalme. Después del ADNc de interés, inserte una señal de poliadenilación de tres primos siguiendo una secuencia promotora para la proteína fluorescente.Luego, inserte la secuencia para la proteína fluorescente y una segunda, pero diferente señal de poliadenilación. A partir del archivo de secuencia genómica, diseñe el brazo de homología derecho seleccionando idealmente 400 pares de bases en el extremo principal de las roturas de doble cadena e inserte la secuencia después de la segunda poliadenilación. Luego, cree una copia de toda la plantilla y modifique el ADNc de interés para que contenga la secuencia de la mutación deseada.Intercambie la proteína fluorescente con una proteína fluorescente diferente. Construya y clone las plantillas HDR en el vector de expresión AAV. Para la preparación recombinante de AAV6, prepare 10 platos de 150 milímetros cada uno con 11 millones de HECK293T en 20 mililitros de DMEM suplementados con 10% FBS, 1% de estreptomicina de penicilina y 25 HEPES milimolares.Luego, coloque los platos en la incubadora a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono, durante 24 horas. Después de desechar cuidadosamente el medio viejo, reemplácelo con 20 mililitros de DMEM libre de antibióticos suplementado con 10% FBS, 25 milimolares HEPES y un butirato de sodio milimolar. A continuación, prepare dos tubos de 15 mililitros etiquetados como tubos uno y dos.Al tubo uno, agregue cinco mililitros de medio sérico reducido, 60 microgramos de plásmido HDR recombinante con mutación AAV6 y 220 microgramos de plásmido auxiliar PDGM6. Al tubo dos, agregue cinco mililitros de medio sérico reducido y 1120 microlitros de un miligramo por mililitro de solución de polietilenoamina. Después de agregar el contenido del tubo dos al tubo uno, vórtice durante 30 segundos y luego incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente.Agregue cuidadosamente 1.1 mililitros de la solución a cada plato y distribúyala girando suavemente. Coloque los platos en la incubadora a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono, durante 48 horas. Luego agregue 250 microlitros de 0.5 molar EDTA a cada plato y colóquelos en la incubadora durante 10 minutos.Cosecha las células lavándolas del plato y transfiérelas a un tubo de centrífuga de 500 mililitros. Centrifugar a 2000 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados y desechar el sobrenadante. Afloje el pellet mediante vórtice y extraiga el virus utilizando un kit de purificación AAV.Después de alícuota el virus purificado, guárdelo a menos 80 grados centígrados. Después de descongelar las células madre hematopoyéticas CD34 positivas y progenitoras, transfiera las células a 10 mililitros de RPMI precalentado suplementado con estreptomicina al 1% de penicilina. Centrifugar a 350 g a temperatura ambiente durante 10 minutos.Suspender las células en medio de retención de células madre y progenitoras hematopoyéticas a una concentración de 250, 000 células por mililitro e incubar a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 72 horas. A continuación, cosecha las células en un tubo de 15 mililitros. Contar y comprobar la viabilidad celular por exclusión de azul de tripano.Para preparar el complejo ribocucleoproteico, agregue 15 microgramos de Cas9 y ocho microgramos de ARN guía único en un tubo de 1.5 mililitros e incube a 25 grados centígrados durante 10 minutos en un bloque de calentamiento. Mientras el complejo ribonucleoproteína se está incubando, centrifugar las células a 350 G durante cinco minutos y desechar el sobrenadante. Después de suspender las células en 100 microlitros de solución de nucleofección, mezcle las células con el complejo de ribonucleoproteína y transfiéralas a la cubeta.Después de golpear suavemente la cubeta para eliminar cualquier burbuja de aire residual, inserte la cubeta en el soporte del sistema de transfección y electropolara las células. Inmediatamente después de la electroporación, añadir 400 microlitros de medio de retención de células madre y progenitoras hematopoyéticas precalentadas sin estreptomicina penicilina y transferir las células con una pipeta de transferencia fina a una placa de cultivo que contenga un medio de retención de células madre hematopoyéticas y progenitoras precalentado sin estreptomicina penicilina. Luego transfiera la placa a la incubadora.Descongele los viales que contienen los AAV recombinantes congelados en hielo y transduca las células pipeteando la cantidad óptima de cada AAV6 recombinante a la suspensión celular. Después de mezclar suavemente la suspensión celular con la pipeta, incubar las células transducidas durante seis a ocho horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Después de seis a ocho horas, recoger las células en un tubo y centrifugarlas a 350 G a temperatura ambiente durante cinco minutos.Deseche el sobrenadante y reemplácelo con un nuevo medio de retención de células progenitoras y madre hematopoyética precalentado complementado con estreptomicina de penicilina y transfiera las células a una placa de cultivo celular. Incubar las células durante 48 horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Para clasificar las células modificadas que llevan la mutación heterocigótica de ganancia de función, recolecte las células en un tubo de 15 mililitros y centrifugar a 350 G a temperatura ambiente durante cinco minutos como se demostró anteriormente.Retire el sobrenadante y suspenda las células en un mililitro de DPBS que contenga 0,1% de PSA y centrifugar nuevamente a 350 G a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de desechar el sobrenadante, suspenda las células en un volumen apropiado de DPBS más 0.1% BSA dependiendo del número de células como se demostró anteriormente. Transfiera las células a un tubo de fax estéril equipado con una tapa y agregue siete AAD u otro tinte de viabilidad a la suspensión celular para la exclusión de células vivas / muertas.Clasifique las células vivas que son doblemente positivas para las proteínas reporteras fluorescentes en un tubo de recolección que contenga 200 microlitros de madre hematopoyética y medio de retención de células progenitoras. Después de centrifugar las células clasificadas a 350 G a temperatura ambiente durante cinco minutos como se demostró anteriormente, a una concentración de 250, 000 células por mililitro para una mayor expansión en cultivo o utilizar las células directamente para ensayos funcionales. Dos días después de la transvección con el complejo ribonucleoproteína y la transducción con los virus AAV6 recombinantes, las células se analizaron mediante citometría de flujo.Se detectaron cuatro poblaciones principales, incluidas las células sin edición del genoma basada en HDR que no expresan ni las células GFP ni las BFP positivas solo para GFP con solo la construcción de tipo salvaje integrada, las células positivas solo para BFP con solo la construcción mutada integrada, y las células GFP y BFP doble positivas con el tipo salvaje y las secuencias mutadas integradas. Para validar el knock-in exitoso de las mutaciones heterocigotas de calreticulina in/out se realizó PCR en ADN genómico extraído de células incubadas solo con AAV y de células incubadas con la ribonucleoproteína y AAV con el tipo salvaje de calreticulina knocked-in y la secuencia de deleción de calreticulina. Las células se clasificaron en función de la expresión simultánea de ambos reporteros de fluorescencia antes de la extracción de ADN.Después de la electroforesis en gel, se extirparon bandas individuales del gel y se extrajo ADN para la posterior secuenciación de Sanger. Los resultados de la secuenciación confirmaron la integración perfecta exitosa del tipo salvaje y las secuencias mutadas en las células madre y progenitoras hematopoyéticas heterocigotas mutadas en calreticulina. Lo más importante que debe recordar al intentar este procedimiento es seleccionar cuidadosamente el ARN guía único de mejor rendimiento, ya que esto determinará la eficiencia general de HDR y, por lo tanto, la frecuencia de éxito de mutaciones heterocigotas.Después de este procedimiento, las células genéticamente modificadas se pueden utilizar para experimentos funcionales in vitro e in vivo, como ensayos de unidades formadoras de colonias, ensayos de diferenciación y trasplante en ratones inmunodeficientes.

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