Name: Cultivo tridimensional de tejido adiposo termogénico vascularizado a partir de fragmentos microvasculares (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Aprende a cultivar tejido adiposo termogénico vascularizado en 3D a partir de fragmentos microvasculares. Este método simplifica la ingeniería de grasa beige funcional para investigar obesidad y enfermedades metabólicas.

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El Dr. Acosta cuenta con el apoyo de las subvenciones CA148724 y TL1TR002647 de los Institutos Nacionales de Salud. El Dr. González Porras cuenta con el apoyo del Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales de los Institutos Nacionales de Salud, bajo el número de adjudicación F32-0DK122754. Este trabajo fue apoyado, en parte, por los Institutos Nacionales de Salud (5SC1DK122578) y el Departamento de Ingeniería Biomédica de la Universidad de Texas en San Antonio. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud. Las figuras fueron creadas parcialmente con Biorender.com.

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<li>Acosta, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipogenic+differentiation+alters+properties+of+vascularized+tissue-engineered+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Adipogenic differentiation alters properties of vascularized tissue-engineered skeletal muscle.</a> Tissue Engineering. Part A. 28 (1-2), 54-68 (2021).</li>
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<li>Chiou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold+architecture+and+matrix+strain+modulate+mesenchymal+cell+and+microvascular+growth+and+development+in+a+time+dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Scaffold architecture and matrix strain modulate mesenchymal cell and microvascular growth and development in a time dependent manner.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 13 (5), 507-526 (2020).</li>
</ol>

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un posible conflicto de intereses.

El campo de la ingeniería de tejidos adiposos marrones/beige es en gran medida inmaduro 22,23,24,25,26,27,28, con la mayor parte de los modelos adiposos desarrollados para el tejido adiposo blanco 8,22,31...

El objetivo de este protocolo es describir un enfoque para desarrollar tejido adiposo beige vascularizado a partir de una sola fuente potencialmente autóloga, fragmento microvascular (MVF). Se ha demostrado que los tejidos adiposos marrones y beige muestran propiedades beneficiosas relacionadas con la regulación metabólica; Sin embargo, el pequeño volumen de estos depósitos de tejido adiposo en adultos limita el impacto potencial sobre el metabolismo sistémico, particularmente en condiciones enfermas como la obesidad o la diabetes tipo 2 1,2,3,4,5,6,7. Existe un interés significativo en la grasa marrón/beige como diana terapéutica para prevenir los efectos metabólicos nocivos relacionados con la obesidad y sus comorbilidades 8,9,10,11,12.
Los MVF son estructuras de vasos que pueden aislarse directamente del tejido adiposo, cultivarse y mantenerse en una configuración tridimensional durante largos períodos de tiempo13,14,15. Trabajos previos de nuestro grupo, y otros, han comenzado a explotar la capacidad multicelular y multipotente de los MVF, específicamente en lo que se refiere a la formación de tejido adiposo16,17,18. Como preparación de este trabajo, recientemente demostramos que los MVF derivados de modelos de roedores de diabetes sana y tipo 219 y de sujetos humanos (adultos mayores de 50 años)20 contenían células capaces de ser inducidas a formar tejido adiposo termogénico o beige.
Aquí se trata de un enfoque innovador a partir del cual se utiliza una MVF de una sola fuente, no sólo capaz de crear tejido adiposo beige sino también su componente vascular asociado y crítico21. El uso de esta técnica podría ser de gran valor para los estudios que buscan un enfoque directo de ingeniería tisular para la formación de tejido adiposo termogénico. A diferencia de otros métodos que aspiran a diseñar tejido adiposo beige 22,23,24,25,26,27,28, el proceso descrito en este estudio no requiere el uso de múltiples tipos de células o regímenes de inducción complejos. Se pueden crear modelos vascularizados de color beige y grasa blanca con MVF procedentes de roedores y fuentes humanas, lo que demuestra un gran potencial de traducción. El producto final de este protocolo es un tejido graso termogénico beige diseñado con una estructura y función metabólica comparable al tejido adiposo marrón. En general, este protocolo presenta la idea de que una MVF de fuente fácilmente accesible y posiblemente autóloga puede ser una intervención terapéutica y una herramienta que vale la pena para estudiar los trastornos metabólicos.

<table><tbody><tr><td>Ácido aminocaproico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2504-100G</td><td>Añadido en DMEM a la concentración de 1 mg/mL</td></tr><tr><td>Tijeras de punta roma</td><td>Fisher scientific</td><td>12-000-172</td><td>Esterilizar en autoclave</td></tr><tr><td>Bovin Albúmina sérica (BSA)</td><td>Millipore</td><td>126575-10GM</td><td>Diluido en PBS a 4 mg/mL y 1 mg/mL</td></tr><tr><td>Colagenasa tipo 1</td><td>Fisher scientific</td><td>NC9633623</td><td>Diluido a 6 mg/mL en BSA 4 mg/mL, Digestión de grasa picada</td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Thermo Scientific</td><td>AC230302500</td><td>Diluido en etanol a una concentración de 2 mg/ml</td></tr><tr><td>Almohadillas desechables</td><td>Fisher scientific</td><td>23-666-062</td><td>Para la absorción de líquidos durante la cirugía</td></tr><tr><td>Tijeras de disección</td><td>Fisher scientific</td><td>08-951-5</td><td>Esterilizar en autoclave</td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Eagle&prime modificado; s Medio (DMEM)</td><td>Fisher científico</td><td>11885092</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Eagle&prime modificado; s Mezcla Medio/Nutriente F-12 Jamón (DMEM/F12)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8062</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>16140089</td><td>Añadido en DMEM al 20% v/v.</td></tr><tr><td>Fibrinógeno&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8630-25G</td><td>Solubilizado en DMEM a la concentración de 20 mg/mL, Proteína que se encuentra en el plasma sanguíneo y componente principal del hidrogel</td></tr><tr><td>Matraz, 250 mL</td><td>Fisher scientific</td><td>FB500250</td><td>Permite la digestión de la grasa utilizando una gran superficie</td></tr><tr><td>Pinza Fisher</td><td>scientific</td><td>50-264-21</td><td>Esterilizar en autoclave, Para la manipulación de tejidos y filtros</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6886</td><td>Diluido en etanol a una concentración de stock de 10 mM</td></tr><tr>En el presente estudio se utilizaron<td>MVF</td><td>Soluciones Avanzadas de Humano Life Scienes, LLC</td><td>https://www.advancedsolutions.com/microvessels</td><td>MVF humanos (hMVF) aislados de tres pacientes diferentes (mujeres de 52, 54 y 56 años).&nbsp;</td></tr><tr><td>Indometacina&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I7378</td><td>Diluido en etanol a una concentración de stock de 12,5 mM</td></tr><tr><td>Insulina de páncreas porcino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I5523</td><td>Diluido en HCl de 0,01 N a una concentración de stock de 5 mg/ml</td></tr><tr><td>MycoZap</td><td>Fisher scientific</td><td>NC9023832</td><td>Añadido en DMEM al 0,2% p/v, Mycoplasma Prophylactic&nbsp;</td></tr><tr><td>Polecilina/estreptomicina (10,000 U/mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Añadido en DMEM al 1% v/v.</td></tr><tr><td>Placas de Petri, poliestireno (100 mm x 15 mm).</td><td>Fisher scientific</td><td>351029</td><td>3 para la extracción de vasos sanguíneos y picado, 8 (tapa) para el remojo previo de las pantallas y 8 (plato) para usar cuando se filtra con 500 o 37 &micro; Pantallas M Placas de</td></tr><tr><td>Petri, poliestireno (35 mm x 10 mm).</td><td>Fisher scientific</td><td>50-202-036</td><td>Para contar fragmentos</td></tr><tr><td>Tampón de fosfato solución salina (PBS)</td><td>Fisher scientific</td><td>14-190-250</td><td>Diluido a 1x con agua desionizada estéril.</td></tr><tr><td>Cortaratas (Andwin Mini Arco Pet Trimmer)</td><td>Fisher scientific</td><td>NC0854141</td><td></td></tr><tr><td>Rosiglitazona</td><td>Fisher scientific R0106200MG</td><td></td><td>Diluido en DMSO a una concentración de 10 mM</td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>Fine Science Tools</td><td>14059-11</td><td>1 para incisión inicial, 1 para incisión epididimaria, 1 para recorte de punta</td></tr><tr><td>Pantalla&nbsp; 37 &micro; M&nbsp;</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>652222R</td><td>Cortado en cuadrados redondeados de 3" y esterilizado en óxido de etileno, atrapamiento de fragmentos y eliminación de fragmentos muy pequeños/células individuales y escombros</td></tr><tr><td>Screen 500 &micro; M&nbsp;</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>652222F</td><td>Cortado en cuadrados redondeados de 3" y esterilizado en óxido de etileno, Elimina fragmentos / desechos más grandes</td></tr><tr><td>Hemostático dentado</td><td>Fisher scientific</td><td>12-000-171</td><td>Esterilizar en autoclave, Para el pinzamiento de la piel antes de la incisión</td></tr><tr><td>Filtro Steriflip 0.22 &mu; m&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SE1M179M6</td><td></td></tr><tr><td>Trombina</td><td>Fisher scientific</td><td>6051601KU</td><td>Diluido en agua desionizada a 10 U/mL, utilizado como agente de coagulación convirtiendo el fibrinógeno en fibrina</td></tr><tr><td>Hormona tiroidea (T3)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2877</td><td>Diluido en NaOH 1N a una concentración de stock de 0,02 mM</td></tr><tr><td>Zucker ratas diabéticas grasas (ZDF) - obesas (FA/FA) o magras (FA/+) machos&nbsp;</td><td>Charles River</td><td>https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-lean-fa?region=3611 https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-obese?region=3611</td><td>Obtenido de Charles River (Wilmington, MA). Las ratas fueron adquiridas a las 4 semanas de edad y alimentadas con Purina 5008 hasta la eutanasia (15-19 semanas de edad). Los niveles de glucosa (sangre de la vena safena lateral) fueron superiores a 300 mg/dL en todas las ratas FA/FA utilizadas en el estudio. Todos los animales fueron alojados en un ambiente de temperatura controlada con un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas y alimentados ad libitum.</td></tr></tbody></table>

cultivo tridimensional de tejido adiposo termogénico vascularizado a partir de fragmentos microvasculares

Three-Dimensional Culture of Vascularized Thermogenic Adipose Tissue from Microvascular Fragments

La ingeniería de tejido adiposo termogénico (por ejemplo, tejidos adiposos beige o marrones) se ha investigado como una terapia potencial para enfermedades metabólicas o para el diseño de microtejidos personalizados para la detección de la salud y las pruebas de drogas. Las estrategias actuales son a menudo bastante complejas y no logran representar con precisión las propiedades multicelulares y funcionales del tejido adiposo termogénico. Los fragmentos microvasculares, pequeños microvasos intactos compuestos por arteriolas, vénulas y capilares aislados del tejido adiposo, sirven como una única fuente autóloga de células que permiten la vascularización y la formación de tejido adiposo. Este artículo describe métodos para optimizar las condiciones de cultivo para permitir la generación de tejidos adiposos termogénicos tridimensionales, vascularizados y funcionales a partir de fragmentos microvasculares, incluidos los protocolos para aislar fragmentos microvasculares del tejido adiposo y las condiciones de cultivo. Además, se discuten las mejores prácticas, al igual que las técnicas para caracterizar los tejidos diseñados, y se proporcionan resultados de muestras de fragmentos microvasculares humanos y de roedores. Este enfoque tiene el potencial de ser utilizado para la comprensión y el desarrollo de tratamientos para la obesidad y las enfermedades metabólicas.

Hay algunas características morfológicas fenotípicas clave del tejido adiposo beige / marrón: es multilocular / contiene pequeñas gotas de lípidos, posee una gran cantidad de mitocondrias (la razón de su apariencia característicamente "pardusca" in vivo), tiene una alta tasa de consumo de oxígeno / bioenergética mitocondrial, está altamente vascularizada, ha aumentado la lipólisis / absorción de glucosa estimulada por la insulina y, lo más notorio, expresa altos niveles de proteína de desacoplamiento 1 (UCP1), ...

Aquí, presentamos un protocolo detallado que describe el uso de fragmentos microvasculares aislados de tejido graso humano o de roedores como un enfoque directo para diseñar tejido adiposo beige vascularizado funcional.

Cultivo tridimensional de tejido adiposo termogénico vascularizado a partir de fragmentos microvasculares

Engineering thermogenic adipose tissue (e.g., beige or brown adipose tissues) has been investigated as a potential therapy for metabolic diseases or for ...

Este protocolo describe la generación de grasa termogénica vascularizada y funcional tridimensional a partir de fragmentos microvasculares, o MVF. Las estrategias actuales para diseñar tejido adiposo termogénico son complejas y no representan completamente sus propiedades multicelulares y funcionales. Los MVF son una fuente única de células que permiten la vascularización y la formación de tejido adiposo.Al ser un método simple de fuente única para crear imitaciones biológicas de grasa beige, los MVF tienen un potencial significativo para promover la comprensión o el desarrollo de tratamientos para la obesidad y las enfermedades metabólicas. Coloque el animal debidamente afeitado y sacrificado tratado con etanol al 70% en posición supina y comience el aislamiento de la grasa inguinal. Levante la piel debajo del pene con un par de tijeras y realice la incisión, comenzando en el centro y cortando lateralmente, formando una forma de V, antes de hacer un bucle hacia la parte posterior del animal para acceder a todo el depósito de grasa.Durante el corte, asegúrese de separar la piel de la grasa cortando el tejido de la fascia interconectado. Una vez que la fascia se corta adecuadamente, asegúrese de que la grasa inguinal de ambos lados, que se extiende desde la ingle hacia la espalda, sea visible. A continuación, retire la grasa de los dos lados en tubos cónicos separados que contienen 10 mililitros de BSA en PBS, que tienen una concentración de un miligramo por mililitro.Para cosechar la grasa del epidídimo, corte a través de la piel abdominal, seguido de cortar cuidadosamente a través de la capa delgada que rodea los testículos. Tire suavemente del tejido graso con fórceps y córtelo con tijeras, evitando la disección de cualquier vaso sanguíneo visible importante. Ahora, coloque la grasa eliminada en un tubo cónico de 50 mililitros que contenga 10 mililitros de un miligramo por mililitro BSA en PBS.Para aislar la grasa subcutánea posterior, gire la rata boca abajo y use tijeras grandes para cortar la piel gruesa de la espalda hasta el cuero cabelludo, teniendo cuidado de no cortar demasiado profundo debajo de la piel. Corte la fascia que conecta la piel con el tejido. Diferenciar la grasa subcutánea, ubicada en la región intraescapular, de la grasa marrón ubicada más cerca de la columna vertebral antes de aislar y colocar la grasa subcutánea en un tubo cónico de 50 mililitros que contiene 10 mililitros de un miligramo por mililitro BSA en PBS.Mientras trabaja dentro de una biohood, use fórceps para colocar la grasa extirpada en una placa de Petri estándar de 100 mililitros que contenga 0.5 mililitros de un miligramo por mililitro BSA en PBS. Retire cualquier vaso sanguíneo visible, músculos o tejido extraño de la grasa. Usando tijeras, pica la grasa durante 10 minutos y comprueba si hay grumos agregando un poco más de BSA.Continuar picando, si es necesario, antes de transferir la suspensión de grasa picada a un matraz estéril de 250 mililitros con una pipeta de 10 mililitros. Haga que el volumen en el matraz sea de hasta 20 mililitros agregando suficiente BSA en PBS. Ahora agregue BSA en PBS a la colagenasa y homogeneice la solución agitándola suavemente antes de filtrarla estéril a través de un filtro de red de nylon de 0.22 micrones.Agregue inmediatamente la cantidad requerida de solución de colagenasa a la suspensión de grasa picada y digiera la grasa agitando el matraz con movimientos circulares en un baño de agua a 37 grados centígrados durante el tiempo apropiado. Transfiera la grasa digerida a un tubo cónico de 50 mililitros etiquetado como grasa digerida o grasa picada. Centrifugar el tubo a 400 G durante cuatro minutos para hacer girar los fragmentos microvasculares, o MVF, en una bolita roja.Decantar suavemente el sobrenadante en un tubo cónico de 50 mililitros etiquetado como desecho sin alterar el pellet. A continuación, agregue 10 mililitros de un miligramo por mililitro BSA en PBS al tubo que contiene el pellet, y mezcle la suspensión de pellets pipeteándola suavemente hacia arriba y hacia abajo dos veces sin interrumpir los fragmentos. Ahora, tome la pantalla de 500 micras preempapada en una placa de Petri estéril que contiene cinco mililitros de un miligramo por mililitro BSA en PBS y colóquela sobre el soporte de pantalla de plástico guardado en una nueva placa de Petri.Pipetear 10 mililitros de suspensión del tubo de pellets digerido a la pantalla en círculos concéntricos. Lave el filtro con cinco mililitros adicionales de un miligramo por mililitro BSA en PBS y deséchelo, mientras conserva el filtrado dentro de la placa de Petri. Luego coloque la pantalla de 37 micras previamente empapada sobre el soporte de la pantalla de plástico en una nueva placa de Petri.Con una pipeta nueva, transfiera el filtrado de la primera filtración a la pantalla en círculos concéntricos. Como se describió anteriormente, lave la pantalla con BSA en PBS y, esta vez, deseche el filtrado mientras conserva la pantalla de 37 micras. Deslice la pantalla de 37 micras en una nueva placa de Petri que contenga cinco mililitros de un miligramo por mililitro BSA en PBS.Desaloje los fragmentos golpeando suavemente el plato contra un soporte cónico, sin derramar ningún líquido. Enjuague el filtro con cinco mililitros adicionales de BSA en PBS. A continuación, transfiera el líquido de la placa de Petri a un tubo cónico estéril de 50 mililitros.Enjuague la pantalla de 37 micras varias veces más, agregando el lavado al tubo cónico hasta que el volumen total recogido sea de 15 a 20 mililitros. Deseche la pantalla después del enjuague final. Corte el extremo de una punta de pipeta de 20 microlitros con unas tijeras.Agite suavemente el tubo que contiene el líquido antes de extraer dos alícuotas de 20 microlitros con la punta de la pipeta cortada, y pipete cada una de las alícuotas en una placa de Petri limpia de 35 milímetros. Contar el número de fragmentos en la muestra en cada placa de Petri utilizando un microscopio óptico estándar, y utilizando la fórmula mencionada en el manuscrito, obtener el número total de fragmentos microvasculares aislados. Haga girar el líquido restante en el tubo cónico de 50 mililitros a 400 G durante cuatro minutos para recoger el MVF.Después de girar, decantar la mayor parte del sobrenadante del tubo cónico y usar una pipeta para eliminar el pequeño volumen de líquido que queda en el borde del tubo. A continuación, agregue trombina en los pocillos designados para geles de fundición. Corte el extremo de una punta de pipeta de 200 microlitros y, con su uso, resuspenda suavemente los MVF en fibrinógeno para obtener la densidad final deseada.Pipetear la suspensión en la solución de trombina en el pozo y homogeneizar rápidamente la mezcla pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Una vez que todos los geles estén fundidos, coloque la placa del pozo en una incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante unos 15 minutos para permitir la reticulación del gel. Los lípidos y los adipocitos diferenciados se observaron mediante microscopía confocal de los hidrogeles utilizando BODIPY como tinción lipídica.El cultivo de tejido adiposo no vascularizado utilizando medios adipogénicos blancos o adipogénicos beige dio como resultado la formación de tejido adiposo blanco o beige no vascularizado, respectivamente, a partir de MVF derivados de roedores magros y diabéticos. Del mismo modo, el cultivo de tejido adiposo vascularizado utilizando medios adipogénicos blancos o beige dio como resultado la formación de tejido adiposo blanco o beige vascularizado, respectivamente, a partir de los MVF derivados de roedores. El tejido adiposo blanco y beige no vascularizado obtenido de MVF humanos también se observó mediante microscopía confocal.La capacidad de los MVF para diferenciarse en tejido adiposo beige se confirmó genéticamente mediante RT-qPCR. Se evaluaron los MVF de roedores magros y diabéticos expuestos a medios adipogénicos blancos directos o adipogénicos beige para adipogénesis, termogénesis y angiogénesis. La expresión de la proteína 1 de desacoplamiento como se esperaba, fue significativamente mayor en el tejido adipogénico beige.Se observó una tendencia similar en los FMM de roedores expuestos a medios adipogénicos blancos indirectos o adipogénicos beige, así como en los FMM humanos expuestos a medios adipogénicos blancos directos o adipogénicos beige. Por último, a partir de la bioenergética mitocondrial, fue evidente que funcionalmente, el tejido adiposo beige tenía una tasa de consumo de oxígeno característicamente más alta, o OCR, en todos los casos. La digestión enzimática del tejido adiposo debe optimizarse para reproducir consistentemente MVF de tamaño y calidad similares.Después de la digestión, los MVF deben manipularse con cuidado, con especial cuidado para evitar una mayor ruptura de los fragmentos. Esta técnica ayudó a promover el equilibrio del crecimiento de los vasos y la diferenciación de los adipocitos, que ha demostrado ser dependiente de los factores introducidos.

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Investigación

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Bioengineering

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Aislamiento, cultivo e inducción adipogénica de preadipocitos derivados de la fracción vascular estromal a partir de tejido adiposo periaórtico de ratón

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Aprende a cultivar tejido adiposo termogénico vascularizado en 3D a partir de fragmentos microvasculares. Este método simplifica la ingeniería de grasa beige funcional para investigar obesidad y enfermedades metabólicas.

Cultivo tridimensional de tejido adiposo termogénico vascularizado a partir de fragmentos microvasculares

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