Name: Cultivo tridimensional de tejido adiposo termogénico vascularizado a partir de fragmentos microvasculares (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Aprende a cultivar tejido adiposo termogénico vascularizado en 3D a partir de fragmentos microvasculares. Este método simplifica la ingeniería de grasa beige funcional para investigar obesidad y enfermedades metabólicas.

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El Dr. Acosta cuenta con el apoyo de las subvenciones CA148724 y TL1TR002647 de los Institutos Nacionales de Salud. El Dr. González Porras cuenta con el apoyo del Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales de los Institutos Nacionales de Salud, bajo el número de adjudicación F32-0DK122754. Este trabajo fue apoyado, en parte, por los Institutos Nacionales de Salud (5SC1DK122578) y el Departamento de Ingeniería Biomédica de la Universidad de Texas en San Antonio. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud. Las figuras fueron creadas parcialmente con Biorender.com.

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<li>Acosta, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipogenic+differentiation+alters+properties+of+vascularized+tissue-engineered+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Adipogenic differentiation alters properties of vascularized tissue-engineered skeletal muscle.</a> Tissue Engineering. Part A. 28 (1-2), 54-68 (2021).</li>
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<li>Chiou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold+architecture+and+matrix+strain+modulate+mesenchymal+cell+and+microvascular+growth+and+development+in+a+time+dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Scaffold architecture and matrix strain modulate mesenchymal cell and microvascular growth and development in a time dependent manner.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 13 (5), 507-526 (2020).</li>
</ol>

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un posible conflicto de intereses.

El campo de la ingeniería de tejidos adiposos marrones/beige es en gran medida inmaduro 22,23,24,25,26,27,28, con la mayor parte de los modelos adiposos desarrollados para el tejido adiposo blanco 8,22,31...

El objetivo de este protocolo es describir un enfoque para desarrollar tejido adiposo beige vascularizado a partir de una sola fuente potencialmente autóloga, fragmento microvascular (MVF). Se ha demostrado que los tejidos adiposos marrones y beige muestran propiedades beneficiosas relacionadas con la regulación metabólica; Sin embargo, el pequeño volumen de estos depósitos de tejido adiposo en adultos limita el impacto potencial sobre el metabolismo sistémico, particularmente en condiciones enfermas como la obesidad o la diabetes tipo 2 1,2,3,4,5,6,7. Existe un interés significativo en la grasa marrón/beige como diana terapéutica para prevenir los efectos metabólicos nocivos relacionados con la obesidad y sus comorbilidades 8,9,10,11,12.
Los MVF son estructuras de vasos que pueden aislarse directamente del tejido adiposo, cultivarse y mantenerse en una configuración tridimensional durante largos períodos de tiempo13,14,15. Trabajos previos de nuestro grupo, y otros, han comenzado a explotar la capacidad multicelular y multipotente de los MVF, específicamente en lo que se refiere a la formación de tejido adiposo16,17,18. Como preparación de este trabajo, recientemente demostramos que los MVF derivados de modelos de roedores de diabetes sana y tipo 219 y de sujetos humanos (adultos mayores de 50 años)20 contenían células capaces de ser inducidas a formar tejido adiposo termogénico o beige.
Aquí se trata de un enfoque innovador a partir del cual se utiliza una MVF de una sola fuente, no sólo capaz de crear tejido adiposo beige sino también su componente vascular asociado y crítico21. El uso de esta técnica podría ser de gran valor para los estudios que buscan un enfoque directo de ingeniería tisular para la formación de tejido adiposo termogénico. A diferencia de otros métodos que aspiran a diseñar tejido adiposo beige 22,23,24,25,26,27,28, el proceso descrito en este estudio no requiere el uso de múltiples tipos de células o regímenes de inducción complejos. Se pueden crear modelos vascularizados de color beige y grasa blanca con MVF procedentes de roedores y fuentes humanas, lo que demuestra un gran potencial de traducción. El producto final de este protocolo es un tejido graso termogénico beige diseñado con una estructura y función metabólica comparable al tejido adiposo marrón. En general, este protocolo presenta la idea de que una MVF de fuente fácilmente accesible y posiblemente autóloga puede ser una intervención terapéutica y una herramienta que vale la pena para estudiar los trastornos metabólicos.

<table><tbody><tr><td>Ácido aminocaproico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2504-100G</td><td>Añadido en DMEM a la concentración de 1 mg/mL</td></tr><tr><td>Tijeras de punta roma</td><td>Fisher scientific</td><td>12-000-172</td><td>Esterilizar en autoclave</td></tr><tr><td>Bovin Albúmina sérica (BSA)</td><td>Millipore</td><td>126575-10GM</td><td>Diluido en PBS a 4 mg/mL y 1 mg/mL</td></tr><tr><td>Colagenasa tipo 1</td><td>Fisher scientific</td><td>NC9633623</td><td>Diluido a 6 mg/mL en BSA 4 mg/mL, Digestión de grasa picada</td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Thermo Scientific</td><td>AC230302500</td><td>Diluido en etanol a una concentración de 2 mg/ml</td></tr><tr><td>Almohadillas desechables</td><td>Fisher scientific</td><td>23-666-062</td><td>Para la absorción de líquidos durante la cirugía</td></tr><tr><td>Tijeras de disección</td><td>Fisher scientific</td><td>08-951-5</td><td>Esterilizar en autoclave</td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Eagle&prime modificado; s Medio (DMEM)</td><td>Fisher científico</td><td>11885092</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Eagle&prime modificado; s Mezcla Medio/Nutriente F-12 Jamón (DMEM/F12)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8062</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>16140089</td><td>Añadido en DMEM al 20% v/v.</td></tr><tr><td>Fibrinógeno&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8630-25G</td><td>Solubilizado en DMEM a la concentración de 20 mg/mL, Proteína que se encuentra en el plasma sanguíneo y componente principal del hidrogel</td></tr><tr><td>Matraz, 250 mL</td><td>Fisher scientific</td><td>FB500250</td><td>Permite la digestión de la grasa utilizando una gran superficie</td></tr><tr><td>Pinza Fisher</td><td>scientific</td><td>50-264-21</td><td>Esterilizar en autoclave, Para la manipulación de tejidos y filtros</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6886</td><td>Diluido en etanol a una concentración de stock de 10 mM</td></tr><tr>En el presente estudio se utilizaron<td>MVF</td><td>Soluciones Avanzadas de Humano Life Scienes, LLC</td><td>https://www.advancedsolutions.com/microvessels</td><td>MVF humanos (hMVF) aislados de tres pacientes diferentes (mujeres de 52, 54 y 56 años).&nbsp;</td></tr><tr><td>Indometacina&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I7378</td><td>Diluido en etanol a una concentración de stock de 12,5 mM</td></tr><tr><td>Insulina de páncreas porcino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I5523</td><td>Diluido en HCl de 0,01 N a una concentración de stock de 5 mg/ml</td></tr><tr><td>MycoZap</td><td>Fisher scientific</td><td>NC9023832</td><td>Añadido en DMEM al 0,2% p/v, Mycoplasma Prophylactic&nbsp;</td></tr><tr><td>Polecilina/estreptomicina (10,000 U/mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Añadido en DMEM al 1% v/v.</td></tr><tr><td>Placas de Petri, poliestireno (100 mm x 15 mm).</td><td>Fisher scientific</td><td>351029</td><td>3 para la extracción de vasos sanguíneos y picado, 8 (tapa) para el remojo previo de las pantallas y 8 (plato) para usar cuando se filtra con 500 o 37 &micro; Pantallas M Placas de</td></tr><tr><td>Petri, poliestireno (35 mm x 10 mm).</td><td>Fisher scientific</td><td>50-202-036</td><td>Para contar fragmentos</td></tr><tr><td>Tampón de fosfato solución salina (PBS)</td><td>Fisher scientific</td><td>14-190-250</td><td>Diluido a 1x con agua desionizada estéril.</td></tr><tr><td>Cortaratas (Andwin Mini Arco Pet Trimmer)</td><td>Fisher scientific</td><td>NC0854141</td><td></td></tr><tr><td>Rosiglitazona</td><td>Fisher scientific R0106200MG</td><td></td><td>Diluido en DMSO a una concentración de 10 mM</td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>Fine Science Tools</td><td>14059-11</td><td>1 para incisión inicial, 1 para incisión epididimaria, 1 para recorte de punta</td></tr><tr><td>Pantalla&nbsp; 37 &micro; M&nbsp;</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>652222R</td><td>Cortado en cuadrados redondeados de 3" y esterilizado en óxido de etileno, atrapamiento de fragmentos y eliminación de fragmentos muy pequeños/células individuales y escombros</td></tr><tr><td>Screen 500 &micro; M&nbsp;</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>652222F</td><td>Cortado en cuadrados redondeados de 3" y esterilizado en óxido de etileno, Elimina fragmentos / desechos más grandes</td></tr><tr><td>Hemostático dentado</td><td>Fisher scientific</td><td>12-000-171</td><td>Esterilizar en autoclave, Para el pinzamiento de la piel antes de la incisión</td></tr><tr><td>Filtro Steriflip 0.22 &mu; m&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SE1M179M6</td><td></td></tr><tr><td>Trombina</td><td>Fisher scientific</td><td>6051601KU</td><td>Diluido en agua desionizada a 10 U/mL, utilizado como agente de coagulación convirtiendo el fibrinógeno en fibrina</td></tr><tr><td>Hormona tiroidea (T3)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2877</td><td>Diluido en NaOH 1N a una concentración de stock de 0,02 mM</td></tr><tr><td>Zucker ratas diabéticas grasas (ZDF) - obesas (FA/FA) o magras (FA/+) machos&nbsp;</td><td>Charles River</td><td>https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-lean-fa?region=3611 https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-obese?region=3611</td><td>Obtenido de Charles River (Wilmington, MA). Las ratas fueron adquiridas a las 4 semanas de edad y alimentadas con Purina 5008 hasta la eutanasia (15-19 semanas de edad). Los niveles de glucosa (sangre de la vena safena lateral) fueron superiores a 300 mg/dL en todas las ratas FA/FA utilizadas en el estudio. Todos los animales fueron alojados en un ambiente de temperatura controlada con un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas y alimentados ad libitum.</td></tr></tbody></table>

cultivo tridimensional de tejido adiposo termogénico vascularizado a partir de fragmentos microvasculares

Three-Dimensional Culture of Vascularized Thermogenic Adipose Tissue from Microvascular Fragments

La ingeniería de tejido adiposo termogénico (por ejemplo, tejidos adiposos beige o marrones) se ha investigado como una terapia potencial para enfermedades metabólicas o para el diseño de microtejidos personalizados para la detección de la salud y las pruebas de drogas. Las estrategias actuales son a menudo bastante complejas y no logran representar con precisión las propiedades multicelulares y funcionales del tejido adiposo termogénico. Los fragmentos microvasculares, pequeños microvasos intactos compuestos por arteriolas, vénulas y capilares aislados del tejido adiposo, sirven como una única fuente autóloga de células que permiten la vascularización y la formación de tejido adiposo. Este artículo describe métodos para optimizar las condiciones de cultivo para permitir la generación de tejidos adiposos termogénicos tridimensionales, vascularizados y funcionales a partir de fragmentos microvasculares, incluidos los protocolos para aislar fragmentos microvasculares del tejido adiposo y las condiciones de cultivo. Además, se discuten las mejores prácticas, al igual que las técnicas para caracterizar los tejidos diseñados, y se proporcionan resultados de muestras de fragmentos microvasculares humanos y de roedores. Este enfoque tiene el potencial de ser utilizado para la comprensión y el desarrollo de tratamientos para la obesidad y las enfermedades metabólicas.

Hay algunas características morfológicas fenotípicas clave del tejido adiposo beige / marrón: es multilocular / contiene pequeñas gotas de lípidos, posee una gran cantidad de mitocondrias (la razón de su apariencia característicamente "pardusca" in vivo), tiene una alta tasa de consumo de oxígeno / bioenergética mitocondrial, está altamente vascularizada, ha aumentado la lipólisis / absorción de glucosa estimulada por la insulina y, lo más notorio, expresa altos niveles de proteína de desacoplamiento 1 (UCP1), ...

Aquí, presentamos un protocolo detallado que describe el uso de fragmentos microvasculares aislados de tejido graso humano o de roedores como un enfoque directo para diseñar tejido adiposo beige vascularizado funcional.

Cultivo tridimensional de tejido adiposo termogénico vascularizado a partir de fragmentos microvasculares

Engineering thermogenic adipose tissue (e.g., beige or brown adipose tissues) has been investigated as a potential therapy for metabolic diseases or for ...

Este protocolo describe la generación de grasa termogénica vascularizada y funcional tridimensional a partir de fragmentos microvasculares, o MVF. Las estrategias actuales para diseñar tejido adiposo termogénico son complejas y no representan completamente sus propiedades multicelulares y funcionales. Los MVF son una fuente única de células que permiten la vascularización y la formación de tejido adiposo.Al ser un método simple de fuente única para crear imitaciones biológicas de grasa beige, los MVF tienen un potencial significativo para promover la comprensión o el desarrollo de tratamientos para la obesidad y las enfermedades metabólicas. Coloque el animal debidamente afeitado y sacrificado tratado con etanol al 70% en posición supina y comience el aislamiento de la grasa inguinal. Levante la piel debajo del pene con un par de tijeras y realice la incisión, comenzando en el centro y cortando lateralmente, formando una forma de V, antes de hacer un bucle hacia la parte posterior del animal para acceder a todo el depósito de grasa.Durante el corte, asegúrese de separar la piel de la grasa cortando el tejido de la fascia interconectado. Una vez que la fascia se corta adecuadamente,

three-dimensional-culture-vascularized-thermogenic-adipose-tissue

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Aquí, presentamos un protocolo para la encapsulación de células catabólicas, que consumen lípidos para la producción de calor en el tejido adiposo intraabdominal y aumentan la disipación de energía en ratones obesos.

La encapsulación termogénico preadipocitos para el trasplante en los depósitos de tejido adiposo

Se presenta un protocolo para aislar fragmentos microvasculares derivadas de tejido adiposo que representan unidades de vascularización prometedores. Se pueden aislar rápidamente, no requieren en el procesamiento vitro y, por tanto, puede ser utilizado para prevascularization de un solo paso en diferentes campos de la ingeniería de tejidos.

Aislamiento de murino tejido adiposo derivado de microvascular Fragmentos como Unidades Vascularización para ingeniería de tejidos

Tejido adiposo blanco (WAT) tiene deficiencias importantes en sus modelos actuales de cultivo primario, que obstaculizan el desarrollo farmacológico y estudios metabólicos. Aquí, presentamos un protocolo para producir un sistema microphysiological adiposo WAT bocadillo entre las hojas de las células estromales. Esta construcción proporciona una plataforma estable y adaptable para cultivo primario de WAT.

Una plataforma de Microphysiologic de grasa humana: intercala tejido adiposo blanco

Debido al contenido alto de lípidos, tejido adiposo ha estado desafiando a visualizar utilizando métodos histológicos tradicionales. Adipo-Clear es un tejido de limpieza técnica que permite etiquetado robusta y alta resolución volumétrica fluorescente la proyección de imagen del tejido adiposo. Aquí, describimos los métodos para la preparación de la muestra, tratamiento previo, tinción, limpieza y montaje para la proyección de imagen.

Adipo-claro: Un tejido claro método de proyección de imagen tridimensional del tejido adiposo

El objetivo del presente estudio es demostrar la técnica de inmunotinción y visualización de conjunto de montaje como un método ideal para la proyección de imagen 3D del componente celular y arquitectura de tejido adiposo.

Visualización de estructura del tejido adiposo blanco 3D utilizando tinción de Whole-mount

Aquí, presentamos microfragmentación libre de enzimas del tejido adiposo humano utilizando un dispositivo de sistema cerrado. Este nuevo método permite la obtención de racimos submilimétricos de tejido adiposo adecuado para el trasplante in vivo, el cultivo in vitro y el aislamiento y caracterización celular adicional.

Microfragmentación de tejido adiposo humano para fenotipado celular y caracterización de secretos

Describimos un sistema de cultivo in vitro de matriz-adipocitos extracelulares humanos 3D que permite la disección de las funciones de la matriz y los adipocitos en contribuir al fenotipo metabólico del tejido adiposo.

Un modelo de cultivo de matriz-adipocitos extracelulares 3D humano para el estudio de la conversación cruzada metabólica Matrix-Cell

Aquí, describimos un método de limpieza simple, barato y rápido para resolver la estructura 3D del tejido adiposo blanco humano y de ratón utilizando una combinación de marcadores para visualizar vasculatura, núcleos, células inmunitarias, neuronas y proteínas de la capa de gotas de lípidos mediante imágenes fluorescentes.

Explorar la estructura del tejido adiposo mediante la limpieza de metilsalicilatos y las imágenes 3D

En este trabajo se describe el aislamiento, cultivo e inducción adipogénica de preadipocitos derivados de la fracción vascular estromal a partir de tejido adiposo periaórtico de ratón, lo que permite estudiar la función del tejido adiposo perivascular y su relación con las células vasculares.

Aislamiento, cultivo e inducción adipogénica de preadipocitos derivados de la fracción vascular estromal a partir de tejido adiposo periaórtico de ratón

Aquí, describimos un protocolo para aislar, cultivar y fenotipar células endoteliales microvasculares a partir de tejido adiposo subcutáneo humano (hSATMVECs). Además, describimos un modelo experimental de diafonía entre hSATMVEC y adipocitos.

Estudio de la diafonía entre células endoteliales adiposas y adipocitos en el tejido adiposo subcutáneo humano

Aprende a cultivar tejido adiposo termogénico vascularizado en 3D a partir de fragmentos microvasculares. Este método simplifica la ingeniería de grasa beige funcional para investigar obesidad y enfermedades metabólicas.

Cultivo tridimensional de tejido adiposo termogénico vascularizado a partir de fragmentos microvasculares

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