Name: Un innovador inserto impreso en 3D diseñado para permitir cultivos celulares sencillos en 2D y 3D (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T13:35:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Aprende a utilizar insertos impresos en 3D para cultivos celulares bidimensionales y tridimensionales. Este método facilita la comunicación paracrina entre queratinocitos y células endoteliales, mejorando la proliferación y migración celular.

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Este estudio se realizó en colaboración con BASF Beauty Care Solutions. La Sra. Charlie Colin-Pierre es becaria de doctorado financiada por BASF / CNRS.
Deseamos agradecer al Sr. Mehdi Sellami por la concepción de los insertos impresos en 3D.

NOTA: Los insertos 3D (Figura 1A) se adquieren comercialmente y se imprimen utilizando una resina fotopolimérica que es biocompatible con el cultivo celular y el autoclave (consulte la Tabla de materiales). En esta sección, se describe un protocolo detallado para establecer el modelo de cocultivo por insertos (ver Figura 1B). También se proporcionan algunos ejemplos de aplicaciones.
1. Colocación del inserto esterilizado en las placas de 6 pocillos
<ol><li>Mezcle los dos componentes suministrados en el kit (consulte la tabla de materiales), silicio alimentario (reactivo A) y catalizador (reactivo B), en una proporción de 10:1 (v/v) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. (Figura 1Ba). Utilice una espátula esterilizada con etanol al 70% para mezclar los dos componentes. NOTA: El volumen de la mezcla de silicona que se va a preparar depende del número de insertos que se van a fijar. Un exceso de catalizador puede hacer que la mezcla de silicio se solidifique demasiado rápido.</li>
	<li>Aplique los insertos sobre la mezcla de silicona con pinzas para que la mezcla se distribuya homogéneamente en el borde inferior de los insertos (Figura 1Bb). Coloque los insertos en los pocillos de una placa de 6 pocillos y aplique una presión suave sobre los insertos para asegurarse de que los insertos estén en estrecho contacto con la placa para evitar cualquier fuga del medio de cultivo celular (Figura 1Bc).</li>
	<li>Coloque la placa a 37 °C para apoyar el proceso de solidificación del silicio durante 1 h. NOTA: El tiempo de solidificación depende de la cantidad de catalizador que se haya agregado.</li>
	<li>Después de la solidificación, esterilice las placas con los insertos sumergiéndolas en un baño de etanol al 70% durante 30 min a 1 h.</li>
	<li>Deseche el alcohol pipeteando y deje que la placa se seque (con la tapa abierta) durante la noche en una campana de cultivo celular. NOTA: El alcohol debe evaporarse completamente antes de realizar el siguiente paso para evitar la fijación celular y la toxicidad. La placa lista para usar que contiene los insertos se puede almacenar durante varios días antes de su uso en condiciones secas y estériles a temperatura ambiente.</li>
</ol>2. Recubrimientos como poli-L-lisina o poli-HEMA (paso opcional)
NOTA: El recubrimiento no se realiza en este experimento, y se proporcionan los pasos para informar sobre la posibilidad de recubrir los insertos.
<ol><li>Prepare la solución de recubrimiento de acuerdo con las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Considere un volumen de 200-400 μL para los compartimentos más grandes y un volumen de 50-100 μL para los compartimentos más pequeños para el recubrimiento del inserto. Agregue la solución de recubrimiento a los compartimentos individuales.</li>
	<li>Deje que el recubrimiento se seque según lo indicado por el fabricante en condiciones estériles.</li>
</ol>3. Siembra de las células
<ol><li>Cultive los queratinocitos de la vaina externa de la raíz (KORS) y las células endoteliales microvasculares dérmicas humanas (HDMEC) según lo recomendado por el fabricante. Prepare la suspensión celular una vez que las células alcancen la confluencia.<ol><li>Deseche el medio de los matraces y agregue 5 mL de tripsina para separar las células (ver Tabla de Materiales).</li>
		<li>Colocar el matraz que contiene el KORS a 37 °C con 5% de CO2 durante 5 min. Incubar el matraz que contiene los HDMEC durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Mezclar la solución de tripsina que contiene el KORS con 5 mL de medio de células madre mesenquimales (MSCM) suplementado con un 5% de suero fetal bovino (FBS) y factores de crecimiento (medio basal con kit de suplementos, ver Tabla de Materiales). Mezclar la solución de tripsina que contiene los HDMEC con 5 mL de medio de células endoteliales (ECM) suplementado con FBS al 5% y factores de crecimiento (ver Tabla de Materiales).</li>
		<li>Transfiera las células a un tubo cónico estéril de 15 ml. Centrifugar las suspensiones KORS y HDMEC a 200 x g durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 2 mL del medio respectivo.</li>
		<li>Mezclar 10 μL de la suspensión celular con 10 μL de colorante azul de tripano (ver Tabla de Materiales).</li>
		<li>Añadir 10 μL de la mezcla en la cámara del portaobjetos de conteo.</li>
		<li>Inserte el portaobjetos de conteo en el sistema de conteo de celdas (consulte la Tabla de materiales) y detecte el número de celdas y la viabilidad.</li>
		<li>Preparar la suspensión celular a una concentración de 0,5 x 105 células/ml en el medio correspondiente. NOTA: Si los diferentes tipos de células requieren diferentes tiempos de adherencia y/o para alcanzar la confluencia ideal, la siembra de células se puede realizar en diferentes puntos de tiempo según los tipos de células.</li>
	</ol></li>
	<li>Distribuya de 800 μL a 1 ml de la suspensión celular en los compartimentos grandes individuales y de 100 a 150 μL en los compartimentos pequeños individuales con una pipeta.<ol><li>Siembre el KORS a 1 x 10 5 células/mL en MSCM suplementado con5% de FBS y factores de crecimiento en uno de los compartimentos grandes.</li>
		<li>HDMEC de semilla en ECM suplementada con 5% de FBS y factores de crecimiento a 2,5 x 103 células/ml en los compartimentos pequeños y a 1,25 x 105 células/ml en el otro compartimento grande. NOTA: El ensayo de proliferación se puede realizar en los compartimentos pequeños, y los ensayos de migración y viabilidad se pueden realizar en los compartimentos grandes. La concentración de las células sembradas se ha optimizado de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Esta concentración permite una buena viabilidad de las células después de 24-48 h de incubación.</li>
	</ol></li>
	<li>Colocar la placa de cultivo celular a 37 °C con 5% de CO2 o en las condiciones habituales para permitir la adhesión y/o maduración celular. NOTA: Incubar las células durante 24-48 h sin cambiar el medio. Si es necesario, el medio de los compartimentos se puede cambiar de forma independiente.</li>
</ol>4. Implementación de la cocultura (Figura 1Bd)
NOTA: La implementación de la co-cultura corresponde al momento en que se agrega el medio común. La adición de un medio único para todos los tipos de células en los diferentes compartimentos proporciona la posibilidad de comunicación paracrina entre las células debido a la presencia de ventanas de comunicación (agujeros ovoides en las paredes de los insertos impresos en 3D). Para implementar la cocultura, siga los pasos 4.1-4.3.
<ol><li>Vacíe los medios de cultivo de los diferentes compartimentos de los insertos con una pipeta. En el caso de un cultivo de células esferoides en 3D, deseche el medio con mucha suavidad.</li>
	<li>Enjuague las células con 1 ml de PBS caliente a 37 °C en los compartimentos grandes y 200 μl de PBS caliente a 37 °C en los compartimentos pequeños. Asegúrese de lavar suavemente para no desprender las células.</li>
	<li>Agregue 3 ml de un medio común seleccionado para ser compatible con todos los tipos de células. NOTA: En este estudio, se utiliza la ECbasal M (sin FBS ni factores de crecimiento). Asegúrese de que el medio cubra todos los compartimentos (nivel por encima de las ventanas de comunicación [agujeros ovoides en las paredes], como se muestra en la Figura 1A).</li>
	<li>Colocar la placa que contiene los cocultivos a 37 °C con 5% de CO2 durante 24-48 h.</li>
</ol>5. Observación, conteo y raspado de células
<ol><li>Observar la morfología y contar el número de células de los diferentes compartimentos durante el experimento bajo un microscopio óptico después de 24-48 h de incubación. NOTA: El número esperado de células depende de los tipos de células utilizadas (tamaño, morfología, etc.) y del tamaño del compartimento. En este experimento, se cuentan entre 0,5 x 10 6-1 x 10 6 KORS/mL y entre 0,25 x 10 6-0,75 x 10 6 HDMECs/mL en los compartimentos grandes.</li>
	<li>Separe las células usando tripsina para el recuento de suspensiones celulares. NOTA: Para la solución de desprendimiento de células, considere un volumen de 100-500 μL para los compartimentos más grandes y un volumen de 10-50 μL para los compartimentos más pequeños.</li>
	<li>Compruebe la viabilidad mediante la tinción con azul de tripano (consulte los pasos 3.1.6-3.1.8).</li>
</ol>6. Limpieza de insertos para reciclaje
<ol><li>Retire los insertos de la placa de 6 pocillos al final del experimento girándolos ligeramente (Figura 1Be).</li>
	<li>Retire la silicona de los insertos tirando de ella. Si es necesario, utilice una espátula para eliminar el silicio restante adherido a las paredes de los insertos (Figura 1Bf).</li>
	<li>Lave los insertos con detergentes convencionales para cultivos celulares y materiales de limpieza (ejemplo proporcionado en la Tabla de materiales).</li>
	<li>Esterilizar los insertos para su uso futuro en autoclave (ciclo sólido, 121 °C durante 20 min) o sumergiéndolos en un baño de etanol al 70% durante 1 h. NOTA: A partir de este paso, se describen dos ejemplos de posibles ensayos (ensayos de proliferación y migración) utilizando los insertos impresos en 3D (Figura 1Bd).</li>
</ol>7. Ensayo de proliferación celular - ensayo WST-1
<ol><li>Siga los pasos 1 a 3.1 para cultivar las células. NOTA: Siga el paso de esta sección para implementar el sistema de cocultivo con el fin de investigar el efecto del secretoma KORS en la proliferación de HDMEC. Las celdas KORS se utilizan para comparar los datos publicados anteriormente8.<ol><li>Siembre el KORS a 1 x 10 5 células/mL en medio de células madre mesenquimales (MSCM) suplementado con5% de FBS y factores de crecimiento en los compartimentos grandes.</li>
		<li>Colocar la placa de cultivo celular a 37 °C con 5% de CO2 durante 24 h.</li>
		<li>Siembrar los HDMECs en medio de células endoteliales (ECM) suplementado con 5% de FBS y factores de crecimiento a 2,5 x 103 células/mL en los compartimentos pequeños.</li>
		<li>Colocar la placa de cultivo celular a 37 °C con 5% de CO2 durante 24-48 h.</li>
		<li>Deseche los medios de todos los compartimentos e implemente el sistema de cocultivo mediante la adición de 3 ml de ECM basal no suplementada (medio de cultivo celular común para todos los compartimentos de los insertos impresos en 3D).</li>
	</ol></li>
	<li>Diluir WST-1 en el medio de cultivo celular común ECM (dilución final 1:10) para preparar la solución de WST-1. NOTA: Para el volumen de solución WST-1, prepare al menos 500 μL de solución adicional para la pieza en bruto.</li>
	<li>Deseche el medio de cultivo celular del inserto mediante pipeteo.</li>
	<li>Añadir la solución WST-1 a los compartimentos seleccionados (150 μL para los compartimentos pequeños y 600 μL para los compartimentos grandes). Poner la placa a 37 °C con 5% de CO2.</li>
	<li>Después del tiempo óptimo de incubación celular de 30 minutos, transfiera 100 μL del medio de incubación de cada condición en una placa de 96 pocillos.</li>
	<li>Evalúe la reacción colorimétrica utilizando un lector de microplacas entre 420 nm y 480 nm.<ol><li>Coloque la placa en el lector de microplacas y haga clic en el botón editar un nuevo protocolo.</li>
		<li>Seleccione el tipo específico de placa de 96 pocillos (consulte la Tabla de materiales) utilizada y la longitud de onda de 450 nm.</li>
		<li>Haga clic en el botón iniciar medición.</li>
	</ol></li>
</ol>8. Ensayo de migración celular: dispositivo de dos cámaras de migración
<ol><li>Siga los pasos 1 a 3.1 para cultivar las células. NOTA: Siga los pasos de esta sección para implementar el sistema de cocultivo con el fin de investigar el efecto del secretoma KORS en la proliferación de HDMEC.<ol><li>Siembre el KORS a 1 x 10 5 células/mL en MSCM suplementado con5% de FBS y factores de crecimiento en uno de los compartimentos grandes.</li>
		<li>Colocar la placa de cultivo celular a 37 °C con 5% de CO2 durante 24 h.</li>
		<li>Coloque el dispositivo de dos cámaras de migración en el otro compartimento grande de insertos.</li>
		<li>Siembre los HDMEC en ECM suplementado con 5% de FBS y factores de crecimiento a 7 x 105 células/pocillo del dispositivo de dos cámaras de migración.</li>
		<li>Colocar la placa de cultivo celular a 37 °C con 5% de CO2 durante 24 h.</li>
		<li>Deseche el medio y el dispositivo de dos cámaras de migración después de 24 h o en un momento óptimo según el tipo de célula que esté migrando. Implementar el sistema de cocultivo mediante la adición de 3 mL de ECM basal no suplementado. NOTA: Proceda con cuidado para no separar las celdas. Si las células son realmente sensibles al desprendimiento inducido por la adición de un medio común, retire el dispositivo de las dos cámaras de migración después de la adición del medio común.</li>
	</ol></li>
	<li>Observe y tome una fotografía de la superficie cubierta por las células en diferentes puntos de tiempo bajo un microscopio de contraste de fase con un aumento de 10x. NOTA: Las imágenes se toman con un microscopio de contraste de fase (ver Tabla de Materiales). Las imágenes se guardan en una llave USB y luego se analizan mediante el complemento de la herramienta de cicatrización de heridas del software (consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Mida la superficie descubierta utilizando un software clásico de análisis cuantitativo.<ol><li>Abra la imagen en el software y active la herramienta de curación de heridas disponible en la lista de macros.</li>
		<li>Haga clic en el botón m para medir la superficie descubierta de la imagen de migración.</li>
		<li>La superficie descubierta se calcula de acuerdo con la siguiente fórmula: Porcentaje de cobertura = ([área media sin células en T0 − área sin células en el tiempo T]/área media sin células en T0) × 100. NOTA: Los insertos impresos en 3D están totalmente adaptados a la mayoría de las técnicas de biología celular (como el ensayo de formación de pseudotubos, cultivos 3D) y para experimentos bioquímicos (como la extracción de ADN, ARN, proteínas).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Regier, M. C., Alarid, E. T., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+towards+understanding+heterotypic+interactions+in+multi-culture+models+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Progress towards understanding heterotypic interactions in multi-culture models of breast cancer.</a> Integrative Biology. 8 (6), 684-692 (2016).</li>
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<li>Colin-Pierre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glypican-1%2FHGF%2FC-met+and+glypican-1%2FVEGF%2FVEGFR2+ternary+complexes+regulate+hair+follicle+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The glypican-1/HGF/C-met and glypican-1/VEGF/VEGFR2 ternary complexes regulate hair follicle angiogenesis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 781172(2021).</li>
<li>Toubal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NC1+domain+of+type+XIX+collagen+inhibits+melanoma+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">The NC1 domain of type XIX collagen inhibits melanoma cell migration.</a> European Journal of Dermatology. 20 (6), 712-718 (2010).</li>
<li>Wu, A. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+growth+factors+and+internal+limiting+membrane+constituents+in+m%C3%BCller+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Role of growth factors and internal limiting membrane constituents in müller cell migration.</a> Experimental Eye Research. 202, 108352(2021).</li>
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<li>Cattin, S., Ramont, L., Rüegg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+in+vivo+validation+of+a+three-dimensional+multi-cellular+culture+model+to+study+heterotypic+interactions+in+colorectal+cancer+cell+growth%2C+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Characterization and in vivo validation of a three-dimensional multi-cellular culture model to study heterotypic interactions in colorectal cancer cell growth, invasion and metastasis.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 97(2018).</li>
<li>Ma, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+spheroid+culture+of+adipose+stromal+vascular+cells+for+studying+adipogenesis+in+beef+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Animal%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional spheroid culture of adipose stromal vascular cells for studying adipogenesis in beef cattle.</a> Animal. 12 (10), 2123-2129 (2018).</li>
</ol>

Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.

La comunicación celular indirecta se investiga comúnmente utilizando medios condicionados o dispositivos de sistemas de cocultivo. La preparación de medios acondicionados requiere mucho tiempo en la fase inicial de los experimentos, y este método se limita a análisis de efectos unilaterales. El estudio previo de Colin-Pierre et al.8 utilizando medios condicionados se llevó a cabo en la comunicación celular indirecta entre dos tipos de células (HDMECs y KORS). Los datos de este estudio pre...

In vivo, las células se comunican entre sí directamente (contacto celular) o indirectamente (mediante la secreción de moléculas). Para estudiar la comunicación celular, se pueden desarrollar diferentes modelos de cocultivo, como el cocultivo directo (los diferentes tipos de células están en interacción directa en el mismo pocillo) y el cocultivo compartimentado (los diferentes tipos de células están en interacción indirecta en diferentes compartimentos de un sistema de cultivo)1. Además, los medios condicionados se pueden utilizar para sistemas de cocultivo, donde la interacción indirecta es posible gracias a las moléculas secretadas contenidas en el medio condicionado de un tipo de célula efectora que se transfiere a una célula respondedora tipo1.
En el caso de los estudios de comunicación celular paracrina, los sistemas de cocultivo indirecto proporcionan modelos que reflejan fuertemente las interacciones celulares in vivo. Se han desarrollado y comercializado sistemas de cocultivo indirecto, lo que ha permitido el establecimiento de modelos de cocultivo indirecto 2,3. Desafortunadamente, la mayoría de los sistemas de cocultivo indirecto proporcionan solo dos compartimentos. Otros sistemas de cocultivo indirecto proporcionan múltiples compartimentos, pero son menos escalables en comparación con el sistema reportado en el presente manuscrito. Algunos de ellos no permiten una visualización clásica bajo un microscopio, y a menudo presentan métodos de aplicación específicos. En varios estudios, la comunicación paracrina entre diferentes tipos celulares es probada por el modelo de medios condicionados 4,5,6,7. Esta es una forma más fácil de investigación en comparación con los sistemas de cocultivo indirectos, ya que no requiere que se establezcan métodos o materiales específicos1. Por otro lado, la preparación de medios acondicionados requiere mucho tiempo y proporciona información solo sobre la señalización celular unidireccional (efector a respondedor)1.
En este trabajo se propone una nueva y sencilla forma de investigar la comunicación celular. Al permitir la combinación de varios tipos de células en interacción directa o indirecta y en formatos 2D o 3D, los insertos impresos presentan numerosas ventajas para configurar fácilmente modelos de cocultivo. Adaptado para ser colocado en los pocillos de las placas de 6 pocillos, el inserto impreso en 3D es circular y permite la separación del pocillo en cuatro compartimentos (dos compartimentos grandes y dos compartimentos pequeños; Figura 1A). Las inserciones impresas en 3D se caracterizan por la ausencia de fondo. Por lo tanto, las células están en contacto directo con la placa sobre la que se coloca el inserto. Además, cada compartimento se puede revestir independientemente de los demás. Además, el comportamiento de la célula se puede seguir fácilmente bajo microscopios ópticos. La presencia de ventanas de comunicación en cada pared del inserto permite la adición, en el momento óptimo, de un medio común para realizar diferentes experimentos de co-cultivo. Se pueden realizar numerosas combinaciones de cocultivo para estudiar la comunicación directa y/o indirecta entre varios tipos de células. Por ejemplo, se puede diseñar un modelo de cocultivo indirecto entre cuatro tipos celulares diferentes en monocapa y/o en 3D (esferoides). También se puede realizar una combinación de modelos de cocultivo directo e indirecto mezclando diferentes tipos de células en el mismo compartimento. El efecto de estructuras complejas (organoides, explantes de tejidos, etc.) sobre diferentes tipos celulares podría ser otro ejemplo de modelos que se pueden realizar. Además, los insertos impresos en 3D son compatibles con ensayos funcionales de biología celular (proliferación, migración, formación de pseudotubos, diferenciación, etc.) y con pruebas bioquímicas (extracción de ADN, ARN, proteínas, lípidos, etc.). Por último, los insertos impresos en 3D proporcionan una amplia gama de esquemas experimentales de modelos de cocultivo con la posibilidad de combinar simultáneamente diferentes ensayos en el mismo experimento en los diferentes compartimentos.
Se presentan algunas capacidades de los insertos impresos en 3D para validarlos como un modelo de cocultivo rápido y fácil de usar. En comparación con un estudio publicado anteriormente realizado sobre la comunicación de células paracrinas, se demuestra la capacidad de los insertos impresos en 3D para ser un valioso modelo de cocultivo. Para evaluar este punto, se comparó la regulación de la proliferación y migración de células endoteliales por queratinocitos entre el sistema de insertos impresos en 3D y el sistema clásico que utiliza medios acondicionados. Los insertos impresos en 3D permiten obtener resultados similares rápidamente en comparación con el sistema convencional que utiliza medios acondicionados. De hecho, los insertos impresos en 3D proporcionan un modelo robusto para estudiar las interacciones celulares en ambas direcciones sin la necesidad de producir medios acondicionados y con la posibilidad de realizar en paralelo los ensayos de proliferación y migración en el mismo experimento.
Para concluir, en este trabajo se propone un modelo nuevo y listo para usar para estudiar la comunicación celular. Compatibles con todos los tipos de células adherentes, los insertos impresos en 3D permiten realizar numerosas combinaciones de cocultivo que tienen como objetivo acercarse más a las condiciones in vivo .

<table><tbody><tr><td>Autoclave</td><td>Getinge</td><td>APHP</td><td>Ciclo sólido, 121 &deg; C durante 20 min</td></tr><tr><td>Biomed Clear</td><td>Formlabs</td><td>RS-F2-BMCL-01</td><td>Impresión realizada por la empresa 3D-Morphoz (Reims, Francia)</td></tr><tr><td>Detergentes para cultivos celulares&nbsp;</td><td>Tounett</td><td>A18590/0116</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de proliferación celular WST-1</td><td>Roche</td><td>11,64,48,07,001</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de conteo</td><td>NanoEnTek</td><td>EVE-050</td><td></td></tr><tr><td>Culture-Insert 2 Pocillo en &mu;-Dish 35 mm</td><td>Ibidi</td><td>80206</td><td>dispositivo de dos cámaras de migración.&nbsp;</td></tr><tr><td>Medio de células endoteliales</td><td>ScienCell</td><td>1001</td><td>Medio basal +/- 25 mL de suero fetal bovino (FBS, 0025), 5 mL de suplemento de crecimiento de células endoteliales (ECGS, 1052) y 5 mL de solución de penicilina/estreptomicina (P/S, 0503).</td></tr><tr><td>EVE Contador de células automatizado&nbsp;</td><td>NanoEnTek</td><td>NESCT-EVE-001E&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>EVOS XL Core</td><td>Fisher Scientific AMEX1200</td><td></td><td>10x de aumento Kit de</td></tr><tr><td>reactivos y catalizadores de silicio alimentario</td><td>Artificina</td><td>RTV 3428 A y B&nbsp;</td><td>(10:1)</td></tr><tr><td>Impresora FORM 3B</td><td>Formlabs</td><td>PKG-F3B-WSVC-DSP-BASIC</td><td>Impresión realizada por la empresa 3D-Morphoz</td></tr><tr><td>Células endoteliales microvasculares dérmicas humanas (HDMEC)</td><td>ScienCell</td><td>2000</td><td></td></tr><tr><td>Queratinocitos de la vaina radicular externa (KORS)</td> <td>ScienCell</td><td>2420</td><td></td></tr><tr><td>Macro Wound Healing Tool Software</td><td>ImageJ</td><td></td><td>Software utilizado para la medición de la superficie descubierta (para ensayos de migración)</td></tr><tr><td>Medio de células madre mesenquimales&nbsp;</td><td>ScienCell</td><td>7501</td><td>Medio basal +/-25 mL de suero fetal bovino (FBS, 0025), 5 mL de suplemento de crecimiento de células madre mesenquimales (MSCGS, 7552) y 5 mL de solución de penicilina/estreptomicina (P/S, 0503)</td></tr><tr><td>Lector de microplacas SPECTRO star NANO</td><td>BMG Labtech</td><td>BMG LABTECH</td><td></td> software</tr><tr><td>PBS</td><td>Promocell</td><td>C-40232</td><td>Sin Ca2+ / Mg2+</td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain</td><td>NanoEnTek</td><td>EBT-001</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina / EDTA</td><td>Promocell</td><td>C-41020</td><td>Incubación de KORS a 37 &deg; C con 5% de CO2 durante 5 min. Incubación de HDMEC durante 5 min a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Placa de 96 pocillos Nunclon Delta Surface</td><td>Thermoscientific 167008</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un innovador inserto impreso en 3d diseñado para permitir cultivos celulares sencillos en 2d y 3d

An Innovative 3D-Printed Insert Designed to Enable Straightforward 2D and 3D Cell Cultures

Los análisis clásicos de la comunicación indirecta entre diferentes tipos de células requieren el uso de medios condicionados. Además, la producción de medios acondicionados sigue consumiendo mucho tiempo y está lejos de las condiciones fisiológicas y patológicas. Aunque algunos modelos de cocultivo están disponibles comercialmente, siguen estando restringidos a ensayos específicos y son principalmente para dos tipos de células. 
En este caso, se utilizan insertos impresos en 3D que son compatibles con numerosos ensayos funcionales. El inserto permite la separación de un pocillo de una placa de 6 pocillos en cuatro compartimentos. Se puede configurar una amplia gama de combinaciones. Además, se han diseñado ventanas en cada pared de los compartimentos para que sea posible la comunicación intercelular potencial entre cada compartimento en el medio de cultivo de forma dependiente del volumen. Por ejemplo, la comunicación intercelular paracrina se puede estudiar entre cuatro tipos de células en monocapa, en 3D (esferoides) o combinando ambas. Además, se puede sembrar una mezcla de diferentes tipos de células en el mismo compartimento en formato 2D o 3D (organoides). La ausencia de fondo en los insertos impresos en 3D permite las condiciones habituales de cultivo en la placa, posible recubrimiento en la placa que contiene el inserto y visualización directa mediante microscopía óptica. Los múltiples compartimentos ofrecen la posibilidad de recoger diferentes tipos de células de forma independiente o de utilizar, en cada compartimento, diferentes reactivos para la extracción de ARN o proteínas. En este estudio, se proporciona una metodología detallada para utilizar el nuevo inserto impreso en 3D como sistema de co-cultivo. Para demostrar varias capacidades de este modelo flexible y simple, se realizaron ensayos funcionales de comunicación celular publicados anteriormente en los nuevos insertos impresos en 3D y se demostró que eran reproducibles. Los insertos impresos en 3D y el cultivo celular convencional con medios acondicionados condujeron a resultados similares. En conclusión, el inserto impreso en 3D es un dispositivo sencillo que se puede adaptar a numerosos modelos de cocultivos con tipos celulares adherentes.

En el presente trabajo se describió un sistema de cocultivo optimizado para obtener datos robustos, confiables y significativos comparables a los métodos clásicos mediante el uso de medios condicionados. Los insertos impresos en 3D imitan las condiciones microambientales in vivo de diferentes tipos de células en interacción al superar las dificultades y la producción de medios acondicionados que consumen mucho tiempo antes de los experimentos. Un estudio publicado anteriormente ha sido rerealizado para analizar ...

En este trabajo, se presenta un inserto impreso en 3D de nuevo diseño como modelo de cocultivo y se valida mediante el estudio de la comunicación intercelular paracrina entre las células endoteliales y los queratinocitos.

Un innovador inserto impreso en 3D diseñado para permitir cultivos celulares sencillos en 2D y 3D

The classical analyses of indirect communication between different cell types necessitate the use of conditioned media. Moreover, the production of ...

Este protocolo se puede utilizar para investigar numerosos estudios de cultivo y proporcionar una nueva herramienta para investigar la comunicación celular directa. Este nuevo dispositivo ahorra mucho tiempo en el establecimiento de un modelo de cultivo y es aplicable a diferentes tipos de células que requieren un recubrimiento específico o no. De hecho, los cuatro compartimentos de los insertos impresos en 3D permiten cultivar diferentes tipos de células en monocapa o en 3D de la misma manera con diferentes combinaciones.Los insertos impresos en 3D son más duraderos, flexibles, escalables y se pueden utilizar para diseñar modelos experimentales para el estudio de fisiopatologías, como la inmunología o la androgénesis. Para comenzar, mezcle los dos componentes, silicio alimentario y catalizador provistos en el kit en una proporción de 10:1, utilizando una espátula esterilizada con etanol al 70% de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Aplique los insertos sobre la mezcla de silicona con pinzas para que la mezcla se distribuya homogéneamente en el borde inferior del inserto.Coloque los insertos en los pocillos de una placa de seis pocillos y aplique una presión suave para asegurarse de que los insertos estén en estrecho contacto con la placa para evitar cualquier fuga del medio de cultivo celular. Coloque la placa a 37 grados centígrados para apoyar el proceso de solidificación del silicio durante una hora. Después de la solidificación, esterilice las placas con los insertos sumergiéndolas en un baño de etanol al 70% durante 30 minutos a una hora.A continuación, deseche el alcohol mediante pipeteo y deje que la placa se seque durante la noche en una campana de cultivo celular. Para cultivar los queratinocitos de la vaina externa de la raíz y las células endoteliales microvasculares dérmicas humanas, deseche el medio de los matraces y agregue cinco mililitros de tripsina para separar las células. Colocar el matraz que contiene los queratinocitos de la vaina externa de la raíz a 37 grados centígrados con dióxido de carbono al 5% durante cinco minutos, e incubar el matraz que contiene las células endoteliales microvasculares dérmicas humanas durante cinco minutos a temperatura ambiente.En un tubo cónico estéril de 15 mililitros, mezclar la solución de tripsina que contiene los queratinocitos de la vaina radicular externa con cinco mililitros de medio de células madre mesenquimales suplementado con 5% de FBS y factores de crecimiento y las células endoteliales microvasculares dérmicas humanas con cinco mililitros de medio de células endoteliales suplementado con 5% de FBS y factores de crecimiento. Centrifugar los queratinocitos de la vaina radicular externa y las suspensiones de células endoteliales microvasculares dérmicas humanas a 200 G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de desechar el sobrenadante, resuspenda las células en dos mililitros de sus respectivos medios.Mezcle 10 microlitros de la suspensión celular con 10 microlitros de tinte azul de tripán y agregue 10 microlitros de la mezcla en la cámara del portaobjetos de conteo. Inserte el portaobjetos de conteo en el sistema de conteo de celdas y detecte el número de celdas y la viabilidad. Después de preparar la suspensión celular a una concentración de 50.000 células por mililitro en el medio respectivo, distribuya 800 microlitros a un mililitro de la suspensión celular en los compartimentos grandes individuales, y de 100 a 150 microlitros en los compartimentos pequeños individuales con una pipeta.Vea los queratinocitos en medio de células madre mesenquimales suplementadas con 5% de FBS y factores de crecimiento y células endoteliales microvasculares dérmicas humanas en medio de células endoteliales, suplementadas con 5% de FBS y factores de crecimiento en los compartimentos pequeños y otros grandes. Coloque la placa de cultivo celular a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono, o en las condiciones habituales, para permitir la adhesión y/o maduración celular. Vacíe los medios de cultivo de los diferentes compartimentos de los insertos con una pipeta.A continuación, enjuague las células con un mililitro de PBS tibio a 37 grados centígrados en los compartimentos grandes y 200 microlitros en los compartimentos pequeños. Agregue tres mililitros de un medio común seleccionado para ser compatible con todos los tipos de células. Colocar la placa que contiene los cocultivos a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante 24 a 48 horas.Separe las células con tripsina para el recuento de suspensiones celulares y verifique la viabilidad con tinción con azul de tripano. Después de observar la morfología, cuente el número de células de los diferentes compartimentos durante el experimento bajo un microscopio óptico después de 24 a 48 horas de incubación. Primero, retire los insertos de la placa de seis pocillos al final del experimento con un ligero giro y luego retire el silicio de los insertos tirando de él.Lave los insertos con detergentes convencionales para cultivos celulares y materiales de limpieza. A continuación, esterilice los insertos para su uso futuro en un autoclave, o sumergiéndolos en un baño de etanol al 70% durante una hora. Se comparó el fenotipo y la viabilidad celular, donde se observó un 90% de viabilidad en los pocillos de las seis placas de pocillos, y un 91% en los insertos impresos en 3D para queratinocitos de la vaina radicular externa.La viabilidad de las células endoteliales microvasculares dérmicas humanas fue del 85% en los pocillos de la placa de seis pocillos, mientras que del 86% en los insertos impresos en 3D. Las comunicaciones celulares indirectas entre los queratinocitos y las células endoteliales en los insertos impresos en 3D demostraron que, en presencia de queratinocitos en los insertos, la proliferación de las células endoteliales microvasculares dérmicas humanas aumentó significativamente 1,5 veces después de 24 horas, y 3,1 veces después de 48 horas en comparación con el control. Sin embargo, se demostró que el queratinocito del medio de condición de la vaina radicular externa aumenta significativamente la proliferación de células endoteliales microvasculares dérmicas humanas en 1,5 veces después de 24 horas y en 2,1 veces después de 48 horas.Se probó el modelo de cocultivo de insertos impresos en 3D para determinar el efecto de los queratinocitos en la migración de células endoteliales microvasculares dérmicas humanas. En la condición de control, las células endoteliales migraron y cubrieron aproximadamente el 44% del área de la herida después de 24 horas. En presencia de queratinocitos, se observó un aumento significativo en la migración de células endoteliales microvasculares dérmicas humanas, lo que muestra que el 43%, 67% y 99% del área de la herida se cubrió después de tres, 12 y 24 horas respectivamente.Del mismo modo, la migración de HDMECs aumenta en presencia de queratinocitos del medio de condición de la vaina radicular externa. Es crucial asegurar el sellado del inserto a la placa, para evitar la fuga del medio de las células de un compartimento a otro. Se podrían realizar varias aplicaciones, como ensayos de proliferación, migración, formación de sedantes, análisis de ADN, ARN, proteínas y otros.

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Describimos una plataforma basada en el chip para el cultivo en tres dimensiones de las células de micro-biorreactores. Un chip puede albergar hasta 10 millones de euros. células que pueden ser cultivadas bajo condiciones definidas con precisión en lo que respecta al flujo de fluidos, etc tensión de oxígeno en un asa estéril, cerrado de circulación.

Basada en el chip tridimensional de cultivo celular en perfundido Micro-biorreactores

Se presenta un dispositivo y un nuevo método para estudiar las células y embriones. Las células individuales se ordenan precisamente en matrices microcavidad. Su confinamiento en 3D es un paso hacia entornos 3D se encuentran en condiciones fisiológicas y permite la orientación orgánulo. Mediante el control de la forma celular, esta configuración reduce al mínimo la variabilidad reportado en ensayos estándar.

Ordenando las células individuales y solo los embriones en 3D Confinamiento: un nuevo dispositivo para la selección de alto contenido

En organismos multicelulares, los factores solubles secretados provocan respuestas de diferentes tipos de células como resultado de la señalización paracrina. Los sistemas de cocultivo de insertos ofrecen una forma sencilla de evaluar los cambios mediados por los factores solubles secretados en ausencia de contacto célula-célula.

Desarrollo de un Sistema de inserción Co-cultivo de dos tipos celulares en ausencia de la célula-célula Contacto

Aquí, describimos un protocolo rápido y flexible para la formación de esferoides celulares 3D a través de la agregación celular. Se adapta fácilmente a múltiples tipos de células y es adecuado para su uso en una variedad de aplicaciones, incluidos los ensayos de migración celular, invasión o anoikis, y para obtener imágenes y cuantificar las interacciones célula-matriz.

Un método de agregación celular eficiente y flexible para esferoide 3D Producción

Este protocolo describe una plataforma para la fabricación de anillos de tejido automático montado en tamaños variables utilizando un molde de plástico modificado para requisitos particulares impresa en 3D. Negativos PDMS se curan en el molde impreso en 3D; agarosa se echa entonces en los negativos PDMS curados. Las células se siembran en los pozos de agarosa resultante donde agregan en anillos de tejido.

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Hemos desarrollado un modelo de cáncer de mama heterogéneos consistiendo en las células fibroblastos y tumor inmortalizadas encajadas un bioink de alginato/gelatina de bioprintable. El modelo recoge el microambiente tumoral de en vivo y facilita la formación de esferoides multicelulares tumor, dando la penetración en los mecanismos de conducción tumorigenesis.

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Celular 3D inicial grupo Control en un dispositivo híbrido Gel cubo para formaciones de patrón repetible

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Aprende a utilizar insertos impresos en 3D para cultivos celulares bidimensionales y tridimensionales. Este método facilita la comunicación paracrina entre queratinocitos y células endoteliales, mejorando la proliferación y migración celular.

Un innovador inserto impreso en 3D diseñado para permitir cultivos celulares sencillos en 2D y 3D

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