Name: Uso de microscopía de expansión para agrandar físicamente embriones de Drosophila de montaje completo para obtener imágenes de superresolución (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Aprende microscopía de expansión para obtener imágenes de superresolución en embriones de Drosophila sin equipos especializados. Este protocolo permite estudiar la localización proteica y la morfología celular con microscopio confocal estándar.

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Nos gustaría agradecer a la Dra. Jennifer Zallen por proporcionar el anticuerpo primario anti-Par-3 para conejillos de indias. Este trabajo contó con el apoyo de una generosa financiación (1R15GM143729-01 y 1P20GM139768-01 5743) del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (NIGMS), uno de los miembros de los Institutos Nacionales de Salud (NIH), así como del Instituto de Biociencias de Arkansas (ABI), que proporcionó fondos parciales para la compra de nuestro microscopio confocal.

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Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Desvitelinización manual La mayoría de los protocolos de fijación de embriones de Drosophila implican la eliminación de la membrana vitelina mediante la agitación de los embriones fijados en una emulsión de metanol y heptano, lo que hace que las membranas se rompan a través de la ruptura osmótica26. Si bien la desvitelinización a base de metanol (estallido de metanol) es efectiva y apropiada para muchas aplicaciones, la desvitelinización manual (pelado a mano) ofrece algunas ventajas significativas. En primer lugar, el pelado manual permite elegir embriones en etapas precisas para desvellinizar y recolectar, lo que aumenta en gran medida la probabilidad de obtener embriones expandidos en una orientación utilizable al final del experimento. Este enriquecimiento es fundamental cuando se estudian aspectos específicos de los procesos de desarrollo rápido (por ejemplo, la invaginación del mesodermo o la extensión convergente), para los cuales los embriones en estadios apropiados pueden representar solo un pequeño porcentaje de todos los embriones, incluso dentro de una ventana de recolección de tiempo apretado. Por supuesto, para muchas aplicaciones, el estallido más tradicional de metanol a granel de embriones desde una ventana de recolección cronometrada será suficiente, y es posible que el peeling a mano no valga la pena el esfuerzo adicional. En segundo lugar, la unión de ciertos anticuerpos primarios y colorantes se ve afectada negativamente por la exposición previa de la muestra al metanol. Por esta razón, el peeling manual puede producir aumentos significativos en la calidad de la señal de inmunofluorescencia en comparación con las muestras reventadas con metanol, lo que lo convierte en una técnica general útil para los biólogos del desarrollo de Drosophila .
Microscopía confocal de alta resolución en embriones expandidos de Drosophila de montaje entero Si bien la realización de microscopía confocal de alta resolución en muestras expandidas es conceptualmente la misma que en muestras no expandidas, ExM presenta algunos obstáculos técnicos. En particular, la orientación del embrión, que es aleatoria, se vuelve aún más importante a medida que aumenta el tamaño de la muestra, porque los objetivos de gran aumento y alta NA solo pueden enfocar la luz de las regiones de la muestra que están muy cerca del cubreobjetos27. Por lo tanto, por lo general, solo es posible enfocarse en las células en o cerca de la superficie del embrión que terminaron adyacentes al cubreobjetos cuando se formó el gel. La mejor manera de asegurarse de que haya especímenes de la orientación correcta al final es comenzar el protocolo ExM con una colección de embriones fijos en etapas compactas (p. ej., mediante el uso de pelado manual) y sembrar muchos embriones en cada pocillo (>10). Para visualizar las células en las profundidades del interior del embrión, puede ser necesario utilizar configuraciones de imagen más especializadas, como la microscopía de lámina de luz28. Además, encontramos que la calidad de la imagen se puede mejorar abriendo el orificio confocal a un tamaño mayor que una unidad aireada. Por supuesto, un aumento en el tamaño de un agujero de alfiler se producirá a costa de una disminución de la resolución máxima, pero en la práctica, incluso pequeños aumentos en el tamaño del agujero de alfiler pueden aumentar significativamente la intensidad de la señal (datos no mostrados). Los estudios futuros deben abordar sistemáticamente el tamaño del agujero de alfiler y la resolución efectiva en muestras ExM.
Variaciones de la ExM básica El protocolo descrito aquí es un ejemplo relativamente simple de ExM que debería funcionar para muchas aplicaciones y ser fácil de implementar en la mayoría de los laboratorios de biología del desarrollo. Sin embargo, existen numerosas variaciones sobre el concepto básico de ExM 4,5,7 que se pueden utilizar para aumentar la intensidad de la señal, lograr grados aún mayores de expansión y detectar moléculas de ácidos nucleicos y proteínas. En este protocolo, los embriones se incuban con anticuerpos antes de la gelificación y expansión. Alternativamente, las muestras pueden ser tratadas con anticuerpos después de que se expanden 6,30, lo que puede aumentar la intensidad de la señal debido a una mayor accesibilidad a los epítopos y una menor pérdida de anticuerpos unidos durante los pasos de expansión. Además, se pueden utilizar moléculas reticulantes específicas para unir moléculas de ARN al hidrogel para permitir la detección de ARN en geles expandidos utilizando el método de reacción en cadena de hibridación30. Por último, las muestras pueden someterse a múltiples rondas de expansión, como en la microscopía de expansión iterativa (iExM)31, pan-ExM32 y la expansión reveladora (ExR)31, para lograr grados aún más altos de mayor resolución.

En biología celular y del desarrollo, ver para creer, y la capacidad de determinar con precisión los patrones de localización de las proteínas es fundamental para muchos tipos de experimentos. La microscopía confocal de barrido láser es la herramienta estándar para obtener imágenes de proteínas marcadas con fluorescencia en tres dimensiones dentro de muestras intactas. Los microscopios confocales convencionales son incapaces de distinguir (resolver) señales fluorescentes adyacentes que están separadas por menos de la mitad de la longitud de onda de la luz que emiten1. En otras palabras, dos fuentes puntuales deben estar separadas por al menos 200-300 nm en la dirección lateral (500-700 nm en la dirección axial) para resolverlas como dos señales distintas. Esta barrera técnica se conoce como límite de difracción, y es un obstáculo fundamental para los estudios de estructuras subcelulares complejas (por ejemplo, las redes citoesqueléticas o mitocondriales de actomiosina) con características espaciales por debajo del límite de difracción. Por lo tanto, las técnicas para aumentar el poder de resolución de los microscopios confocales convencionales son de interés general para la comunidad biológica.
Para eludir el límite de difracción, se han desarrollado una serie de diferentes tecnologías de microscopía de superresolución que permiten una resolución del orden de decenas de nanómetros o menos 1,2,3, revelando un mundo de complejidad biológica que antes solo era accesible a través de la microscopía electrónica. A pesar de las ventajas obvias de estos métodos basados en hardware, los microscopios de superresolución a menudo tienen requisitos específicos de etiquetado de muestras y largos tiempos de adquisición, lo que limita su flexibilidad, o simplemente pueden ser demasiado costosos para que algunos laboratorios accedan a ellos. Una alternativa a la superresolución basada en microscopios es la microscopía de expansión (ExM), que no es un tipo de microscopía per se, sino más bien un método para hinchar una muestra preservando la organización espacial relativa de sus moléculas constituyentes4. Las muestras expandidas isotrópicamente se pueden observar a una resolución efectivamente aumentada utilizando un microscopio confocal de fluorescencia tradicional. ExM fue descrito por primera vez por el grupo de Boyden en 20155, y desde entonces la técnica básica se ha adaptado para su uso en una variedad de experimentos 6,7,8. ExM también se ha adaptado para su uso en embriones de montaje completo, especialmente en Drosophila 9,10,11, C. elegans12 y pez cebra 13, lo que lo convierte en una poderosa herramienta para los biólogos del desarrollo.
ExM se basa en dos químicas de hidrogel diferentes: 1) hidrogeles de polielectrolito hinchables, que aumentan considerablemente de tamaño cuando se sumergen en agua14, y 2) hidrogeles de poliacrilamida, que tienen un espaciado de polímero extremadamente pequeño para permitir la expansión isotrópica de la muestra15. Si bien hay muchos protocolos ExM publicados, generalmente comparten los siguientes pasos: fijación de la muestra, etiquetado, activación, gelificación, digestión y expansión4. Por supuesto, las condiciones de fijación y las estrategias de marcaje con fluorescencia variarán en función de las necesidades del experimento y del sistema, y en algunos protocolos, el marcaje se produce después de la expansión. Las moléculas objetivo de la muestra deben cebarse (activarse) para unirse al hidrogel, lo que puede lograrse utilizando diferentes productos químicos4. Durante las etapas de gelificación, la muestra se satura con monómeros del futuro hidrogel (acrilato de sodio, acrilamida y el reticulante bisacrilamida), y el hidrogel se forma por polimerización de radicales libres catalizada por un iniciador, como el persulfato de amonio (APS), y un acelerador, como la tetrametilendiamina (TEMED)4. Después de la gelificación, la muestra se digiere enzimáticamente para homogeneizar la resistencia de la muestra al hinchamiento y asegurar la expansión isotrópica del hidrogel4. Finalmente, el hidrogel digerido se coloca en agua, lo que hace que se expanda hasta aproximadamente cuatro veces su tamaño lineal original4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64662/64662fig01v2.jpg"> Figura 1: Visión general de la microscopía de expansión en embriones de Drosophila . ExM es un protocolo de varios pasos que tarda al menos 4 días en completarse. La recolección, fijación y devitellinización de embriones tarda 1 día o más, dependiendo de si se agrupan embriones de múltiples colecciones. El marcaje de inmunofluorescencia tarda 1 o 2 días, dependiendo de si los embriones se incuban durante la noche con los anticuerpos primarios. La activación, gelificación, digestión y expansión embrionaria se puede realizar en un solo día. Los geles se pueden montar y obtener imágenes inmediatamente después de la expansión, aunque por razones prácticas a menudo es deseable comenzar a obtener imágenes al día siguiente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64662/64662fig01largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Este protocolo describe cómo realizar ExM en embriones de Drosophila de montaje completo en etapa temprana a media16 para visualizar los patrones de localización de proteínas subcelulares a superresolución (Figura 1). Este método utiliza la química del éster N-hidroxisuccinimidil del ácido metilacrílico (MA-NHS) para activar y anclar las moléculas de proteína al hidrogel17, y es una modificación de un protocolo ExM publicado anteriormente para su uso en embriones y tejidos de Drosophila en etapa tardía11. Este protocolo utiliza pocillos de polidimetilsiloxano (PDMS) para moldear los hidrogeles y facilitar el intercambio de soluciones durante la activación y gelificación. Un método alternativo que no requiere la creación de pocillos de PDMS consiste en bajar los embriones adheridos a los cubreobjetos en gotas de solución de monómero que se encuentran sobre un trozo de película de sellado de laboratorio22. Además, este protocolo describe un método para eliminar manualmente la membrana vitelina impermeable que rodea a los embriones de Drosophila , que es un requisito previo para la tinción de inmunofluorescencia. Es importante destacar que este método de pelado manual de embriones se puede utilizar para seleccionar solo embriones de Drosophila en etapas adecuadas antes del etiquetado de la muestra, lo que aumenta en gran medida la probabilidad de terminar con muestras expandidas de la etapa y orientación correctas y, por lo tanto, hace que la recopilación de datos posteriores sea mucho más eficiente.

<table><tbody><tr><td>acrilamida</td><td>Milipore Sigma</td><td>1490-100ML</td><td></td></tr><tr><td>persulfato de amonio</td><td>VWR</td><td>BDH9214-500G</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo policlonal anti-GFP para conejos</td><td>Torrey Pines BioLabs</td><td>TP-401</td><td></td></tr><tr><td>anti-conejillo de indias IgG anticuerpo policlonal de cabra, Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11075</td><td></td></tr><tr><td>anti-conejo Anticuerpo policlonal IgG de cabra, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>bisacrilamida</td><td>Research Products International</td><td>A11275</td><td></td></tr><tr><td>albúmina sérica bovina (solución al 30%)</td><td>Millipore Sigma</td><td>A7284</td><td></td></tr><tr><td>tubos cónicos, 50 mL</td><td>fisherscientific&nbsp;</td><td>21008-940</td><td></td></tr><tr><td>Cubrelabios, cuadrado 22 mm</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos, rectangular 40 mm x 24 mm</td><td>VWR</td><td>48393-230</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidrio para extraer agujas World</td><td>Precision Instruments</td><td>TW100F-4</td><td></td></tr><tr><td>agujas de microinyección de vidrio (pretiradas)</td><td>World Precision Instruments</td><td>TIP10LT</td><td></td></tr><tr><td>guanidina HCl</td><td>VWR</td><td>101970-606</td><td></td></tr><tr><td>heptano</td><td>VWR</td><td>EM-HX0078-1</td><td></td></tr><tr><td>bombillas de pipeta de látex</td><td>VWR</td><td>82024-554</td><td></td></tr><tr><td>metanol</td><td>VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td></td></tr><tr><td>ácido metilacílico éster N-hidroxisuccinimimidil</td><td>VWR</td><td>730300-1G</td><td></td></tr><tr><td>, tubo de microfuga 1,5 mL</td><td>VWR</td><td>20170-038</td><td></td></tr><tr><td>placa multipocillo, 6 pocillos</td><td>Genesee</td><td>25-100</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehído (16 %, grado EM, sin metanol)</td><td>Microscopía electrónica Sciences</td><td>509804487 (Fisher)</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur (2 mL, punta corta)</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td></td></tr><tr><td>Kit PDMS (Sylgard 184 Kit, base y agente de curado)</td><td>VWR</td><td>102092-312</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Genesee</td><td>32-107</td><td></td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato (solución 10x)</td><td>VWR</td><td>97063-660</td><td></td></tr><tr><td>Solución de poli-L-lisina (solución al 0,1%)</td><td>VWR</td><td>P8920-1ooML</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E00491</td><td></td></tr><tr><td>viales de centelleo (30 mL)</td><td>VWR</td><td>66022-128</td><td></td></tr><tr><td>acrilato de sodio</td><td>VWR</td><td>101181-226</td><td></td></tr><tr><td>azida de sodio ( </td><td>Millipore Sigma</td><td>71289</td><td>produce un 1% p/v de material de trabajo; ¡VENENO agudo a esta concentración!</td></tr><tr><td>Estreptavidina, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S32354</td><td></td></tr><tr><td>TAE (50x)</td><td>Cinta VWR</td><td>97063-692</td><td></td></tr><tr><td>(doble cara, 1 pulgada de ancho)</td><td>Scotch&nbsp; 3M</td><td>665 Scotch doble cara 1 pulgada/1296 pulgadas TEMED en caja</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI17919</td><td></td></tr><tr><td>TEMPO</td><td>VWR</td><td>EM8.14681.0005</td><td>oxidante catalítico</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>VWR</td><td>97063-872</td><td>extremadamente viscoso cuando está puro; haga un 10% de material de trabajo con agua</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 900</td><td>Microscopio de barrido láser</td> <td>Zeiss</td><td></td> utilizado sin AiryScan</tr></tbody></table>

uso de microscopía de expansión para agrandar físicamente embriones de drosophila de montaje completo para obtener imágenes de superresolución

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

El caballo de batalla de la biología del desarrollo es el microscopio confocal, que permite a los investigadores determinar la localización tridimensional de moléculas marcadas dentro de muestras biológicas complejas. Mientras que los microscopios confocales tradicionales permiten resolver dos fuentes puntuales fluorescentes adyacentes situadas a unos pocos cientos de nanómetros de distancia, la observación de los detalles más finos de la biología subcelular requiere la capacidad de resolver señales del orden de decenas de nanómetros. Se han desarrollado numerosos métodos basados en hardware para la microscopía de superresolución que permiten a los investigadores eludir estos límites de resolución, aunque estos métodos requieren microscopios especializados que no están disponibles para todos los investigadores. Un método alternativo para aumentar el poder de resolución es agrandar isotrópicamente la propia muestra a través de un proceso conocido como microscopía de expansión (ExM), que fue descrito por primera vez por el grupo de Boyden en 2015. ExM no es un tipo de microscopía per se , sino más bien un método para hinchar una muestra preservando la organización espacial relativa de sus moléculas constituyentes. A continuación, la muestra expandida puede observarse con una resolución efectivamente aumentada utilizando un microscopio confocal tradicional. Aquí, describimos un protocolo para implementar ExM en embriones de Drosophila de montaje completo, que se utiliza para examinar la localización de Par-3, miosina II y mitocondrias dentro de las células epiteliales de superficie. Este protocolo produce un aumento de aproximadamente cuatro veces en el tamaño de la muestra, lo que permite la detección de detalles subcelulares que no son visibles con la microscopía confocal convencional. Como prueba de principio, se utiliza un anticuerpo anti-GFP para distinguir distintos grupos de miosina-GFP entre las cortezas celulares adyacentes, y la estreptavidina marcada con fluorescencia se utiliza para detectar moléculas biotiniladas endógenas para revelar los detalles finos de la arquitectura de la red mitocondrial. Este protocolo utiliza anticuerpos y reactivos comunes para el marcaje de fluorescencia, y debe ser compatible con muchos protocolos de inmunofluorescencia existentes.

Para caracterizar la eficacia general de ExM en embriones de Drosophila de montaje entero, se midió la longitud del embrión a lo largo del eje cabeza-cola en embriones de control no expandidos frente a embriones expandidos (Figura 3A-C). Los embriones de control no expandidos se sometieron a las mismas condiciones de fijación y pasos de marcaje de inmunofluorescencia que los embriones expandidos, excepto que se montaron utilizando un medio de montaje solidificado antes de la obtención de imágenes. Los embriones individuales no expandidos abarcaron aproximadamente la mitad de un campo de visión cuando se utilizó un objetivo de 10x (Figura 3A). Por el contrario, los embriones expandidos abarcaron aproximadamente dos campos de visión completos cuando se utilizó el mismo objetivo de 10x (Figura 3B). Para evaluar cómo variaba el grado de expansión tanto dentro de los experimentos como entre ellos, se realizó el mismo protocolo ExM en tres ocasiones distintas, y se midió la longitud del embrión en tres geles diferentes dentro de cada experimento individual. La longitud media de la cabeza a la cola de los embriones control no expandidos fue de 398,8 μm (desviación estándar [DE] = 22,93 μm; n = 74; Figura 3C). Para el experimento 1, el experimento 2 y el experimento 3, la longitud media de los embriones fue de 1.596 μm (DE = 159,9 μm; n = 57), 1.868 μm (DE = 150,5 μm; n = 51) y 1.954 μm (DE = 120,3 μm; n = 44), respectivamente, lo que representa factores de expansión de 4,0, 4,7 veces y 4,9 veces, respectivamente (Figura 3C). La variación intraexperimental entre los geles fue mucho menos notable que la variación interexperimental, que fue de aproximadamente el 20% (Figura 3C). Para evaluar los efectos de ExM en la morfología celular y embrionaria, se utilizó un anticuerpo contra el componente de unión adherente Par-3 (Bazooka)21 para marcar las membranas celulares apicales, y obtuvimos imágenes de los segmentos bucales en desarrollo de embriones de Drosophila en etapa 11, una etapa con una estructura segmentada compleja (Figura 3D-F). En la muestra control, las células del segmento maxilar tenían un ancho promedio de 4,76 μm (DE = 1,053 μm, n = 25; Figura 3D,F). En las muestras expandidas de las que se obtuvieron imágenes utilizando el mismo objetivo de 40x y el mismo factor de zoom (1x), las células del segmento maxilar tenían una anchura media de 19,10 μm (DE = 3,966 μm, n = 18; Figura 3E,F), lo que representa una expansión de 4,0 veces. Por lo tanto, de acuerdo con informes anteriores11, pudimos expandir los embriones de Drosophila de montaje completo aproximadamente cuatro veces en dimensiones lineales utilizando ExM sin desgarro de la muestra ni distorsiones obvias en la morfología celular o tisular.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64662/64662fig03.jpg"> Figura 3: Expansión cuádruple de embriones de Drosophila. (A) Embriones de Drosophila no expandidos y (B) expandidos fotografiados con un objetivo de 10x (0,3 NA) con un zoom de 1x. Los campos de visión individuales (FOV) se indican con líneas discontinuas. Los embriones expresaron una versión marcada con GFP de la cadena ligera de miosina y se tiñeron con un anticuerpo anti-GFP. (C) Cuantificación de la longitud del embrión (a lo largo del eje cabeza-cola) en tres hidrogeles por experimento y a partir de tres experimentos ExM separados en comparación con controles no expandidos. (D,E) Segmentos maxilares de embriones de Drosophila en estadio 11 (D) no expandidos y (E) expandidos fotografiados con un objetivo de 40x (1,3 NA) con un zoom de 1x. Los contornos celulares (uniones adherentes) se detectaron con un anticuerpo anti Par-3/Bazooka (blanco). (F) Cuantificación de la anchura de la célula (eje largo) a partir de grupos equivalentes de células de (D) y (E). Los diagramas de caja de (C) y (F) muestran los rangos de percentiles 25, 50 y 75; los bigotes indican los valores mínimo y máximo; Los símbolos "+" indican la media. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64662/64662fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Para demostrar que ExM se puede utilizar para resolver detalles subcelulares por debajo del límite de difracción típico, se obtuvieron imágenes del citoesqueleto de actomiosina en un control no expandido frente a embriones expandidos que se sometieron a una extensión convergente (etapa 7). Los eventos de remodelación tisular de la gastrulación y la extensión convergente están controlados en gran medida por cambios en la localización de la proteína motora miosina II24. Sin embargo, en el epitelio cilíndrico densamente empaquetado del ectodermo primitivo de Drosophila , es difícil observar muchos detalles finos del patrón de localización de la miosina II, incluso cuando se obtienen imágenes con un aumento de 158x (objetivo de 63x con un zoom óptico de 2,5x), un poder de resolución máximo típico para un microscopio confocal de barrido láser. Por ejemplo, debido a que la miosina II es una proteína cortical (ubicada directamente debajo de la membrana plasmática), los grupos de miosina II25 ubicados a ambos lados de los contactos célula-célula no se resolvieron en los embriones en etapa 7, y aparecieron como una sola línea donde se encontraron las células vecinas (Figura 4A). Por el contrario, en embriones expandidos en estadio 7, se pudieron observar líneas paralelas de miosina II en las uniones célula-célula, que representan grupos de proteínas corticales en células adyacentes (Figura 4B). La distancia entre las líneas paralelas de miosina II en muestras expandidas fue de 892,7 nm (DE = 0,171 nm, n = 12); cuando se divide por cuatro, esto produce una distancia predicha de ~ 220 nm entre las líneas de miosina en células adyacentes en embriones no expandidos, que de hecho está justo por debajo del límite de difracción para una señal detectada con Alexa 488 (emisión máxima de ~ 520 nm / 2 = 260 nm).
Además, también probamos si ExM podría usarse para resolver la arquitectura de la red mitocondrial en células densamente empaquetadas de embriones de Drosophila gastrulados (etapa 6). La función mitocondrial está estrechamente relacionada con la estructura de la red (es decir, orgánulos fusionados frente a orgánulos fragmentados), pero los detalles de la organización de la red mitocondrial son difíciles de visualizar utilizando la microscopía confocal convencional en tipos celulares que no son planos y/o delgados. Las mitocondrias son naturalmente ricas en moléculas biotiniladas y, por lo tanto, las mitocondrias se pueden marcar en el embrión temprano de Drosophila utilizando estreptavidina26 marcada con fluorescencia. En los embriones no expandidos en estadio 6 marcados con estreptavidina-Alexa 488, la señal aparecía como puntos citoplasmáticos que a menudo se superponían y eran difíciles de resolver (Figura 4C). Por el contrario, en los embriones expandidos en estadio 6, muchos más detalles finos de la red mitocondrial eran visibles y los puntos eran más fácilmente resolubles (Figura 4D)26,27. Estos resultados indican que ExM se puede utilizar para estudiar la organización de la red mitocondrial en tipos celulares que tradicionalmente no son adecuados para el análisis mitocondrial.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64662/64662fig4v2.jpg"> Figura 4: Detalles del citoesqueleto de actomiosina y las mitocondrias revelados por microscopía de expansión. (A,B) Localización de la miosina II en células de neuroectodermo (banda germinal) fotografiadas con un objetivo de 63x (1,4 NA) con un zoom de 2,5x en embriones no expandidos y (B) expandidos en estadio 7 (A) y (B) expandidos. Se detectó miosina II en los embriones que expresaban una versión transgénica marcada con GFP de la cadena ligera reguladora de la miosina II (sqh-GFP), que se detectó con un anticuerpo anti-GFP (rojo). En el embrión expandido se pueden resolver distintos grupos de miosina cortical localizados en células adyacentes (flechas blancas). (C,D) Redes mitocondriales en células de neuroectodermo fotografiadas con un objetivo del 63× (1,4 NA) con un zoom de 2,5x en embriones no expandidos (C) y expandidos (D) en estadio 6. Las mitocondrias se detectaron con estreptavidina-Alexa 488 (verde) y los contornos celulares se detectaron con un anticuerpo anti-Par-3/Bazooka (magenta). Los experimentos se realizaron con un microscopio confocal de barrido láser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64662/64662fig4v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla 1: Recetas de solución. Composición de las soluciones utilizadas en este protocolo por orden de aparición. Todas las existencias son líquidas a menos que se indique lo contrario. Los productos químicos se resuspendieron o diluyeron en agua filtrada esterilizada en autoclave, a menos que se indique lo contrario. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64662/JOVE_Parveen%202023_Revision_Recipes.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>

Aquí, se presenta un protocolo para la implementación de microscopía de expansión en embriones tempranos de Drosophila para lograr imágenes de superresolución utilizando un microscopio confocal convencional de barrido láser.

Uso de microscopía de expansión para agrandar físicamente embriones de Drosophila de montaje completo para obtener imágenes de superresolución

The workhorse of developmental biology is the confocal microscope, which allows researchers to determine the three-dimensional localization of tagged ...

Este protocolo se puede implementar en la mayoría de los laboratorios de biología del desarrollo de los esófagos, lo que permite a los investigadores que no tienen acceso a microscopios de súper resolución producir imágenes de súper resolución. La principal ventaja de esta técnica es que permite a los investigadores eludir el límite de difracción de la microscopía confocal convencional sin necesidad de un microscopio de superresolución mediante la expansión de la propia muestra. Este protocolo será beneficioso para aquellos que estudian cómo la localización de proteínas afecta la morfología o función celular en embriones intactos, particularmente cuando esas proteínas están organizadas en estructuras o redes subcelulares complejas.El problema más común con el que se encuentran las personas es la pérdida de embriones a lo largo del protocolo. Es recomendable aplicar múltiples capas de Poli-L-Lisina para adherir los embriones firmemente. Después de los embriones, tome una base de placa de Petri de plástico de seis centímetros llena hasta la mitad con agar al 3%.Marque un rectángulo de cinco por tres centímetros en el agar con una cuchilla de afeitar o un bisturí. Retire la losa de agar con una pequeña espátula de laboratorio. Luego invierta la base de la placa de Petri, colóquela en el banco y coloque la losa de agar encima de la placa invertida.Retire la tapa de la placa de Petri y asegúrese de que esté seca. Con guantes, pegue un trozo de cinta adhesiva de doble cara en el interior de la tapa. Saque los viales que contienen los embriones recubiertos y fijados del agitador y colóquelos verticalmente en el banco de trabajo.Deje que las fases orgánica y acuosa se separen. Los embriones correctamente fijados deben permanecer en su interfaz. Eliminar completamente la fase acuosa inferior con una pipeta Pasteur y una pipeta P200.Utilice una pipeta Pasteur de vidrio equipada con una pera de látex para transferir los embriones fijados a una losa de agar en varios lotes pequeños para que no se adhieran al interior de la pipeta. Una vez que los embriones estén en la losa de agar, use una pipeta P200 para eliminar cualquier heptano restante cerca de los embriones. Ahora, deje caer la tapa de la cinta adhesiva de doble cara sobre la losa de agar desde una altura de dos centímetros para adherir los embriones a la cinta.Retire suavemente la tapa de la losa de agar, colóquela boca abajo en el banco y agregue suficiente PBS Tween para cubrir los embriones en la tapa. Para recolectar los embriones deseados, use un microscopio de disección estereoscópica a un aumento de 100x con iluminación indirecta. Pinche la membrana vitelina cerca del extremo anterior o posterior del embrión con una aguja de vidrio fino para desinflarla y liberar la presión.Use pinzas finas o una sonda de metal para empujar suavemente el embrión a través del orificio con la membrana vitelina aún adherida a la cinta adhesiva de doble cara. Deja los embriones no deseados en la cinta. Utilice periódicamente una pipeta Pasteur de vidrio para recoger cualquier embrión desvitellinizado flotante y trasladarlo a un tubo de microfuga de 1,5 mililitros.Prepare la solución de PDMS en un tubo cónico de 50 mililitros y cree un tubo equilibrado agregando una cantidad adecuada de agua a un segundo tubo cónico de 50 mililitros. Centrifugar la solución de PDMS a 500 G durante tres minutos a 15 grados centígrados. Luego viértelo en una placa de Petri de 10 centímetros a una profundidad de un milímetro.Deje que la solución de PDMS se solidifique durante la noche a 55 grados Celsius. Una vez que la losa de PDMS esté solidificada, marque áreas cuadradas ligeramente más pequeñas que un cubreobjetos de 22 por 22 milímetros con un bisturí. Dentro de cada cuadrado, marca y retira un hueco cuadrado de ocho milímetros de ancho.transfiera cada pocillo cuadrado de PDMS a un cubreobjetos de 22 por 22 milímetros y adhiéralo firmemente. Para adherir los embriones a los cubreobjetos, aplique suficiente 0,1% de poli-L-lisina para cubrir la superficie del cubreobjetos dentro de cada pocillo y colóquelos en una incubadora a 55 grados centígrados para que se sequen. Enjuague brevemente los embriones y el PBS para eliminar el detergente Tween.A continuación, transfiera más de 10 embriones a cada pocillo recubierto de poli-L-lisina. Deje que los embriones se asienten en el fondo de los pocillos. Retirar el exceso de líquido de los embriones adheridos con una pipeta Pasteur e inmediatamente proceder al siguiente paso.Mientras los embriones permanecen en la solución de monómero, prepare una solución de gelificación para cubrir los pocillos de PDMS. Diluya el oxidante catalítico recién extraído del polvo. Combine 3.920 microlitros de solución de monómero con 60 microlitros de TEMED al 10% y 20 microlitros de TEMPO al 1%.Divida la solución de gelificación en alícuotas de 125 microlitros en múltiples tubos de PCR. Retire la solución de monómero de los pocillos de PDMS con una aspiradora o pipeta teniendo cuidado de no alterar los embriones. Agregue cinco microlitros de APS a uno de los tubos de PCR que contienen la solución de gelificación para iniciar la polimerización.Distribuya rápidamente la solución de gelificación polimerizante entre los tres pocillos. Repita esto hasta que todos los pocillos y embriones estén cubiertos. Deje que las muestras se gelifiquen durante 1,5 a 2,5 horas a 37 grados centígrados.Los hidrogeles más gruesos tardarán más en completar la polimerización y solidificarse. Agite los hidrogeles con frecuencia para controlar la polimerización. Una vez solidificados, los hidrogeles no se moverán.Después de la gelificación, retire los pocillos de PDMS del cubreobjetos sin alterar los hidrogeles. Transfiera los hidrogeles individualmente a los pocillos de una placa de seis pocillos. Los hidrogeles pueden expandirse ligeramente durante la digestión.Cubra los geles completamente con tampón de digestión. 30 mililitros de tampón de digestión son suficientes para cubrirlos en una placa de seis pocillos e incubarlos durante una hora a 37 grados centígrados. Después de la digestión, mueva los hidrogeles a una placa de Petri de seis centímetros y llénela con agua desionizada para que se expanda.Los hidrogeles pueden desprenderse de los cubreobjetos en este punto y expandirse cuatro pliegues en dimensión lineal. Con una pipeta Pasteur, elimine la mayor cantidad posible de agua de la placa de Petri para minimizar el movimiento de los geles cuando se manipulen. Maniobre los geles expandidos con los embriones en la superficie inferior sobre un cubreobjetos grande para obtener imágenes.Monte cada cubreobjetos con gel sobre el objetivo de un microscopio confocal de barrido láser invertido. Después de ubicar las muestras correctamente organizadas y orientadas, se cambió a un objetivo de inmersión en aceite o agua de gran aumento para obtener imágenes en alta resolución. La medición de la longitud del embrión a lo largo del eje de la cabeza a la cola bajo un objetivo de 10x mostró que los embriones no expandidos abarcaban aproximadamente la mitad de un campo de visión, mientras que los embriones expandidos abarcaban aproximadamente dos campos de visión completos.La longitud media de la cabeza a la cola de los embriones de control no expandidos fue de 398,8 micrómetros. Para los experimentos uno, dos y tres, las longitudes medias de los embriones fueron factores de expansión de 4,0 veces, 4,7 veces y 4,9 veces, respectivamente. En la muestra control, las células del segmento maxilar tenían un ancho promedio de 4,76 micrómetros.En las muestras expandidas, las células del segmento maxilar tenían un ancho promedio de 19,10 micrómetros, lo que representa una expansión de 4,0 veces. El citoesqueleto de actomiosina se visualizó en el control no expandido frente a los embriones expandidos, sometidos a extensión convergente. Aparecieron como una sola línea donde se reunían las células vecinas.Por el contrario, en embriones expandidos en etapa siete, se pudieron observar líneas paralelas de miosina dos en las uniones celulares, que representan grupos de proteínas corticales en células adyacentes. En los embriones no expandidos de la etapa seis, las mitocondrias marcadas con estreptavidina aparecieron como una neblina citoplasmática heterogénea sin detalles subcelulares claros. Sin embargo, en los embriones expandidos, numerosos puntos fueron resolubles dentro del citoplasma, probablemente representando mitocondrias fragmentadas o porciones de la red mitocondrial.Una cosa importante que hay que recordar al intentar este procedimiento es proteger los embriones de la exposición excesiva a la luz después de la incubación secundaria de anticuerpos.

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Investigación

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Biología del Desarrollo

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Uso de microscopía de expansión para agrandar físicamente embriones de Drosophila de montaje completo para obtener imágenes de superresolución (Video) | JoVE Journal

Uso de microscopía de expansión para agrandar físicamente embriones de Drosophila de montaje completo para obtener imágenes de superresolución

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