Detección de poro de nodo mecánico: una plataforma rápida y sin etiquetas para mediciones viscoelásticas unicelulares multiparamétricas

Presentamos una plataforma microfluídica basada en electrónica para el fenotipado mecánico de células individuales. Específicamente, medimos las propiedades elásticas y viscosas de una sola célula a un rendimiento de hasta 10 células por segundo. Nuestro método requiere una preparación mínima de la muestra, utiliza una medición electrónica directa, reemplazando el costoso hardware óptico y el análisis de imágenes complejas, y no es destructivo, lo que significa que nuestro enfoque es compatible con los análisis posteriores.

Mechano-NPS se ha aplicado a muchos tipos de células, incluidas las muestras primarias, y ha medido el efecto de los componentes subcelulares en la viscoelasticidad de una sola célula. Podría usarse para comprender el comportamiento celular, determinar la progresión de la enfermedad o monitorear la respuesta a los medicamentos. Para comenzar, retire los componentes tratados con plasma de la cámara de plasma.

Pipet una solución dos a uno de metanol y agua desionizada sobre el sustrato de vidrio con electrodos prefabricados. Luego coloque el molde PDMS con el lado de la característica hacia abajo sobre el sustrato de vidrio. Coloque el dispositivo debajo del estereoscopio para ajustar la alineación.

Hornea el dispositivo alineado para completar la fabricación del dispositivo. Prepare la fuente de presión, la PCB, el hardware de sobremesa y el software de adquisición de datos. A continuación, alinee los pines del cabezal de las abrazaderas con los orificios de la PCB y alinee los pines cargados por resorte de las abrazaderas con las almohadillas de contacto del electrodo en el dispositivo microfluídico.

Luego inserte los pines del cabezal de las abrazaderas en los orificios de PCB, asegurándose de que los pines cargados por resorte permanezcan alineados con las almohadillas de contacto del electrodo. Configure y conecte el hardware electrónico. A continuación, establezca los valores para inicializar la sesión de adquisición de datos y establezca la frecuencia de muestreo para la adquisición.

Cultivar y preparar las células de acuerdo con el protocolo de cultivo celular apropiado de la línea celular de elección. Luego suspenda las células en una solución preparada de 2% FBS y 1X PBS a una concentración entre 100, 000 y 500, 000 células por mililitro. Mantenga las células en hielo durante la duración de los experimentos.

Para cargar células en el dispositivo microfluídico, corte 30 centímetros de tubo de politetrafluoroetileno con una cuchilla de afeitar. Use una jeringa para colocar la muestra celular en el extremo del tubo y conecte el mismo extremo a la entrada del dispositivo. Finalmente, conecte el extremo opuesto del tubo al controlador de presión microfluídica.

Para ejecutar el experimento, establezca la presión de conducción constante deseada en el software del controlador de presión y permita que la muestra llene el dispositivo. Si se forman burbujas en los canales microfluídicos, use relleno sin salida. Enchufe la salida del dispositivo y aplique una presión baja a la entrada para forzar la salida de aire a través del PDMS permeable al gas.

Luego configure el voltaje deseado girando la perilla de voltaje en la fuente de alimentación y habilite el voltaje presionando el botón de encendido. Encienda el preamplificador de corriente y ajuste la sensibilidad lo más baja posible. Alternativamente, ajuste la ganancia lo más alta posible sin sobrecargar el preamplificador o exceder el voltaje de entrada analógico máximo del DAQ.

Pulse el botón verde Ejecutar en el menú de la cinta de opciones de MATLAB para iniciar el NPS del script de adquisición de datos. m y comience a muestrear y guardar los datos. Para finalizar el experimento, pulse el botón Detener situado en la esquina inferior izquierda de la ventana de trazado en vivo para finalizar el script de adquisición de datos.

A continuación, desactive la salida de la fuente de alimentación pulsando el botón On. Finalmente, ajuste la fuente de presión a presión cero en el software del controlador de presión. Para el análisis de datos, la señal sin procesar debe tener una relación señal-ruido suficiente para filtrar el ruido y extraer los componentes significativos.

Críticamente, el aumento de la señal de corriente de cada nodo debe ser lo suficientemente robusto como para que los subpulsos puedan identificarse fácilmente a partir de la señal de diferencia. Las células malignas MCF-7 tienen una mayor distribución wCDI que las células MCF-10A no malignas, lo que indica que las células MCF-7 malignas son más blandas que sus contrapartes MCF-10A no malignas. Las células MCF-10A y MCF-7 tratadas con latruculina muestran un aumento en wCDI.

Una distribución distinta de wCDI que diferencia los dos tipos de células primarias indica que las células LEP son más blandas que las células MEP. MCF-10A no maligno y MCF-10A y MCF-7 no tratados tienen una mayor proporción de células que se recuperan instantáneamente, lo que indica una viscosidad más baja que su contraparte maligna o tratada con latruculina. Si la lectura de corriente en vivo parece anormal, detenga el experimento e inspeccione el canal microfluídico.

Asegúrese de que no haya burbujas de aire ni obstrucciones de modo que las células fluyan libremente desde la entrada hasta la salida. Debido a que nuestro método no daña las células, se pueden realizar análisis posteriores como RNA-seq o inmunofluorescencia. Esto podría ayudar a descubrir algunas razones subyacentes por las que las células tienen fenotipos mecánicos distintos.