Rilevamento meccano-nodo-pore: una piattaforma rapida e senza etichette per misure viscoelastiche monocellulari multiparametriche

Presentiamo una piattaforma microfluidica basata sull'elettronica per la fenotipizzazione meccanica di singole cellule. In particolare, misuriamo le proprietà elastiche e viscose di una singola cella con una produttività fino a 10 celle al secondo. Il nostro metodo richiede una preparazione minima del campione, utilizza una semplice misurazione elettronica, sostituendo il costoso hardware ottico e l'analisi delle immagini complesse, e non è distruttivo, il che significa che il nostro approccio è compatibile con le analisi a valle.

Mechano-NPS è stato applicato a molti tipi di cellule, compresi i campioni primari, e ha misurato l'effetto dei componenti subcellulari sulla viscoelasticità delle singole cellule. Potrebbe essere usato per comprendere il comportamento cellulare, determinare la progressione della malattia o monitorare la risposta ai farmaci. Per iniziare, rimuovere i componenti trattati al plasma dalla camera al plasma.

Pipet una soluzione due a uno di metanolo e acqua deionizzata sul substrato di vetro con elettrodi prefabbricati. Quindi posizionare lo stampo PDMS con il lato della caratteristica rivolto verso il basso sopra il substrato di vetro. Posizionare il dispositivo sotto lo stereoscopio per regolare l'allineamento.

Cuocere il dispositivo allineato per completare la fabbricazione del dispositivo. Preparare la sorgente di pressione, il PCB, l'hardware da banco e il software di acquisizione dati. Quindi, allineare i pin di intestazione dei morsetti con i fori sul PCB e allineare i pin caricati a molla dei morsetti con i pad di contatto dell'elettrodo sul dispositivo microfluidico.

Quindi inserire i pin di intestazione dei morsetti nei fori del PCB, assicurandosi che i pin caricati a molla rimangano allineati con i pad di contatto dell'elettrodo. Configurare e collegare l'hardware elettronico. Quindi, impostare i valori per inizializzare la sessione di acquisizione dati e impostare la frequenza di campionamento per l'acquisizione.

Coltura e preparazione delle cellule secondo il protocollo di coltura cellulare appropriato della linea cellulare di scelta. Quindi sospendere le cellule in una soluzione preparata di 2% FBS e 1X PBS ad una concentrazione compresa tra 100.000 e 500.000 cellule per millilitro. Mantenere le cellule sul ghiaccio per tutta la durata degli esperimenti.

Per caricare le celle nel dispositivo microfluidico, tagliare 30 centimetri di tubi in politetrafluoroetilene con una lama di rasoio. Utilizzare una siringa per far cadere il campione di cella all'estremità del tubo e collegare la stessa estremità all'ingresso del dispositivo. Infine, collegare l'estremità opposta del tubo al regolatore di pressione microfluidica.

Per eseguire l'esperimento, impostare la pressione di guida costante desiderata sul software del regolatore di pressione e consentire al campione di riempire il dispositivo. Se si formano bolle nei canali microfluidici, utilizzare il riempimento senza uscita. Collegare l'uscita del dispositivo e applicare una bassa pressione all'ingresso per forzare l'aria attraverso il PDMS permeabile ai gas.

Quindi impostare la tensione desiderata ruotando la manopola di tensione sull'alimentatore e abilitare la tensione premendo il pulsante di accensione. Accendere il preamplificatore di corrente e impostare la sensibilità il più bassa possibile. In alternativa, impostare il guadagno il più alto possibile senza sovraccaricare il preamplificatore o superare la tensione di ingresso analogica massima del DAQ.

Premere il pulsante verde Esegui nel menu della barra multifunzione di MATLAB per avviare lo script di acquisizione dati NPS. m, e iniziare a campionare e salvare i dati. Per terminare l'esperimento, premere il pulsante Stop nell'angolo inferiore sinistro della finestra del grafico live per terminare lo script di acquisizione dati.

Quindi disattivare l'uscita dell'alimentatore premendo il pulsante On. Infine, impostare la sorgente di pressione su pressione zero nel software del regolatore di pressione. Per l'analisi dei dati, il segnale grezzo dovrebbe avere un rapporto segnale-rumore sufficiente per filtrare il rumore ed estrarre i componenti significativi.

Criticamente, l'aumento del segnale di corrente da ciascun nodo dovrebbe essere abbastanza robusto in modo tale che i sottoimpulsi possano essere facilmente identificati dal segnale di differenza. Le cellule MCF-7 maligne hanno una distribuzione wCDI maggiore rispetto alle cellule MCF-10A non maligne, indicando che le cellule MCF-7 maligne sono più morbide delle loro controparti MCF-10A non maligne. Le cellule MCF-10A e MCF-7 trattate con latruncolina mostrano un aumento del wCDI.

Una distribuzione distinta di wCDI che differenzia i due tipi di cellule primarie indica che le cellule LEP sono più morbide delle cellule MEP. Gli MCF-10A non maligni e gli MCF-10A e MCF-7 non trattati hanno una percentuale maggiore di cellule che recuperano istantaneamente, indicando una viscosità inferiore rispetto alla loro controparte maligna o trattata con latruncolina. Se la lettura della corrente in tempo reale appare anomala, interrompere l'esperimento e ispezionare il canale microfluidico.

Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria e intasamenti tali che le celle fluiscano liberamente dall'ingresso all'uscita. Poiché il nostro metodo non danneggia le cellule, è possibile eseguire analisi a valle come RNA-seq o immunofluorescenza. Questo potrebbe aiutare a scoprire alcune ragioni sottostanti per cui le cellule hanno fenotipi meccanici distinti.