Análisis de muestras crudas y procesadas de rizoma de Cyperi utilizando cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem en ratas con dismenorrea primaria

La metabonómica mide las respuestas metabólicas generales y dinámicas y es consistente con la determinación de la eficacia general de la medicina tradicional china. Los cambios en los componentes del fármaco debido a la respuesta metabólica del cuerpo se pueden determinar con la metabonómica. El alcance de la detección de los ingredientes activos de la MTC se puede reducir mediante la utilización de esta técnica.

La unilateralidad puede evitarse estudiando los componentes individuales. Este método puede ser simultáneo, determinar los metabolitos endógenos y los componentes exógenos absorbidos en la sangre. La metabonómica ha sido ampliamente utilizada en estudios sobre MTC, toxicología de medicamentos, gestión de la salud, deportes, alimentos y otros campos.

Para comenzar, determine el extracto requerido de rizoma Cyperi, o CR, o rizoma Cyperi procesado con vinagre, o CRV, para tratar a un grupo de seis ratas Sprague Dawley durante tres días. Calcule el volumen de RC o CRV que se aplicará por rata utilizando esta ecuación. Para procesar el CRV, mezcle bien 100 gramos de CR y 20 gramos de vinagre, que tiene más de 5.5 gramos de ácido acético por cada 100 mililitros, e incube durante 12 horas.

Después de la incubación, saltee la mezcla en una sartén de hierro durante 10 minutos a 110 a 120 grados centígrados. Luego, retire la mezcla y deje que se enfríe a temperatura ambiente. Para preparar el extracto de CR, remoje el CR durante dos horas con agua pura 10 veces la cantidad de CR tomada, asegurándose de que los materiales medicinales estén por debajo del nivel líquido.

Luego, lleve la mezcla de agua y medicina a hervir a fuego alto y manténgala hirviendo a fuego lento durante 20 minutos. Luego, filtre el contenido a través de un paño de filtro de malla 100 y recoja el filtrado. Luego, concentre el filtrado recolectado en un extracto con un evaporador rotativo a un gramo por mililitro.

Para preparar el extracto de CRV, realice los pasos de remojo, ebullición y concentración como se demostró para la extracción de CR. Para probar los extractos CR y CRV, pipetear 500 microlitros del extracto a 500 microlitros de metanol en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros y mezclar durante 30 segundos. Centrifugar las muestras durante 15 minutos a 16, 500 g a cuatro grados centígrados.

Luego, retire el sobrenadante y transfiéralo al vial de muestra para su análisis. Después de probar las muestras, realice el análisis de componentes principales, o PCA, y el modelado utilizando el software de análisis. Importe los datos estandarizados de los metabolitos al software y, a continuación, utilice Autofit para crear el modelo de análisis.

Finalmente, use los puntajes para obtener el diagrama de dispersión de puntaje de la PCA. Para realizar el análisis discriminante mínimo cuadrado parcial ortogonal, u OPLS-DA, importe los datos estandarizados sobre los metabolitos y los grupos CR y CRV en el software. A continuación, importe los datos de CR y CRV en sus respectivos grupos creados.

A continuación, utilice Autofit para crear el modelo de análisis y utilice la puntuación para obtener la gráfica de dispersión de puntuación de OPLS-DA. Finalmente, use VIP para obtener la significación variable en la proyección o el valor VIP en el OPLS-DA. Para identificar los metabolitos potencialmente diferenciales, elimine los metabolitos con valores VIP mayores que uno.

Luego, use el software estadístico para calcular el valor P de los metabolitos seleccionados por la prueba T del estudiante. A continuación, para identificar los metabolitos diferenciales, utilice los metabolitos anotados y seleccione los metabolitos diferenciales para que coincidan en la base de datos KEGG. Muestre los cambios en los metabolitos diferenciales en los grupos CR y CRV dibujando un mapa de calor.

Para examinar las posibles vías metabólicas, vaya a la base de datos de MetaboAnalyst. Utilice el análisis de vías para cargar los diferentes metabolitos para obtener las posibles vías metabólicas. Sube los diferentes metabolitos a la base de datos KEGG para analizar las posibles vías metabólicas.

El experimento modelo de dismenorrea analizado mostró diferencias significativas en los niveles de prostaglandinas. Las ratas en los grupos modelo CR y CRV mostraron reacciones de retorcimiento sustanciales después de la inyección de oxitocina. Los resultados del análisis de PCA demostraron que los grupos de CR y CRV en comparación con los grupos modelo se separaron significativamente en los modos de iones positivos y negativos.

El OPLS-DA se utilizó para detectar diferencias metabólicas, y los resultados del diagrama de dispersión demostraron que los grupos CR y CRV estaban separados. Se realizaron análisis estadísticos univariados para identificar variaciones metabólicas. Se muestra un diagrama de volcán, en el que cada punto corresponde a un metabolito diferente.

Se observaron cambios significativos en 63 metabolitos en el modo positivo y 30 en el modo negativo. Los metabolitos diferenciales se determinaron utilizando las bases de datos KEGG y HDMB, y se enumeraron los compuestos emparejados con precisión. Se calcularon y agruparon los valores cuantitativos de los metabolitos diferenciales entre los grupos RC y CRV.

Los parches de color indican cómo se expresa cada metabolito en relación con los demás. En comparación con el grupo CR, los niveles de cuatro metabolitos diferenciales en el grupo CRV aumentaron, mientras que 11 metabolitos disminuyeron en el modo de iones positivos. En el caso del modo de iones negativos, cuatro metabolitos diferenciales aumentaron y siete metabolitos disminuyeron.

Los resultados del análisis de la vía KEGG mostraron que los metabolitos diferenciales se asociaron con nueve vías en los modos positivo y negativo. Cuantos más metabolitos diferenciales, mejores serán los resultados, por lo que se pueden vincular suficientes vías metabólicas y las vías metabólicas clave examinadas serán más precisas.