Imágenes intravitales de la expresión de proteínas fluorescentes en ratones con una lesión cerebral traumática de cráneo cerrado y ventana craneal utilizando un microscopio de dos fotones

Este estudio demuestra la administración de una lesión cerebral traumática repetitiva a ratones y la implantación simultánea de una ventana craneal para la posterior obtención de imágenes intravitales de un EGFP expresado por neuronas mediante microscopía de dos fotones.

Nuestro protocolo proporciona una forma de visualizar la respuesta neuronal al estrés mecánico en un ratón vivo, lo que puede proporcionar evidencia directa de cómo la lesión cerebral traumática afecta al cerebro. Esta técnica puede monitorizar la proteína diana en la misma ubicación cerebral en el mismo animal tanto para la fase aguda como para la crónica después de una lesión cerebral traumática. El gen de interés y el promotor del virus se pueden cambiar en consecuencia para estudiar otras proteínas en los tipos específicos de células del cerebro.

Para comenzar, aplique ungüento oftálmico en los ojos del ratón anestesiado. Retira el cabello de la parte superior de la cabeza recortándolo con unas tijeras normales. Después de establecer una incisión de 12 a 15 milímetros de largo en la línea media, extirpe la piel sobre los hemisferios izquierdo y derecho del cráneo con unas tijeras de resorte de punta curva.

Una vez que el cráneo esté expuesto, retire el periostio frotándolo suavemente con el aplicador estéril con punta de algodón y enjuagándolo con solución salina estéril. Una vez que el área del cráneo esté seca, marque el sitio de impacto de la lesión cerebral traumática, o TBI, en las coordenadas 2.5 milímetros posteriores al bregma y dos milímetros laterales desde la sutura sagital hacia la derecha. Retire rápidamente el mouse del marco estereotáxico y coloque la cabeza en el cojín amortiguador debajo del dispositivo TBI.

Alinee la punta del impactador con el sitio de impacto marcado. Levante la columna de metal tirando de la cuerda de nailon atada 15 centímetros por encima de la cabeza del ratón y luego suéltela, permitiendo que el peso caiga libremente sobre la varilla del transductor, que está en contacto con la parte superior del cráneo en el sitio de la lesión cerebral traumática. Coloque la cabeza del ratón anestesiado en el marco estereotáxico que se mantiene bajo el microscopio quirúrgico.

Taladre suave y lentamente la superficie del cráneo con una broca de carburo FG4 a baja velocidad del rotor para eliminar el periostio restante y crear una superficie rugosa del cráneo de modo que el cemento dental se una de forma segura al cráneo. Use solución salina para enjuagar y eliminar el polvo óseo de la superficie del cráneo. Para separar los músculos laterales del cráneo, aproximadamente a cinco milímetros por detrás del ojo, donde se encuentra la sutura que conecta el cráneo parietal y temporal, inserte suavemente las puntas cerradas finas y mueva suavemente las puntas cerradas en dirección posterior hasta la sutura lambdoidea.

Separe los músculos laterales del lado donde se realizará la implantación de la ventana craneal. Lave los residuos del sitio quirúrgico con solución salina y seque el área con una gasa. Para implantar el poste de la cabeza, marque el punto central 2,5 milímetros posterior al bregma y a 1,5 milímetros de la sutura sagital en el hemisferio derecho con un rotulador y una pinza quirúrgica.

A continuación, trace la circunferencia de la craneotomía sobre el cráneo limpio y seco. Afloje la barra de la oreja y gire la cabeza, de modo que el plano de la craneotomía quede perfectamente horizontal, y luego vuelva a apretar la barra de la oreja. Use la barra de madera de un aplicador con punta de algodón para agregar dos pequeñas gotas de superpegamento en el borde delantero y trasero del poste de la cabeza.

Coloque el poste de titanio sobre el centro de la craneotomía y ajústelo rápidamente para que descanse dentro del mismo plano donde se implantará la ventana craneal. Aplica una ligera presión hasta que el superpegamento se seque, lo que suele tardar aproximadamente 30 segundos. Prepare el cemento dental en una placa de cerámica preenfriada mezclando bien 300 miligramos de cemento en polvo, seis gotas de líquido QuickBase y una gota de catalizador.

Aplique rápidamente una cantidad generosa de mezcla de cemento dental en el perímetro exterior de la circunferencia trazada y cubra cualquier superficie ósea expuesta. Sin embargo, no cubra el sitio de la craneotomía. Suelte la barra de la oreja y asegure el poste de la cabeza al marco de metal para asegurarse de que la cabeza esté estable para una perforación precisa a lo largo de la circunferencia de craneotomía marcada.

Para realizar la craneotomía, use un calibrador quirúrgico para verificar el diámetro del círculo marcado como se demostró anteriormente, y ajústelo según sea necesario, de modo que la ventana craneal encaje perfectamente dentro de la craneotomía. Con un taladro dental eléctrico, grabe y adelgace el cráneo a lo largo de la parte exterior del círculo marcado con una broca de carburo FG4 primero, lo que crea una pista dentro de la cual adelgazar el cráneo. Riegue el área con solución salina para eliminar el polvo de los huesos.

Continúe adelgazando el cráneo con una broca de carburo FG 1/4 hasta que el cráneo sea delgado como el papel y transparente. Periódicamente, deje de perforar y vuelva a irrigar toda el área con solución salina estéril para reducir el calentamiento del taladro y eliminar el polvo óseo. Complete el adelgazamiento del cráneo con una broca de carburo EF4 y continúe adelgazando y perforando el resto del cráneo a lo largo de la pista.

Inserte una pinza de punta fina de 0,5 milímetros a través del lugar agrietado y levante el colgajo óseo suavemente hacia arriba sin hacer mella en el cerebro subyacente. Después de retirar el colgajo óseo, irrigar el área de la craneotomía con solución salina. Con las pinzas quirúrgicas de punta curva, retire suavemente la materia aracnoidea visible.

Use las pinzas quirúrgicas de punta recta para levantar la ventana de vidrio estéril con el deslizamiento de la cubierta de vidrio de tres milímetros hacia abajo. Coloque y ajuste la ventana de vidrio sobre el sitio de la craneotomía para asegurarse de que la ventana pueda ajustarse perfectamente al borde de la craneotomía. El cubreobjetos de cristal de cinco milímetros está en la parte superior.

Prepare el cemento dental como se demostró anteriormente y espere aproximadamente seis minutos hasta que el cemento se vuelva pastoso y espeso. Mientras espera que el cemento se vuelva pastoso y espeso, aplique una cantidad adecuada de presión a la ventana a través de un manipulador estereotáxico para verificar que el cráneo pueda entrar en contacto de manera segura y hermética con la ventana de vidrio. Use un cepillo aplicador de precisión ajustable para agregar una pequeña cantidad de cemento a lo largo del borde de la ventana para sellar la ventana de vidrio con la calavera.

Espere aproximadamente 10 minutos para que el cemento se seque por completo, luego suéltelo suavemente y retire el manipulador sobre la ventana. Termine recortando el cemento dental con el taladro dental con una broca de carburo FG4 si el exceso de cemento cubre la ventana. Aproximadamente cuatro horas después de la cirugía, se realizaron imágenes de dos fotones, donde a nivel superficial la vasculatura apareció negra, y a nivel profundo de aproximadamente 400 micrómetros, la expresión de la proteína EGFP se distribuyó difusamente por todo el cuerpo celular.

Una semana y cuatro meses después del TCE, se utilizó como referencia el patrón de vasculatura observado en el punto de tiempo del día cero para localizar la misma región de imagen. El patrón de vasculatura es similar al del día cero. Del mismo modo, se detectó la expresión de EGFP en todo el cuerpo celular.

La intensidad de fluorescencia en el día cero y a los cuatro meses fue similar tanto a nivel superficial como a nivel más profundo. Sin embargo, la intensidad de fluorescencia a la semana fue menor que la del día cero y a los cuatro meses, posiblemente debido a la represión traslacional reportada para otros modelos de TCE. Es crucial tener sumo cuidado al operar el paso de craneotomía para evitar dañar el tejido cerebral.

No introduzca la punta del taladro en el cerebro. Con esta técnica, los investigadores pueden visualizar diferentes proteínas de interés en la misma célula longitudinalmente a través de diferentes fases posteriores a un traumatismo craneoencefálico, proporcionando información sobre la localización, expresión y solubilidad de esa proteína en el cerebro de los mamíferos después de un traumatismo.