Evaluación de la integridad de la barrera intestinal en ratones utilizando dextrano marcado con fluoresceína-isotiocianato

Este método ayuda a responder preguntas sobre si una afección altera la integridad de la barrera intestinal o preguntas sobre si un tratamiento potencial puede mantener la integridad de la barrera intestinal. La principal ventaja de esta técnica es que ofrece una técnica no invasiva y de baja carga para evaluar y cuantificar la permeabilidad intestinal in vivo. Para comenzar, ayune los ratones durante cuatro horas, luego administre 200 microlitros de la suspensión FITC-dextrano a través de sonda oral a cada ratón utilizando una aguja de sonda curva esterilizada calibre 22 de 38 milímetros.

Inicie un temporizador después del primer sonda y espere de cinco a 10 minutos entre cada sonda para permitir mediciones in vivo, manteniendo una hora después de la sonda nasogástrica. Mantenga la suspensión FITC-dextrano restante para la curva estándar. Inicie la máquina y el software haciendo clic y manteniendo presionado el botón de inicio y permita que el sistema se caliente.

Haga clic en Estado del dispositivo y asegúrese de que todos los dispositivos configurados muestren OK antes de continuar. Luego haga clic en Nuevo estudio y guarde el archivo con el nombre deseado. A continuación, haga clic en Opciones de estudio.

Ingrese la identificación de la muestra y elija el láser correcto y experimente. Luego retire el pelaje del área abdominal con una afeitadora eléctrica y aplique ungüento veterinario generosamente en los ojos para evitar que se seque. Abra la cámara de imágenes y coloque al animal dorsalmente sobre la placa de escaneo.

Luego asegure las extremidades y la cola con cinta adhesiva. A continuación, seleccione el área que desea escanear mediante la herramienta Dibujar. Asegúrese de incluir todo el ancho del abdomen desde justo por encima del hígado hasta el recto.

Luego haga clic en la herramienta Modificar para ajustar el área una vez dibujada. Establezca la resolución de escaneo en 2.0 milímetros y haga clic en Inicio para comenzar el escaneo. A continuación, abra los archivos de imagen encontrándolos con el nombre de archivo elegido y abra simultáneamente todos los archivos con la configuración sincronizada.

Con la barra de herramientas de configuración de imagen, utilice los botones Sincronizar imagen y Sincronizar escala para sincronizar la configuración de imagen y obtener una comparación precisa. Luego guarde las imágenes con las escalas ajustadas. Compare la fluorescencia abdominal de cada animal y el ratón control en imágenes de escala uniforme utilizando el software asociado con el sistema de imágenes.

Recoja una bolita fecal de cada ratón en un tubo estéril cuatro horas después de la sonda nasogástrica. Luego mantenga los tubos en hielo y colóquelos en la oscuridad. A continuación, centrifugar las muestras de sangre a 9, 390 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Luego transfiera el plasma a un nuevo tubo estéril y manténgalo en hielo en la oscuridad. Diluir 50 miligramos de muestras fecales en 200 microlitros de PBS, y diluir el plasma con PBS en una proporción de uno a dos. Placa de muestras de 100 microlitros y estándares en una placa negra opaca de 96 pocillos.

Lea la fluorescencia en un lector de placas fluorescentes con excitación a 485 nanómetros y absorción a 530 nanómetros. Finalmente, determine la concentración de FITC-dextrano por muestra comparando la fluorescencia con las concentraciones conocidas de la curva estándar. El análisis de la fluorescencia in vivo mostró que los ratones que recibieron solo la dieta de control tenían una mayor ingesta hepática de FITC-dextrano y niveles más altos de fluorescencia residual en la cavidad abdominal en comparación con los ratones que recibieron la dieta suplementada con inulina.

Los ratones que recibieron la dieta suplementada con inulina tenían niveles significativamente más bajos de FITC-dextrano en su plasma en comparación con los ratones que recibieron solo la dieta de control. Concordantemente, los ratones que recibieron la dieta de inulina tenían niveles significativamente más altos de FITC-dextrano en sus heces que los ratones que recibieron solo la dieta de control. Los niveles más bajos de FITC-dextrano en las heces de los ratones controlados indican que penetró a través de la barrera intestinal hacia la circulación en lugar de excretarse adecuadamente.

Los altos niveles de FITC-dextrano en el plasma reforzaron este hallazgo. El tiempo es esencial al intentar este procedimiento. La lectura de fluorescencia y la recolección de muestras deben ocurrir lo más cerca posible de una hora y cuatro horas después del sonda nasogástrica para cada ratón individual.