Name: In vivo Entrega de genes en células epiteliales mamarias de ratón a través de inyección intraductal mamaria (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 36 s
Description: Aprenda a realizar inyección intraductal mamaria para entrega génica en células epiteliales de ratón usando vectores virales. Este método permite un control cuantitativo temporal que mejora el modelado de tumores mamarios naturales.

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Agradecemos al Dr. Gary Chamness por sus útiles comentarios sobre este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Defensa (DOD) CDMRP BC191649 (YL) y BC191646 (YL), así como los Institutos Nacionales de Salud (NIH) CA271498 (YL). Los autores desean agradecer a la Instalación Central de Patología del Centro de Mama respaldada por SPORE P50CA186784, y al Núcleo de Citometría y Clasificación Celular respaldado por CPRIT-RP180672, NIH CA125123 y RR024574 con la ayuda de Joel M. Sederstrom.

Todos los procedimientos con ratones se realizaron de acuerdo con el protocolo animal aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales. Para el presente estudio, se utilizaron ratones hembra FVB / N o MMTV-tva de 9-12 semanas de edad. Los ratones se obtuvieron comercialmente o de fabricación propia (ver Tabla de materiales). Se utilizaron los virus Lenti-EGFP (FUCGW) y RCAS-Erbb2 (Neu). La preparación del virus y la determinación del título se realizaron siguiendo los informes publicados anteriormente10,12.
1. Preparación de la jeringa
<ol><li>Corte las agujas metálicas de 33 G (consulte la Tabla de materiales) a aproximadamente 1 cm de longitud. Guarde las agujas y la jeringa de 50 μL en alcohol al 70% después del autoclave.</li>
	<li>Saque las jeringas y agujas del alcohol. Expulse el alcohol restante de la jeringa y la aguja. Desmonte la jeringa para secar al aire en una almohadilla absorbente esterilizada en autoclave.</li>
	<li>Ensamble la jeringa después del secado.</li>
</ol>2. Preparación del virus
<ol><li>Saque uno o varios tubos de material viral según sea necesario del congelador de -80 °C y descongele el virus en hielo. NOTA: Dependiendo del número de células a infectar, es posible que sea necesario diluir el virus en títulos previstos utilizando 1x PBS en este momento.</li>
	<li>Añadir azul de bromofenol sumergiendo la punta de la pipeta a una profundidad de 1 cm en el polvo de azul de bromofenol (ver Tabla de materiales). Luego, coloque la traza adjunta de azul de bromofenol en la suspensión del virus. NOTA: Para el presente estudio, el stock viral suele ser de 200 μL por tubo, por lo que la concentración final de colorante es de aproximadamente 0,2% (0,2 μg/100 μL). El azul de bromofenol debe esterilizarse con radiación de microondas durante 45 segundos a una potencia alta de 1250 W (ver Tabla de materiales). Asegúrese de llevar todo el procedimiento en un ambiente estéril.</li>
	<li>Mezcle el azul de bromofenol con la solución de virus pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces.</li>
	<li>Coloque el virus en hielo y lleve el cubo de hielo al vivero.</li>
</ol>3. Preparación animal
<ol><li>Anestesiar a una hembra de ratón mediante inyección intraperitoneal de 2 μL/g de anestésico (37,6 mg/ml de ketamina, 1,92 mg/ml de xilazina y 0,38 mg/ml de acepromazina, ver Tabla de materiales). Verifique la profundidad de la anestesia con un pellizco en el dedo del pie. Aplique ungüento en los ojos para prevenir la sequedad mientras está bajo anestesia. NOTA: El ratón no debe responder al pellizco del dedo del pie bajo buena anestesia. El isoflurano también se puede usar para anestesiar a los ratones.</li>
	<li>Coloque el ratón en posición supina sobre una almohadilla caliente y fije las cuatro extremidades al banco con cinta adhesiva.</li>
	<li>Identifique un pezón (o más) para ser inyectado (se prefiere el número 4 para el presente estudio). Exponerlo recortando el cabello circundante con un par de tijeras.</li>
	<li>Aplique hisopos de alcohol y yodóforo al 70% en el área del pezón en tres rondas para limpiar y exponer el pezón.</li>
</ol>4. Inyección intraductal del virus
NOTA: Se puede usar una lámpara de aumento para ayudar a visualizar la abertura del pezón.
<ol><li>Transecte la punta distal de un pezón usando un par de tijeras de resorte de microdisección estériles, hasta que se pueda ver una pequeña abertura ductal central debajo de una lámpara de lupa (consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Cargue 10 μL de mezcla de virus/azul de bromofenol en la jeringa. NOTA: Lenti-EGFP (FUCGW) y RCAS-Erbb2 (Neu) se utilizan en esta demostración.</li>
	<li>Inserte cuidadosamente la aguja en la abertura del pezón con la ayuda de la lámpara de la lupa. La orientación de la aguja se ajusta ligeramente de medial a lateral para alinearse con el conducto principal.</li>
	<li>Inyecte los 10 μL completos del virus en el árbol de conductos. NOTA: Los conductos debajo de la piel deben volverse azules, si la inyección es exitosa. Cualquier resistencia o la aparición de un cambio de color localizado indica el fracaso de la inyección.</li>
	<li>Coloque el ratón en un calentador de diapositivas ajustado a 45 °C hasta que el ratón se despierte completamente (~30-60 min).</li>
</ol>5. Detección de células infectadas por un estereomicroscopio fluorescente
<ol><li>De tres a cinco días después de la inyección del virus portador de GFP u otros genes fluorescentes, eutanasia al ratón sobredosificándolo con 4 uL/g de anestésico (37,6 mg/ml de ketamina, 1,92 mg/ml de xilazina y 0,38 mg/ml de acepromazina).</li>
	<li>Abra la cavidad torácica. Corte la piel a lo largo de la línea media ventral y a lo largo de las extremidades superiores e inferiores con un par de tijeras. Levante la piel y exponga las glándulas mamarias.</li>
	<li>Retire la glándula mamaria inyectada de la piel con un par de fórceps y tijeras. Además, retire una glándula no inyectada como control.</li>
	<li>Coloque las glándulas mamarias en portaobjetos de vidrio y extienda las glándulas a su forma original.</li>
	<li>Observe y obtenga imágenes de las glándulas bajo un microscopio estereoscópico fluorescente.</li>
</ol>

<ol><li>Nguyen, D. -A., Beeman, N., Lewis, M., Schaack, J., Neville, M. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNguyen%2C+D-A+%22Methods+in+Mammary+Gland+Biology+and+Breast+Cancer+Research.+Eds+Margot%22">Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. Eds Margot</a>. Ip, M. M., Asch, B. B. , Springer US. 259-270 (2000).</li>
<li>Gordon, J. W., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+and+stable+germ+line+transmission+of+genes+injected+into+mouse+pronuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei.</a> Science. 214 (4526), 1244-1246 (1981).</li>
<li>Costantini, F., Lacy, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+a+rabbit+beta-globin+gene+into+the+mouse+germ+line%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Introduction of a rabbit beta-globin gene into the mouse germ line.</a> Nature. 294 (5836), 92-94 (1981).</li>
<li>Brinster, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+expression+of+herpes+thymidine+kinase+in+mice+following+injection+of+a+fusion+gene+into+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Somatic expression of herpes thymidine kinase in mice following injection of a fusion gene into eggs.</a> Cell. 27 (1), 223-231 (1981).</li>
<li>Du, Z., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RCAS-TVA+in+the+mammary+gland%3A+an+in+vivo+oncogene+screen+and+a+high+fidelity+model+for+breast+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">RCAS-TVA in the mammary gland: an in vivo oncogene screen and a high fidelity model for breast transformation.</a> Cell Cycle. 6 (7), 823-826 (2007).</li>
<li>Bu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+precancerous+stem+and+non-stem+cells+evolve+into+cancers+of+distinct+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Mammary precancerous stem and non-stem cells evolve into cancers of distinct subtypes.</a> Cancer Research. 79 (1), 61-71 (2019).</li>
<li>Bu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratin+6a+marks+mammary+bipotential+progenitor+cells+that+can+give+rise+to+a+unique+tumor+model+resembling+human+normal-like+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Keratin 6a marks mammary bipotential progenitor cells that can give rise to a unique tumor model resembling human normal-like breast cancer.</a> Oncogene. 30 (43), 4399-4409 (2011).</li>
<li>Haricharan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+an+alveolar+cell+of+origin+to+the+high-grade+malignant+phenotype+of+pregnancy-associated+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Contribution of an alveolar cell of origin to the high-grade malignant phenotype of pregnancy-associated breast cancer.</a> Oncogene. 33 (50), 5729-5739 (2014).</li>
<li>Bu, W., Zhang, X., Dai, H., Huang, S., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+cells+with+active+Wnt+signaling+resist+ErbB2-induced+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mammary cells with active Wnt signaling resist ErbB2-induced tumorigenesis.</a> PLoS One. 8 (11), 78720(2013).</li>
<li>Du, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+oncogenes+into+mammary+glands+in+vivo+with+an+avian+retroviral+vector+initiates+and+promotes+carcinogenesis+in+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Introduction of oncogenes into mammary glands in vivo with an avian retroviral vector initiates and promotes carcinogenesis in mouse models.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17396-17401 (2006).</li>
<li>Siwko, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus-mediated+oncogene+introduction+into+mammary+cells+in+vivo+induces+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Lentivirus-mediated oncogene introduction into mammary cells in vivo induces tumors.</a> Neoplasia. 10 (7), 653-662 (2008).</li>
<li>Bu, W., Xin, L., Toneff, M., Li, L., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus+vectors+for+stably+introducing+genes+into+mammary+epithelial+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mammary+Gland+Biology+and+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Lentivirus vectors for stably introducing genes into mammary epithelial cells in vivo.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 14 (4), 401-404 (2009).</li>
<li>Russell, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+the+mammary+epithelium+with+adenovirus+vectors+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Transduction of the mammary epithelium with adenovirus vectors in vivo.</a> Journal of Virology. 77 (10), 5801-5809 (2003).</li>
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<li>Naldini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272 (5259), 263-267 (1996).</li>
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<li>McCarty, D. M., Young, S. M., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+adeno-associated+virus+%28AAV%29+and+recombinant+AAV+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Integration of adeno-associated virus (AAV) and recombinant AAV vectors.</a> Annual Review of Genetics. 38, 819-845 (2004).</li>
<li>Bu, W., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraductal+injection+of+lentivirus+vectors+for+stably+introducing+genes+into+rat+mammary+epithelial+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mammary+Gland+Biology+and+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Intraductal injection of lentivirus vectors for stably introducing genes into rat mammary epithelial cells in vivo.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (4), 389-396 (2020).</li>
<li>Dong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+individual+somatic+mammary+cells+in+vivo+reveals+a+master+role+of+STAT5a+in+inducing+alveolar+fate+commitment+and+lactogenesis+even+in+the+absence+of+ovarian+hormones%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of individual somatic mammary cells in vivo reveals a master role of STAT5a in inducing alveolar fate commitment and lactogenesis even in the absence of ovarian hormones.</a> Developmental Biology. 346 (2), 196-203 (2010).</li>
<li>Haricharan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+and+preclinical+prevention+of+increased+breast+cancer+risk+caused+by+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Mechanism and preclinical prevention of increased breast cancer risk caused by pregnancy.</a> eLife. 2, 00996(2013).</li>
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<li>Dong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PR+status+of+the+originating+cell+of+ER%2FPR-negative+mouse+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The PR status of the originating cell of ER/PR-negative mouse mammary tumors.</a> Oncogene. 35 (31), 4149-4154 (2016).</li>
<li>Young, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+pro-survival+protein+BCL-2+to+prevent+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Prevention+Research%22%5BJournal%5D)">Targeting the pro-survival protein BCL-2 to prevent breast cancer.</a> Cancer Prevention Research. 15 (1), 3-10 (2022).</li>
<li>Schlimgen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risks+associated+with+lentiviral+vector+exposures+and+prevention+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Occupational+and+Environmental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Risks associated with lentiviral vector exposures and prevention strategies.</a> Journal of Occupational and Environmental Medicine. 58 (12), 1159-1166 (2016).</li>
<li>Holloway, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Krt6a-positive+mammary+epithelial+progenitors+are+not+at+increased+vulnerability+to+tumorigenesis+initiated+by+ErbB2%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Krt6a-positive mammary epithelial progenitors are not at increased vulnerability to tumorigenesis initiated by ErbB2.</a> PLoS One. 10 (1), 0117239(2015).</li>
<li>Holloway, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+oncogenes+into+a+defined+subset+of+mammary+cells+demonstrates+that+the+initiating+oncogenic+mutation+defines+the+resulting+tumor+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Targeting oncogenes into a defined subset of mammary cells demonstrates that the initiating oncogenic mutation defines the resulting tumor phenotype.</a> International Journal of Biological Sciences. 12 (4), 381-388 (2016).</li>
<li>Hein, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminal+epithelial+cells+within+the+mammary+gland+can+produce+basal+cells+upon+oncogenic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Luminal epithelial cells within the mammary gland can produce basal cells upon oncogenic stress.</a> Oncogene. 35 (11), 1461-1467 (2015).</li>
<li>Annunziato, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+CRISPR-Cas9+base+editing+for+the+development+of+genetically+engineered+mouse+models+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">In situ CRISPR-Cas9 base editing for the development of genetically engineered mouse models of breast cancer.</a> EMBO Journal. 39 (5), 102169(2020).</li>
<li>Annunziato, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+invasive+lobular+breast+carcinoma+by+CRISPR%2FCas9-mediated+somatic+genome+editing+of+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Modeling invasive lobular breast carcinoma by CRISPR/Cas9-mediated somatic genome editing of the mammary gland.</a> Genes & Development. 30 (12), 1470-1480 (2016).</li>
</ol>

Ambos autores declaran no tener conflictos de intereses.

Este artículo demuestra la técnica de inyección intraductal viral para introducir genes en células epiteliales mamarias de ratón para modelar el cáncer de mama esporádico. Por lo general, se inyectan ratones de al menos 5 semanas o más para que el proceso oncogénico comience después de que se desarrolle la glándula mamaria. Además, la abertura del pezón de ratones menores de 5 semanas de edad es a menudo demasiado pequeña para la inyección. Por otro lado, los pezones de ratones muy viejos a veces se degeneran, y la trans...

Las células epiteliales de las glándulas mamarias juegan un papel importante en la función de estas glándulas y son la principal célula de origen del cáncer de mama. Los estudios de la biología de las glándulas mamarias y la tumorigénesis con frecuencia necesitan la entrega de genes de interés en estas células. Cada glándula mamaria de ratón comprende un árbol ductal revestido por células epiteliales con una sola abertura en la punta del pezón. Esta estructura hace que las células epiteliales mamarias sean fácilmente accesibles para los vectores virales, que pueden ser entregados en la luz de un árbol ductal a través de la inyección intraductal1.
La técnica de inyección intraductal mamaria se utilizó originalmente para animales mucho más grandes como cabras, conejos y ratas1. Para un animal mucho más pequeño como los ratones, la inyección intraductal necesita muchas herramientas delicadas y más prácticas de los operadores. Existen dos enfoques para la inyección intraductal en ratones. Una es la inyección hasta la tetina1. Otra es la inyección directa del conducto primario de la glándula mamaria #3 o #4 después de la exposición quirúrgica1. Dado que la primera es no invasiva y más rápida una vez que el operador ha sido bien entrenado, esta técnica se usa más comúnmente y se describirá en detalle en este artículo.
En comparación con los modelos tradicionales de ratón transgénico ampliamente utilizados, en los que el gen de interés se introduce en la etapa de óvulos fertilizados a través de microinyección 2,3,4, la administración de genes a través del método de inyección intraductal de virus tiene muchas ventajas, que incluyen: (1) evita el proceso lento de hacer una línea de ratón transgénico para cada gen de interés; (2) evita el deterioro potencial en el desarrollo normal de las glándulas mamarias impuesto por el gen de interés; (3) introduce el gen de interés en cualquier momento deseado después del nacimiento; (4) puede cointroducir fácilmente más de un gen de interés; (5) imita mejor el proceso tumorigénico natural porque las células infectadas y, por lo tanto, portadoras de oncogenes están rodeadas por células normales; y (6) en combinación con la tecnología TVA (virus tumoral A, una proteína de la superficie celular aviar y el receptor para el vector RCAS del retrovirus)5, el gen de interés puede introducirse en una población celular específica para estudiar el origen celular de la tumorigénesis y realizar ensayos de rastreo del linaje celular en las glándulas mamarias 6,7,8, 9.
Cualquier vector derivado del retrovirus 10, lentivirus 11,12, adenovirus 13 y virus asociado a adenovirus (AAV)14 puede utilizarse para la administración intraductal de materiales genéticos. Los vectores de retrovirus y lentivirus se integran en el genoma del huésped de forma permanente; Por lo tanto, introducen genes de interés de manera estable en las células epiteliales mamarias. Mientras que el lentivirus puede integrarse en el genoma de cualquier célula que encuentre15, la integración genómica eficiente del retrovirus necesita la proliferación de las células diana16. Los vectores adenovirales y AAV no se integran en el genoma de las células infectadas y, por lo tanto, sólo expresan transitoriamente el gen de interés17,18. Esta característica puede ser una ventaja cuando el gen de interés necesita expresarse solo por un corto período de tiempo, como Cre, para eliminar un gen supresor de tumores floxed.
Lentivirus, adenovirus y AAV infectan cualquier célula de ratón que encuentren. Pero dado que el epitelio luminal está aislado en gran medida de la capa basal subyacente, que está más separada del estroma por la membrana basal, la inyección intraductal limita la infección en gran medida a las células epiteliales luminales, la célula primaria de origen del cáncer de mama. Dentro de esta capa epitelial luminal, también hay distintos subtipos de células, incluidas las células madre, las células progenitoras y varios grupos de células diferenciadas. Para infectar subconjuntos celulares específicos dentro de la población de células luminales, se puede utilizar la tecnología TVA, con la que los vectores RCAS 5,10 derivados del virus de la leucosis aviar o los vectores lentivirales pseudotipados11 infectan selectivamente las células que expresan TVA en ratones que portan un transgén tva bajo el control de un promotor específico del tipo celular, como un promotor que está activo solo en células madre 6 o ciertos progenitores 6, 7 o células alveolares8 o células activas de la vía Wnt9.
Este protocolo presenta la técnica de introducción de genes de interés en células epiteliales mamarias mediante inyección intraductal de un vector viral. A continuación, se demuestra la detección de la expresión de los genes introducidos y las lesiones hiperplásicas y tumores resultantes.

<table><tbody><tr><td>Anticuerpo anti-HA</td><td>Covance</td><td>MMS-101P</td><td>Dilución: 1 : 1000</td></tr><tr><td>Lágrimas</td><td>artificiales Covetrus</td><td>NDC 11695-0832-1</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Sigma</td><td>B5525</td><td>radiación de microondas durante 45 segundos a una potencia alta de 1250W horno de microondas</td></tr><tr><td>FACSCantoII</td><td>BD Biosciences</td><td>V96100899</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico fluorescente</td><td>Leica</td><td>MZ16 FA</td><td></td></tr><tr><td>FUCGW lenti-virus</td><td>Hecho a sí mismo</td><td>N/A</td><td>Ver referencia # 12</td></tr><tr><td>FVB/N</td><td>El Laboratorio Jackson</td><td>JAX:001800</td><td></td></tr><tr><td>Aguja Hamilton</td><td></td><td>Hamilton 91033</td><td>autoclave</td></tr><tr><td>Jeringa Hamilton</td><td></td><td>Hamilton 201000</td> Lámpara de aumento LED <td>esterilizada en autoclave</td></tr><tr><td></td><td>Intertek</td><td>3165273</td><td></td></tr><tr><td>Micro tijera de disección</td><td>Roboz</td><td>RS-5621</td><td>autoclavado</td></tr><tr><td>MMTV-tva</td><td>Hecho a</td><td></td> sí mismo <td>Ver referencia # 10</td></tr><tr><td>RCAS-Neu (HA)</td><td>Hecho a sí mismo</td><td>N/A</td><td>Ver referencia # 10</td></tr><tr><td>Roedor Comboanestésico III</td><td>Farmacia Veterinaria</td><td>Prescripción veterinaria</td><td>37,6 mg/mL de ketamina, 1,92 mg/mL de xilacina y 0,38 mg/mL de acepromazina</td></tr></tbody></table>

in vivo entrega de genes en células epiteliales mamarias de ratón a través de inyección intraductal mamaria

In Vivo Gene Delivery into Mouse Mammary Epithelial Cells Through Mammary Intraductal Injection

Las glándulas mamarias del ratón comprenden árboles ductales, que están revestidos por células epiteliales y tienen una abertura en la punta de cada pezón. Las células epiteliales juegan un papel importante en la función de la glándula mamaria y son el origen de la mayoría de los tumores mamarios. La introducción de genes de interés en células epiteliales mamarias de ratón es un paso crítico en la evaluación de la función génica en las células epiteliales y la generación de modelos de tumores mamarios de ratón. Este objetivo se puede lograr a través de la inyección intraductal de un vector viral que lleva los genes de interés en el árbol ductal mamario del ratón. El virus inyectado posteriormente infecta las células epiteliales mamarias, trayendo los genes de interés. El vector viral puede ser lentiviral, retroviral, adenoviral o viral asociado a adenovirus (AAV). Este estudio demuestra cómo un gen de interés se administra en las células epiteliales mamarias a través de la inyección intraductal mamaria de ratón de un vector viral. Un lentivirus portador de GFP se utiliza para mostrar la expresión estable de un gen entregado, y un retrovirus portador de Erbb2 (HER2/Neu) se utiliza para demostrar lesiones hiperplásicas atípicas inducidas por oncogén y tumores mamarios.

Aquí se presentan datos representativos para demostrar el éxito de la inyección intraductal, la infección viral exitosa y el impacto de los genes entregados en la tumorigénesis mamaria. La cantidad de virus inyectado debe adaptarse al propósito de cada experimento. Para ilustrar cuán extensamente se puede infectar el árbol del conducto mamario, se debe usar una gran cantidad de genes portadores de virus que se pueden visualizar, como GFP. Por otro lado, para imitar la tumorigénesis espontánea natural, se debe usar una pe...

El presente protocolo describe la inyección intraductal de vectores virales a través de la tetina para administrar genes de interés en las células epiteliales mamarias.

In vivo Entrega de genes en células epiteliales mamarias de ratón a través de inyección intraductal mamaria

Mouse mammary glands comprise ductal trees, which are lined by epithelial cells and have one opening at the tip of each nipple. The epithelial cells play ...

Este método entrega el material genético en las células epiteliales de la glándula mamaria de una manera especial, temporal y cuantitativamente controlable. Dado que la entrega de material genético en las células epiteliales mamarias es especial, temporal y cuantitativamente controlada, los modelos mamarios generados por este método imitan mejor la génesis natural del tumor. Comience la preparación de la jeringa cortando las agujas metálicas de calibre 33 a aproximadamente un centímetro de largo y almacenándolas en alcohol.Retire las jeringas y agujas del alcohol y expulse el alcohol restante de la jeringa y las agujas. Luego desmonte la jeringa para secar al aire. Después del secado, ensamble la jeringa.Saque los tubos de stock viral del congelador de menos 80 grados centígrados y descongélelos en hielo. Para añadir azul de bromofenol, sumerja la punta de la pipeta a una profundidad de un centímetro en el polvo azul de bromofenol. Luego lleve la traza adjunta de azul de bromofenol a la suspensión del virus.Mezcle el azul de bromofenol con la solución de virus pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces, antes de colocar el virus en hielo. Verifique la profundidad de la anestesi

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Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Este vídeo describe una técnica de inyección intraductal en la que administramos mezcla inyectable en los conductos de las glándulas mamarias de ratón.

Inyección intraductal: administración de la mezcla inyectable en los conductos de la glándula mamaria del ratón

Un protocolo para la entrega intraductal no invasiva de los reactivos acuosos para la glándula mamaria de ratón se describe. El método se aprovecha de la inyección localizada en los pezones de las glándulas mamarias dirigidos específicamente conductos mamarios. Esta técnica es adaptable para una variedad de compuestos que incluyen ARNsi, agentes quimioterapéuticos y moléculas pequeñas.

Inyección intraductal de entrega de la droga localizada a la glándula mamaria de ratón

La activación de mutaciones latentes con adenovirus Cre en los resultados del sistema ductal de mama en un cáncer de mama metastásico clínicamente relevante. La incorporación de un promotor YFP permite el seguimiento de las células tumorales metastásicas distales. Este modelo es útil para estudiar la metástasis latentes, la inmunidad anti-tumoral, y para el diseño de nuevas inmunoterapias para tratar el cáncer de mama.

Inicio de la metástasis de carcinoma de mama mediante la Focalización del epitelio ductal con adenovirus Cre: Un modelo de ratón transgénico de Novela del Cáncer de Mama

El cáncer es una enfermedad compleja que se ve influenciada por el tejido que rodea al tumor, así como pro- local y anti-inflamatorias mediadores. Por lo tanto, los modelos de inyección de ortotrópicos, en lugar de los modelos subcutáneos pueden ser útiles para estudiar la progresión del cáncer de una manera que imita mejor la patología humana.

Inyección ortotópico de células de cáncer de mama en el Mamaria Fat Pad de ratones para estudiar el crecimiento del tumor.

Aquí, describimos una técnica para la administración localizada de reactivos a la glándula mamaria del conejo a través de una inyección intraductal. Además, describimos un protocolo para la visualización y la confirmación de la administración mediante ecografía de alta resolución de agentes de contraste.

Intraductal La entrega al conejo Glándula Mamaria

Aquí, presentamos un protocolo para implantar las células de cáncer de mama en la almohadilla de grasa mamaria de manera sencilla, menos forma invasiva y fácil de manejar, y este modelo Murino ortotópico mama cáncer con un entorno de almohadilla de grasa mamaria adecuada puede utilizarse para investigar diversos aspectos de la cáncer.

Ortotópico inyección de las células de cáncer de mama en la almohadilla de grasa mamaria de ratones

El objetivo de este protocolo es describir un nuevo enfoque de modelado de cáncer de mama basado en la inyección intraductal de adenovirus Cre-expressing en las glándulas mamarias del ratón. Este enfoque permite la manipulación específica del tipo de célula y del órgano de los eventos oncogénicos de una manera controlada temporalmente.

Modelar el cáncer de mama a través de una inyección intraductal de Adenovirus C-expreso en la Glándula Mamaria del Ratón

Se describe un método de inyección intraductal de reactivos para una solución ablativa a base de etanol al árbol ductal mamario de ratón para imágenes in vivo y prevención del cáncer de mama. La inyección directamente en la abertura del pezón permite dirigirse a las células epiteliales mamarias con un daño mínimo en el tejido colateral.

Administración intraductal y visualización por rayos X de la solución ablativa a base de etanol para la prevención y el tratamiento local del cáncer de mama en modelos de ratón

El presente protocolo describe una técnica sencilla para la obtención de imágenes intravitales de la glándula mamaria de ratón lactante mediante microscopía confocal y multifotónica de barrido láser.

Microscopía subcelular intravital de la glándula mamaria

El manuscrito describe una metodología para el establecimiento y seguimiento longitudinal del crecimiento de las metástasis pulmonares espontáneas de tumores de mama inyectados ortotópicamente, susceptibles de intervención en todas las etapas de la cascada metastásica.

In vivo Diagnóstico por imágenes para medir la metástasis pulmonar espontánea de células tumorales de mama inyectadas ortotópicamente

Este protocolo describe un enfoque escalable de cribado intraductal CRISPR que permite estudios paralelos in vivo de eliminación y activación génica en la glándula mamaria del ratón.

Cribado in vivo paralelo de la eliminación y activación génica en la glándula mamaria del ratón

Aprenda a realizar inyección intraductal mamaria para entrega génica en células epiteliales de ratón usando vectores virales. Este método permite un control cuantitativo temporal que mejora el modelado de tumores mamarios naturales.

In vivo Entrega de genes en células epiteliales mamarias de ratón a través de inyección intraductal mamaria

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