In vivo Entrega de genes en células epiteliales mamarias de ratón a través de inyección intraductal mamaria

Este método entrega el material genético en las células epiteliales de la glándula mamaria de una manera especial, temporal y cuantitativamente controlable. Dado que la entrega de material genético en las células epiteliales mamarias es especial, temporal y cuantitativamente controlada, los modelos mamarios generados por este método imitan mejor la génesis natural del tumor. Comience la preparación de la jeringa cortando las agujas metálicas de calibre 33 a aproximadamente un centímetro de largo y almacenándolas en alcohol.

Retire las jeringas y agujas del alcohol y expulse el alcohol restante de la jeringa y las agujas. Luego desmonte la jeringa para secar al aire. Después del secado, ensamble la jeringa.

Saque los tubos de stock viral del congelador de menos 80 grados centígrados y descongélelos en hielo. Para añadir azul de bromofenol, sumerja la punta de la pipeta a una profundidad de un centímetro en el polvo azul de bromofenol. Luego lleve la traza adjunta de azul de bromofenol a la suspensión del virus.

Mezcle el azul de bromofenol con la solución de virus pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces, antes de colocar el virus en hielo. Verifique la profundidad de la anestesia pellizcando el dedo del pie de un ratón hembra anestesiado. Aplique ungüento en los ojos para evitar la sequedad mientras el animal está bajo anestesia.

Coloque el ratón en posición supina sobre una almohadilla caliente y fije las cuatro extremidades al banco con cinta adhesiva. Identifique el pezón que se inyectará y expóngalo recortando el vello circundante con tijeras. Aplique 70% de alcohol y cuatro hisopos en tres rondas alternas en el área del pezón para limpiar y exponer el pezón.

Transecto la punta distal de un pezón con un par de tijeras de resorte de microdisección esterilizadas, hasta que se pueda ver una pequeña abertura ductal central debajo de una lámpara de lupa. Luego cargue 10 microlitros de la mezcla de azul de bromofenol del virus en la jeringa e inserte cuidadosamente la aguja en la abertura del pezón con la ayuda de la lámpara de la lupa. Inyecte los 10 microlitros completos del virus en el árbol de conductos y coloque el ratón en un calentador de diapositivas ajustado a 45 grados centígrados hasta que el ratón se despierte por completo.

Abra la cavidad torácica de tres a cinco días después de la inyección del virus. Corte la piel a lo largo de la línea media ventral y las extremidades superiores e inferiores con tijeras. Levante la piel y exponga las glándulas mamarias.

Retire la glándula mamaria inyectada de la piel y una glándula no inyectada como control con fórceps y tijeras. Una vez hecho esto, coloque la glándula mamaria en un portaobjetos de vidrio y extienda la glándula a su forma original antes de observarla y obtener imágenes bajo un microscopio estereoscópico fluorescente. El éxito de la inyección intraductal se confirmó al exponer la glándula mamaria y observar un árbol ductal azul.

Después de dos a cinco días de la inyección del virus lenti-EGFPFUCGW, la infección de células epiteliales mamarias se evaluó observando toda la preparación del monte bajo un microscopio estereoscópico fluorescente. Para el análisis de citometría de flujo de las proteínas fluorescentes o marcadores de superficie celular producidos por el virus, las glándulas no infectadas y las glándulas infectadas se recolectaron y procesaron en una suspensión de una sola célula para estimar la tasa de infección viral. El ERBBB2 activado provocó lesiones precancerosas en unas pocas semanas y tumores en unos pocos meses.

El tamaño de los pezones puede variar significativamente debido a las diferencias en masa, edad, peso corporal y fuerza entre los ratones individuales. Recortar adecuadamente la punta del pezón para exponer la abertura del conducto mamario y el ajuste de la aguja es un paso importante para inyectar con éxito el virus.