Evaluación ecográfica no invasiva de la progresión del cáncer de endometrio en la deleción dirigida por Pax8 de los supresores tumorales Arid1a y Pten en ratones

Este estudio muestra que el ultrasonido guiado manual es adecuado para monitorear el desarrollo de la patología uterina en un modelo de ratón inducido de cáncer de endometrio. Las imágenes de ultrasonido no son invasivas y, por lo tanto, permiten estudios longitudinales de ratones individuales a lo largo de días y semanas. Esto permite la captura de la variación individual y, en última instancia, que se utilicen menos animales para el estudio.

Este método se puede aplicar fácilmente para monitorear los cambios patológicos y otros modelos de reflejo, incluidos los de neoplasia y enfermedad crónica del tracto urinario y digestivo. Comience a configurar la máquina de ultrasonido para obtener imágenes del útero o el ovario seleccionando un transductor o sonda con un rango de 32 a 56 megahercios. Vaya a la pestaña Aplicaciones de la pantalla de inicio y seleccione Modo de abdomen pequeño del mouse.

Luego haga clic en Escanear para volver a la pantalla de inicio y espere a que se muestre una imagen en vivo. A continuación, seleccione Modo B de las opciones de la barra de herramientas izquierda antes de hacer clic en la opción Más controles para ver herramientas adicionales para el refinamiento de la imagen, como la ganancia y profundidad de la imagen o para ajustar la configuración de adquisición de clips, como el número de fotogramas por segundo. Una vez seleccionada la configuración de la imagen, vuelva a la pantalla de inicio haciendo clic en Modo B.

Coloque una jeringa de tres a 10 mililitros llena de una solución fluida isotónica estéril entre una almohadilla térmica y una almohadilla absorbente durante varios minutos para precalentarla a 35 a 40 grados centígrados. Si la máquina no tiene un calentador, coloque una botella de gel de ultrasonido en la almohadilla térmica. Para inyectar de uno a dos mililitros de solución en la cavidad peritoneal de un ratón, asegure el ratón con el scruff en una mano, exponiendo el ventrum.

Luego sostenga el mouse en un ángulo de aproximadamente 20 grados con la nariz apuntando al piso. Inserte una aguja de jeringa de tuberculina de calibre 25 a través de la piel y la pared abdominal del cuadrante caudal derecho del abdomen. Para evitar la inyección en la vasculatura o el tracto gastrointestinal, tire hacia atrás del émbolo de la jeringa con una presión mínima para buscar sangre.

Coloque el ratón en recostado ventral sobre la almohadilla absorbente sobre una almohadilla térmica antes de colocar de forma segura un cono de nariz de roedor sobre la nariz y el hocico del ratón. Coloque una pequeña cantidad de gel de ultrasonido abaxial precalentado en la columna vertebral a cada lado del ratón anestesiado entre la última costilla y la pelvis. Ponga una pequeña cantidad de gel en la sonda de ultrasonido.

A continuación, coloque la sonda paralela a las vértebras con la parte frontal de la sonda en el lado craneal. Con un ratón en decúbito ventral, escanee lentamente el área en busca del punto de referencia renal. Con el riñón a la vista, tire de la sonda caudal para encontrar el ovario, que es una estructura ovalada a redonda ligeramente hiperecoica dentro de una almohadilla de grasa ovárica muy hiperecoica, bordeada cráneo-ventralmente por el riñón y dorsal-lateralmente por la pared abdominal dorsal.

Mejore el contraste de la imagen ajustando la ganancia de señal utilizando el control deslizante en la parte inferior de la pantalla de control. Para mejorar la obtención de imágenes del riñón, aplique presión en el abdomen contralateral con un dedo. Varíe la presión y el ángulo de paralelo a la columna vertebral a aproximadamente 20 grados ventral.

Una vez que el órgano de interés esté a la vista, capture un video haciendo clic en Guardar clip o Iniciar grabación. Una vez hecho esto, haga clic en Detener grabación para conservar las imágenes en un número preestablecido de fotogramas. Sostenga la sonda caudalmente hasta que el ovario esté en el aspecto más craneal del campo de visión.

Varíe la presión y el ángulo de la sonda para ver y obtener imágenes del útero. Repita la colección de vídeo y fotogramas para cada órgano de interés. Encuentra el útero corriendo longitudinalmente a lo largo de la pared abdominal dorsal con la musculatura lateral de la pierna a la vista.

Controle el tejido para un movimiento peristáltico para diferenciar los asas intestinales de los cuernos estacionarios uterinos. Coloque el ratón en reclinación dorsal para recoger las imágenes de un enfoque ventral. Asegúrese de que la lubricación ocular sea suficiente y que el hocico esté asegurado en el cono de la nariz.

Aplique una pequeña cantidad de gel de ultrasonido precalentado en el abdomen ventral antes de aplicar la sonda en la línea media y craneal del pubis para localizar la vejiga como un punto de referencia hipoecoico. Para encontrar los cuernos uterinos, tire de la sonda lateral a la vejiga. Aplique una ligera presión digital desde uno o ambos lados del ratón.

Una vez que los cuernos uterinos estén en el campo de visión, sostenga la sonda perpendicular al ratón y escanee ambos lados del abdomen para capturar vistas transversales de ambos cuernos. Gire la sonda para capturar vistas sagitales. Después de la ecografía, limpie el ratón con una toalla de papel antes de devolverlo a su jaula para recuperarse.

Una vez que el ratón esté completamente despierto después de dos a cinco minutos, devuelva el ratón a la habitación del animal. La comparación de imágenes de ultrasonido de la cavidad abdominal del ratón antes y después de la inyección de solución salina mostró la visualización mejorada de los órganos abdominales, incluidos el útero y los ovarios después de la inyección de solución salina. Se utilizó un enfoque ventral para estudiar las secciones transversales de los cuernos uterinos adyacentes a la vejiga hipoecoica.

Se utilizó inmunohistoquímica con anticuerpos dirigidos contra Arid1a y Pten para estudiar la pérdida adecuada de proteínas supresoras de tumores lograda en las células epiteliales uterinas en comparación con el tejido estromal vecino. Las imágenes de ultrasonido de un útero de ratón con cambios patológicos tempranos se detectaron después de tres semanas de tratamiento con doxiciclina, mostrando la luz hipoecoica y dilatada del útero. En el estudio de patología macroscópica e histopatología del mismo útero, se observó un útero de paredes delgadas más pequeño pero dilatado e hiperplasia endometrial temprana con la preservación de la luz distinta, respectivamente.

Los ratones sacrificados en puntos de tiempo posteriores mostraron útero más grande con una luz más pequeña y una pared engrosada. Al aprender a usar la colocación manual de sondas, la presión excesiva o el movimiento rápido pueden dificultar la identificación de órganos. Use movimientos suaves y deliberados y concéntrese en identificar primero los órganos que son puntos de referencia.

Al final del estudio, los ratones se sacrifican y se recolecta tejido para confirmar la eliminación de genes y caracterizar los cambios en los tejidos. Esta técnica permite a los investigadores monitorear las lesiones intraabdominales a lo largo del tiempo. Y en nuestro caso, lo usamos para monitorear la progresión del cáncer uterino en el modelo iPad, que luego confirmamos mediante histopatología.