Microdisección y microscopía electrónica de barrido de montaje completo Visualización del plexo coroideo del ratón

Para obtener una mejor comprensión de la composición y estructura del plexo coroideo, un método eficiente para aislar el plexo coroideo de los ventrículos cerebrales es un primer paso invaluable. Con esta técnica de microdisección es posible diseccionar el plexo coroideo fuera de los ventrículos cerebrales mientras se contiene su función, viabilidad y estructura sin contaminar el plexo coroideo con tejido circundante. Un obstáculo importante en el aislamiento del plexo coroideo es identificar la estructura, ya que todavía flota en los ventrículos cerebrales.

La tinción del plexo coroideo con azul de bromofenol facilita el aislamiento. Demostrando el procedimiento estará Elien Van Wonterghem, nuestro gerente de laboratorio. Comience con la preparación de un anestésico terminal, una solución de perfusión transcárdica y una solución requerida para la microscopía electrónica de barrido, o SEM, y otras soluciones como se menciona en el texto.

Para aislar el cerebro del ratón, coloque al animal anestesiado terminalmente en la posición de decúbito dorsal y fije al ratón fijando las extremidades en una placa. Desinfecte el tórax rociando etanol al 70% antes de hacer una incisión de aproximadamente cuatro centímetros justo debajo del diafragma con una cuchilla quirúrgica de acero al carbono. Abra la piel y exponga el pecho con tijeras quirúrgicas.

Corte el diafragma completamente abierto y separe el tórax para exponer los pulmones y el corazón latiendo. Usando una bomba de perfusión transcárdicamente perfundir al ratón con 10 mililitros de la solución de perfusión a una velocidad de 4,5 mililitros por minuto. Inserte una aguja de calibre 26 en el ventrículo izquierdo para bombear la solución al circuito sistémico.

Con tijeras quirúrgicas, corte la aurícula derecha para que la sangre salga de la circulación. Después de la decapitación del ratón cortar el cuero cabelludo haciendo una incisión que comienza entre las orejas hasta el superior a los ojos. Tire de la piel lateralmente para exponer el cráneo.

Luego abra el cráneo siguiendo las suturas escamosas hacia la parte nasal. Una vez hecho esto, coloque el cerebro en una placa de Petri helada y agregue un mililitro de PBS helado al tejido cerebral. Para aislar el plexo coroideo que flota en el cuarto ventrículo, corte suavemente el cerebelo del cerebro con un bisturí.

Extraer las partes restantes del tejido del tronco encefálico del cerebelo. Gire el cerebro de modo que la línea de corte esté orientada hacia arriba, asegurándose de que la cuarta cavidad del ventrículo sea visible en el centro de la sección con el plexo coroideo en el sitio dorsal. Si es necesario, abra el ventrículo tirando del tejido conectivo con pinzas afiladas.

Arranca suavemente el plexo coroideo de la pared del ventrículo con pequeños fórceps afilados. Para aislar el plexo coroideo del ventrículo lateral, corte sagitalmente el cerebro en dos hemisferios usando pequeños fórceps afilados. Gire un hemisferio cerebral para que la línea de corte esté hacia arriba.

Para revelar el ventrículo lateral tira suavemente de la corteza del tálamo. Retraiga el hipocampo hasta la línea de corte sagital medio. El ventrículo lateral ahora es visible con el plexo coroideo en la parte inferior del ventrículo.

Si es necesario, abra un poco el ventrículo abriendo el tejido conectivo con pinzas afiladas. Use fórceps diminutas y afiladas para arrancar suavemente el plexo coroideo de la pared del ventrículo. Para realizar la preparación de la muestra para SEM, transfiera el plexo coroideo recién aislado a una solución de fijación recién hecha e incube durante la noche a cuatro grados centígrados.

Una vez hecho esto, lave la muestra tres veces usando de tres a cinco mililitros de tampón de cacodilato de sodio molar 0.1 durante cinco minutos cada uno. Coloque las muestras en tres a cinco mililitros de tetróxido de osmio al 2% en tampón de cacodilato de sodio molar al 0,1 durante 30 minutos. Luego lave las muestras tres veces durante cinco minutos, cada una usando de tres a cinco mililitros de agua ultrapura.

A continuación, deshidrate las muestras en una serie creciente de concentraciones de alcohol etílico helado con 15 minutos por solución de alcohol etílico. Utilice un secador de punto crítico para secar la muestra correctamente. Coloque la muestra cuidadosamente en un soporte de muestra con una etiqueta de carbono y visualice las muestras del plexo coroideo usando SEM.

El presente protocolo facilitó el aislamiento eficiente del plexo coroideo del cerebro del ratón lateral y cuarto ventrículo. La perfusión con azul de bromofenol resultó en la visualización del plexo coroideo. Cuando el azul de bromofenol no se permitió en los pasos de procesamiento adicionales, se realizó la perfusión con PBS-heparina o ninguna perfusión para el procesamiento.

El análisis morfológico SEM de la superficie del plexo coroideo epitelial, o CPE, muestra claramente la estructura de dos brazos del cuarto ventrículo y la forma típica en forma de C del plexo coroideo lateral aislado del ventrículo lateral. Un mayor aumento de SEM reveló estructuras similares a vesículas en el lado apical de las células CPE y las microvellosidades, lo que indica que las alteraciones morfológicas de las células CPE en condiciones de enfermedad pueden investigarse utilizando SEM. Es importante tocar y extraer solo el tejido del plexo coroideo para no contaminar la muestra con tejido circundante.

Tenga las precauciones necesarias para preservar la estructura del plexo coroideo. Se puede aplicar una variedad de técnicas posteriores en el plexo coroideo aislado para investigar su estructura y función, desde el análisis microscópico hasta el análisis del transcriptoma y la citometría de flujo. La microdisección del plexo coroideo fuera del cerebro nos permite obtener una mejor comprensión de la estructura y función de este pequeño tejido cerebral.

Este conocimiento es esencial para comprender mejor su papel en las enfermedades neurológicas.