Name: Métodos para estudiar las contribuciones uterinas al establecimiento del embarazo en un modelo de ratón ovariectomizado (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-07T12:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: Aprende técnicas de ovariectomía en ratones para estudiar las contribuciones uterinas al establecimiento del embarazo. Este método permite investigar la regulación del eje hipotálamo-hipofisario-gonadal en modelos animales.

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Este trabajo fue posible gracias al Apoyo a la Infraestructura Operativa del Gobierno del Estado de Victoria y al Consejo Nacional de Investigación Médica y de Salud del Gobierno de Australia (NHMRC) IRIISS. Este trabajo fue apoyado por la Subvención de Acceso a la Plataforma de Ciencias de la Salud de la Facultad de Medicina, Enfermería y Ciencias de la Salud de la Universidad de Monash a A.L.W. (Winship-PAG18-0343) para acceder a la Plataforma de Servicios Reproductivos de Monash. A.L.W. cuenta con el apoyo de DECRA financiando DE21010037 del Consejo Australiano de Investigación (ARC). J.N.H. y L.R.A. cuentan con el apoyo de una beca del Programa de Capacitación en Investigación del Gobierno de Australia. L.R.A. cuenta con el apoyo de una beca Monash Graduate Excellence. K.J.H. cuenta con el apoyo de una beca ARC Future FT190100265.

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</ol>

Los autores declaran que no hay intereses financieros o de otro tipo en conflicto.

Este artículo proporciona instrucciones paso a paso sobre cómo realizar OVX y proporcionar hormonas exógenas para estudios centrados en la comprensión de las contribuciones uterinas al embarazo y la fertilidad. Se proporcionan dos protocolos detallados sobre dos aplicaciones experimentales de estos métodos, incluida la realización de la transferencia de embriones y la inducción de la decidualización artificial.
Si bien realizar OVX puede ser un desafío inicialmente, especialmente para los inve...

Con el creciente uso de tecnologías de reproducción asistida en las últimas décadas, se han superado muchas barreras para la concepción, lo que permite a muchas parejas formar familias a pesar de los problemas de fertilidad1. Los déficits de ovocitos o espermatozoides a menudo se pueden evitar mediante fertilización in vitro o inyección intracitoplasmática de espermatozoides; Sin embargo, las cuestiones relacionadas con el útero y la receptividad endometrial siguen siendo una elusiva "caja negra" de potencial reproductivo2.
El embarazo se establece cuando un embrión de alta calidad interactúa con éxito con un endometrio receptivo (revestimiento uterino). Las posibilidades de éxito del embarazo en cualquier ciclo menstrual son bajas, alrededor del 30%3,4. De las que tienen éxito, solo el 50%-60% avanzan más allá de las 20 semanas de gestación, siendo el fracaso de la implantación responsable del 75% de los embarazos que no llegan a las 20 semanas3. A pesar de estas cifras que se remontan a finales de la década de 1990, el campo aún no ha superado las limitaciones causadas por un endometrio inadecuadamente receptivo. Esto ha resultado en un estancamiento - y a veces disminución - de las tasas de éxito de FIV en los últimos años 5,6.
Las mujeres con infertilidad inexplicable a menudo tienen una ventana desplazada de receptividad o no pueden lograr la receptividad por razones desconocidas. Recientemente, se desarrolló la matriz de receptividad endometrial, que evalúa la expresión de cientos de genes con el propósito de adaptar el momento de la transferencia embrionaria a la ventana de receptividad de un individuo 7,8,9. Sin embargo, el campo todavía carece de una comprensión de la patogénesis de las complicaciones del embarazo que se manifiestan después de que se completa el proceso de implantación.
El sistema reproductor femenino es altamente dinámico y está bajo un estricto control hormonal. El eje hipotalámico-pituitario-gonadal (HPG) controla la liberación de la hormona luteinizante y la hormona foliculoestimulante, que regulan aspectos del ciclo ovárico, incluida la maduración del folículo y la actividad del estrógeno y la progesterona. A su vez, el ciclo menstrual uterino está regulado por estrógenos y progesterona10,11. Por lo tanto, el estudio de los mecanismos biológicos uterinos se complica por la influencia ovárica. Por ejemplo, cuando se estudia cómo las terapias contra el cáncer pueden afectar el útero, puede ser difícil distinguir si cualquier fenotipo uterino observado (como la pérdida del embarazo o la aciclicidad menstrual) es el resultado de un insulto directo al útero o un efecto consecuente del daño a los ovarios.
Para comprender de manera integral la fertilidad, se deben caracterizar las contribuciones uterinas al embarazo. Es importante destacar que esta comprensión debe extenderse más allá de la función uterina bajo control ovárico. Esto no se puede estudiar en humanos; Por lo tanto, a menudo se emplean modelos animales. Como tal, la ovariectomía (OVX) se usa comúnmente para permitir a los investigadores regular los ciclos estrales de roedores (análogos al ciclo menstrual) mediante el suministro de hormonas exógenas. Además, el OVX permite estudiar las respuestas uterinas independientemente de la influencia ovárica12. Sin embargo, si las hormonas no se suministran inmediatamente después de OVX, se producirá un fenotipo de menopausia, que debe ser considerado cuidadosamente por los investigadores.
OVX se utiliza con frecuencia en modelos de roedores 13,14,15,16,17 y es relativamente fácil de realizar después de un entrenamiento adecuado. Los métodos varían dependiendo de si se extirpa el ovario solo o el ovario y el oviducto, así como dependiendo de la edad del animal (los animales adultos en ciclo tienen ovarios más grandes con un cuerpo lúteo visible en su superficie, lo que significa que sus ovarios son más fáciles de visualizar). Del mismo modo, existen muchos métodos de suplementación hormonal, incluidas las inyecciones subcutáneas14, los gránulos de liberación lenta 15, las mini bombas osmóticas18 y el injerto de ovario.
En este artículo, se proporcionan instrucciones detalladas sobre cómo realizar la ovariectomía y preparar tres tipos de suplementos hormonales, incluidas las inyecciones subcutáneas, los gránulos de liberación lenta y las mini bombas osmóticas. Se proporcionan dos protocolos detallados para los criterios de valoración experimentales que se benefician de OVX seguido de la suplementación con hormonas exógenas (transferencia de embriones y decidualización artificial). Este artículo discute las fortalezas y debilidades de cada enfoque con el objetivo de guiar a los investigadores sobre cómo realizar estudios para aislar los impactos en el útero, específicamente en los campos de investigación del embarazo y la fertilidad.

<table><tbody><tr><td>Mini bombas osmóticas ALZET 1002</td><td>BioScientific</td><td>1002</td><td>Entrega 0.25 &micro; L/h durante 14 días. Uso para la sección 7 (Procedimiento experimental - Transferencia de embriones).</td></tr><tr><td>Mini bombas osmóticas ALZET 1003D</td><td>BioScientific</td><td>1003D</td><td>Entrega 1 &micro; L/h durante 14 días. Uso para la sección 8 (Procedimiento experimental - Decidualización artificial).</td></tr><tr><td>ALZET Pinzas Reflex de 7 mm</td><td>BioScientific</td><td></td><td>0009971 Para el cierre de heridas se pueden utilizar pinzas Reflex o pinzas Michel para el cierre de heridas, según las preferencias</td></tr><tr><td>Aplicador de pinzas ALZET Reflex</td><td>BioScientific</td><td>0009974</td><td>Para el cierre de heridas se pueden utilizar pinzas Reflex o pinzas Michel, según las preferencias.</td></tr><tr><td>ALZET Reflex clip remover</td><td>BioScientific</td><td>0009976</td><td>Se pueden utilizar clips Reflex o clips Michel para el cierre de heridas, según las preferencias</td></tr><tr><td>Bupivicaine inyectable</td><td>Pfizer</td><td>NA</td><td>Stock 0,5%. Usar al 0,05% en solución salina</td></tr><tr><td>Estradiol</td><td></td><td>Sigma E8875</td><td></td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>Ilium</td><td>NA</td><td>Constituyente activo 0,5 mg/mL. Use 3.5 mL por cada botella de agua de jaula de 400 mL, o según lo recete el veterinario de su institución.</td></tr><tr><td>Pinzas Michel</td><td>Daniels</td><td>NS-000242</td><td></td></tr><tr><td>Sellador multiusos</td><td>Dow Corning</td><td>732</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo de transferencia de embriones no quirúrgico (NSET)</td><td>ParaTechs</td><td>60010</td><td>Contiene espéculo de 6 mm. Solo de un solo uso.</td></tr><tr><td>Progesterona</td><td>Sigma</td><td>P0130</td><td>Soluble en etanol. Uso para&nbsp; sección 3 (Preparación hormonal - inyección subcutánea) y&nbsp; sección 4 (Preparación hormonal - pellets de liberación lenta)</td></tr><tr><td>Progesterona</td><td>Sigma</td><td>P7556</td><td>Soluble en agua. Úselo para la sección 5 (Preparación de hormonas - minibombas osmóticas)</td></tr><tr><td>Pomada refrescante para los ojos</td><td>Allergan</td><td>NA</td><td>42,5% p/v parafina líquida, 57,3% p/v parafina blanca blanda</td></tr><tr><td>Rimadyl Carprofeno Zoetis</td><td></td><td>NA</td><td>Stock 50 mg/mL. Usar a 1 mg/ml (para dosis de 5 mg/kg)</td></tr><tr><td>Tubo de goma</td><td>Dow Corning</td><td>508-008</td><td>Lavado en etanol 100% y cortado en trozos de 1 cm. Diámetro interior 1,57 mm &plusmn; &nbsp; 0,23 mm; diámetro exterior 3,18 mm y plusmn; 0,23 mm; Pared 0,81 mm.</td></tr><tr><td>Aceite de sésamo</td><td>Sigma</td><td>S3547</td><td></td></tr><tr><td>Sofsilk Suturas de seda tamaño 3-0</td><td>Covidien</td><td>GS-832</td><td></td></tr></tbody></table>

métodos para estudiar las contribuciones uterinas al establecimiento del embarazo en un modelo de ratón ovariectomizado

Methods for Studying Uterine Contributions to Pregnancy Establishment in an Ovariectomized Mouse Model

Para que se establezca el embarazo, un blastocisto viable debe interactuar con éxito con un revestimiento uterino receptivo (endometrio) para facilitar la implantación y la formación de placenta y permitir el embarazo continuo. Las limitaciones para el éxito del embarazo causadas por defectos embrionarios son bien conocidas y se han superado en gran medida en las últimas décadas con el aumento de la fertilización in vitro (FIV) y las tecnologías de reproducción asistida. Hasta ahora, sin embargo, el campo no ha superado las limitaciones causadas por un endometrio inadecuadamente receptivo, lo que resulta en un estancamiento de las tasas de éxito de la FIV. Las funciones ováricas y endometriales están estrechamente entrelazadas, ya que las hormonas producidas por el ovario son responsables de la ciclicidad menstrual del endometrio. Como tal, cuando se utilizan modelos de embarazo con roedores, puede ser difícil determinar si un resultado observado se debe a un déficit ovárico o uterino. Para superar esto, se desarrolló un modelo de ratón ovariectomizado con transferencia embrionaria o decidualización artificial para permitir el estudio de las contribuciones específicas uterinas al embarazo. Este artículo proporcionará instrucciones sobre cómo realizar la ovariectomía y ofrecerá información sobre diversas técnicas para suministrar hormonas exógenas para apoyar la decidualización artificial exitosa o el embarazo después de la transferencia de embriones de donantes sanos. Estas técnicas incluyen inyección subcutánea, pellets de liberación lenta y mini bombas osmóticas. Se discutirán las ventajas y desventajas clave de cada método, lo que permitirá a los investigadores elegir el mejor diseño de estudio para su pregunta de investigación específica.

En este documento de protocolo se describe un modelo bien caracterizado de decidualización artificial (Figura 1A). Aquí, ratones hembra adultos jóvenes (8 semanas de edad) se sometieron a ovariectomía quirúrgica como se describe en la sección 1 y la sección 2. Luego, los ratones descansaron durante 2 semanas para asegurarse de que las hormonas ováricas endógenas se disiparan antes de ser apoyadas con hormonas exógenas como se describe en las secciones 3-7 y sección 9. L...

El establecimiento del embarazo es un proceso dinámico que involucra diafonía compleja entre embriones y úteros. Las contribuciones precisas del entorno uterino materno a estos procesos siguen siendo un área activa de investigación. Aquí, se proporcionan protocolos detallados para ayudar en el diseño de modelos animales in vivo para abordar estas preguntas de investigación.

Métodos para estudiar las contribuciones uterinas al establecimiento del embarazo en un modelo de ratón ovariectomizado

For pregnancy to be established, a viable blastocyst must successfully interact with a receptive uterine lining (endometrium) to facilitate implantation ...

Por lo tanto, es difícil separar el papel de las influencias hormonales uterinas y ováricas en el establecimiento del embarazo, ya que ambas están íntimamente vinculadas. Así que este protocolo nos permite examinar directamente las contribuciones uterinas. Si bien algunas de estas técnicas, como la ovariectomía, son bastante invasivas, son relativamente simples de realizar después de la práctica y el entrenamiento, lo que las hace adecuadas para los investigadores que son nuevos en modelos de ratón.Por lo tanto, este método se puede utilizar para comprender la regulación más amplia del eje HPG, ya que tanto los ovarios como el útero desempeñan un papel importante en la regulación de este eje. Si nunca ha realizado estas técnicas antes, consulte con el equipo veterinario de su instituto para obtener capacitación y apoyo. Para comenzar, aplique lubricante para los ojos generosamente a un ratón anestesiado frotándolo suavemente en el ojo después de afeitarse un área pequeña en la abolladura debajo de la corazonada de la columna vertebral.Inyecte 0.1 mililitros de carprofeno por vía subcutánea en el cuello. Pruebe si el animal está anestesiado pellizcando su dedo trasero y verificando si hay un reflejo. A continuación, aplique Betadine en el sitio quirúrgico.Luego cúbralo con una cortina quirúrgica. Usando pinzas con dientes de rata, retire la piel en la corazonada hacia arriba y haga una incisión longitudinal de cinco milímetros. Luego, usando fórceps romos, diseccione la piel lejos de la capa muscular subyacente hacia un lado hacia el riñón.Identifique el riñón, el ovario y la almohadilla de grasa ovárica a través de la pared muscular. Agarre y levante la capa muscular con los fórceps. Luego, usando tijeras, haga una incisión de 0.5 a un centímetro de largo y tire de la almohadilla ovárica a través de la incisión con un par de pinzas romas.Luego, usando un soporte de aguja curvo, sujete debajo del ovario y el oviducto en el extremo distal del cuerno uterino y extirpe el ovario con tijeras. Después de 30 segundos, retire la abrazadera y aplique con una gasa estéril. Para cerrar la incisión de la pared muscular, levante la parte superior de la incisión con fórceps.Luego ate la incisión con el nudo de un cirujano usando suturas de seda. Aplique tópicamente unas gotas de bupivacaína con una jeringa de un mililitro sin accesorio de aguja, y aplique el exceso con una gasa estéril. Después de realizar de manera similar la ovariectomía en el otro lado, cierre la incisión de la piel presionando los dos lados de la piel juntos y aplicando un par de clips quirúrgicos de siete milímetros, dejando espacio para la hinchazón de la herida.Coloque todo el equipo requerido en una lámina dentro de una campana de bioseguridad de flujo laminar o Clase II y esterilice UV durante 20 minutos. Lave el tubo silástico en 100% desinol y deje que se seque al aire dentro de la campana. Una vez seco, corte el tubo en segmentos de un centímetro de largo con un bisturí.A continuación, exprima aproximadamente 200 microlitros de sellador en una jeringa sin émbolo. Reemplace el émbolo y empuje una pequeña cantidad de sellador. Aplique el sellador a un extremo del tubo, alisándolo con un dedo enguantado.Y deje que el sellador se seque durante la noche o bajo luz UV durante 30 minutos en la campana. A continuación, vierta el polvo de progesterona en una placa de Petri esterilizada. Coloque el polvo en gránulos con la ayuda de fórceps.Golpee el extremo sellado del pellet por la superficie de la campana para condensar el polvo. Luego selle el extremo abierto con el sellador. Envuelva la placa de Petri que contiene los gránulos en papel de aluminio para protegerlos de la luz.Aproximadamente 72 horas antes de la inserción subcutánea, active los gránulos incubándolos en FCS con tiras de carbón. Fiona Cousins, una científica investigadora de carrera temprana del Instituto Hudson de Investigación Médica. Después de preparar a los animales con inyecciones subcutáneas de estradiol, prepare a los animales con gránulos de progesterona subcutánea dos días antes de la decidualización artificial.Antes de la cirugía, anestesia al ratón y pruebe la profundidad de la anestesia verificando el reflejo de pellizco del dedo del pie. Luego coloque el mouse en posición prona, levante la cola e inserte lentamente un espéculo de seis milímetros en su vagina. Coloque la parte inferior del cuerpo del ratón entre los dos primeros dedos de la mano no dominante.Luego, usando el dedo índice, empuje suavemente la cola hacia arriba para permitir una mejor accesibilidad vaginal. Transfiera 20 microlitros de aceite de sésamo a una punta de transferencia de embriones no quirúrgica e inserte la punta a través de la vagina y el cuello uterino en el cuerno uterino. Expulsar lentamente el aceite.Una vez hecho esto, retire el espéculo de la vagina. En este estudio, el 80% de los ratones se sometieron a una decidualización exitosa, mientras que el 20% no lo hizo. Por lo tanto, es importante mantener todo su equipo quirúrgico y áreas de trabajo estériles y tener pacientes al insertar el dispositivo AINE a través del cuello uterino en el cuerno uterino del ratón.Después de inducir la decidualización artificial, el paladar de progesterona se puede eliminar para imitar la menstruación y estudiar la descomposición endometrial. Usando este método, podemos estudiar la biología uterina y la regulación independiente de la influencia de los ovarios. Esto es realmente emocionante en el área de la fertilidad y la salud de la mujer en general.

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Investigación

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Método Ex Vivo para evaluar la motilidad espontánea del tracto reproductivo de ratón y un algoritmo de seguimiento de movimiento del útero basado en MATLAB para el análisis de datos

Muchos modelos de roedores de endometriosis están limitados por la complejidad técnica, la reproducibilidad y / o la necesidad de animales inmunocomprometidos o ratones reporteros especiales. Presentamos un sistema simplificado de inducción de lesiones utilizando cualquier ratón experimental con un sistema de puntuación objetivo verificable de forma independiente y sin necesidad de ovariectomía o cirugía de supervivencia.

Un modelo murino singénico de endometriosis utilizando ratones de ciclo natural

Aquí, describimos el método de generación de un modelo de decidualización artificial utilizando el ratón ovariectomizado, un experimento clásico de decidualización endometrial en el campo de investigación de la decidualización endometrial.

Generación de un modelo de decidualización artificial de ratón con ovariectomía para la investigación de la decidualización endometrial

El método de manipulación cervical presentado puede inducir pseudoembarazo en ratones sin necesidad de reproductoras con machos vasectomizados. La inducción del pseudoembarazo es necesaria para el éxito de la transferencia embrionaria no quirúrgica y de la inseminación artificial no quirúrgica, que también se presentan.

Inducir pseudoembarazo en ratones hembra sin necesidad de machos vasectomizados antes de la transferencia embrionaria no quirúrgica o la inseminación artificial

La hormona folículo estimulante (FSH) en varios tejidos y órganos extragonadales se asocia con la patogénesis de múltiples enfermedades. El modelo de ratón ovariectomizado y tratado con FSH (OVF) se puede utilizar para explorar las acciones extragonadales de la FSH.

Exploración de los efectos independientes de la hormona folículo estimulante in vivo en un modelo de ratón

Este estudio presenta un nuevo modelo de ratón diseñado específicamente para simular el endometrioma, un subtipo clínicamente significativo de endometriosis. Mediante la utilización de ratones C57BL/6J, el modelo tiene como objetivo dilucidar los mecanismos fisiopatológicos que subyacen a la infertilidad relacionada con el endometrioma, ofreciendo una herramienta refinada para cerrar la brecha de conocimiento actual en medicina reproductiva.

Establecimiento de un modelo experimental de endometrioma en ratones para estudiar su infertilidad relacionada

Este artículo describe un protocolo detallado para producir un endometrio delgado fiable y reproducible con una tasa de mortalidad muy baja y adherencias intrauterinas mínimas mediante la inyección de etanol al 95% en el útero de ratón en 1-3 minutos.

Establecimiento de un modelo de ratón de endometrio delgado

Este protocolo describe un procedimiento para inducir lesiones uterinas en un modelo de ratón, seguido de análisis posteriores durante un embarazo posterior.

Modelo murino de lesión uterina quirúrgica y resultados posteriores del embarazo

Aprende técnicas de ovariectomía en ratones para estudiar las contribuciones uterinas al establecimiento del embarazo. Este método permite investigar la regulación del eje hipotálamo-hipofisario-gonadal en modelos animales.

Métodos para estudiar las contribuciones uterinas al establecimiento del embarazo en un modelo de ratón ovariectomizado

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