Name: Desarrollo rápido de circuitos de identificación del estado celular con politransfección (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T14:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Aprende a desarrollar circuitos genéticos mediante politransfección en células mamíferas. Este método permite probar múltiples estequiometrías en un solo pocillo, caracterizando relaciones entre componentes con mayor eficiencia experimental.

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Nos gustaría agradecer a los antiguos miembros de Weiss Lab que lideraron o contribuyeron al desarrollo del método de politransfección y su aplicación a los clasificadores celulares: Jeremy Gam, Bre DiAndreth y Jin Huh; otros miembros del laboratorio Weiss que han contribuido a un mayor desarrollo / optimización de métodos: Wenlong Xu, Lei Wang y Christian Cuba-Samaniego; Prof. Josh Leonard y miembros del grupo, incluidos Patrick Donahue y Hailey Edelstein, por probar la politransfección y proporcionar retroalimentación; y la profesora Nika Shakiba por invitar a este manuscrito y proporcionar comentarios. También nos gustaría agradecer a los Institutos Nacionales de Salud [R01CA173712, R01CA207029, P50GM098792]; Fundación Nacional de Ciencias [1745645]; Subvención de apoyo al Centro Oncológico (principal) [P30CCA14051, en parte] del NCI y de los Institutos Nacionales de la Salud [P50GM098792] para financiar este trabajo.

NOTA: La Tabla 1 y la Tabla 2 sirven como referencias significativas para este protocolo. La Tabla 1 muestra la escala de reactivos para las reacciones, y la Tabla 2 muestra la aritmética de la relación de ADN para un ejemplo de politransfección descrita en el protocolo (mitad superior) y para un posible experimento de seguimiento (mitad inferior).
1. Preparación de células para la transfección
<ol><li>Asegúrese de que el cultivo de células de riñón embrionario humano (HEK293) sea 60% -80% confluente antes de iniciar el protocolo. Para ello, sembrar 1 x 106 células en un cultivo de tejido de 100 mm x 15 mm en placa de Petri 2 días antes, e incubar a 37 °C con 5% deCO2. NOTA: Aunque nuestro protocolo se centra en las células HEK293, otros tipos de células pueden ser sustituidas.</li>
	<li>Prepare los medios y las células para las transfecciones como se describe a continuación.<ol><li>Precaliente al menos 20 ml de una solución del medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de aminoácidos no esenciales (NEAA; ver Tabla de materiales) a 37 °C. Precaliente al menos 2,4 ml de tripsina y 2,4 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 37 °C también. Precalentamiento reducido del medio sérico a ~16 °C. NOTA: Todo el trabajo de cultivo de tejidos debe realizarse con cuidado en un gabinete de bioseguridad.</li>
	</ol></li>
	<li>Vuelva a suspender las células en la solución DMEM como se describe a continuación.<ol><li>Aspirar y desechar los medios actuales. Dispense 2 ml de PBS en el cultivo celular HEK293 para lavar las células. Aspirar y desechar el PBS.</li>
		<li>Dispensar 2 ml de tripsina en el cultivo celular HEK293. Coloque la placa de Petri en una incubadora a 37 °C durante 3 minutos o hasta que las células ya no se adhieran a la placa. Devuelva el plato al gabinete de bioseguridad y diluya la solución celular dispensando 8 ml de solución DMEM en la placa.</li>
		<li>Mezcle la solución pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo varias veces. Aspirar todos los medios y colocarlos en un tubo cónico de 15 ml.</li>
	</ol></li>
	<li>Centrifugar las células a 300 x g durante 3 min para granularlas. Aspirar el medio (teniendo cuidado de no aspirar las células) y desecharlo. Resuspender las células en 5 ml de solución DMEM, mezclando pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.</li>
	<li>Calcule la concentración actual de células utilizando un contador de células automatizado (enumerado en la Tabla de materiales). Siembre seis pocillos (en este ejemplo) en una placa de 24 pocillos con 1 x 105 celdas (para una densidad de siembra de 50,000 células / cm2).</li>
	<li>Agregue la solución DMEM hasta 500 μL (agregue primero la solución DMEM a los pocillos) y luego etiquete un pocillo por tratamiento como el siguiente: sin control de color, control mKO2, control TagBFP, control NeonGreen, control de todo color y politransfección 1. Los pocillos de control TagBFP, mKO2 y NeonGreen son controles de un solo color para todas las proteínas fluorescentes incluidas en la politransfección.</li>
</ol>2. Realización de la transfección
<ol><li>Prepare tubos para cada agregado de ADN. Deje a un lado los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y etiquete los tubos como: sin control de color, control de mKO2, control de TagBFP, control de NeonGreen, control de todo color, mezcla de politransfección 1 y mezcla de politransfección 2.<ol><li>Agregue 36 μL de medio sérico reducido al control sin color, el control mKO2, el control TagBFP, el control NeonGreen y todos los tubos de control de color. Añadir 18 μL de medio sérico reducido a cada uno de los tubos de la mezcla de politransfección 1 y de la mezcla de politransfección 2. NOTA: Se supone que las concentraciones de plásmidos son de 150 ng/μL.</li>
		<li>Agregue 600 ng de plásmido de relleno al tubo sin control de color. Agregue 300 ng de mKO2 y 300 ng de plásmido de relleno al tubo de control de color mKO2. Agregue 300 ng de TagBFP y 300 ng de plásmido de relleno al tubo de control de color TagBFP.</li>
		<li>Agregue 300 ng de plásmido constitutivo NeonGreen y 300 ng de plásmido de relleno al tubo de control de color NeonGreen. Agregue 100 ng de mKO2, TagBFP y NeonGreen constitutivo, así como 300 ng de plásmido de relleno, al tubo de control de todo el color.</li>
		<li>Añadir 150 ng de mKO2 a la mezcla de politransfección 1 tubo. Agregue 75 ng de plásmido reportero NeonGreen y 75 ng de plásmido de relleno a la mezcla de politransfección 1 tubo.</li>
		<li>Añadir 150 ng de TagBFP a la mezcla de poli-transfección de 2 tubos. Agregue 75 ng de plásmido L7ae y 75 ng de plásmido de relleno al tubo de mezcla de politransfección 2.</li>
	</ol></li>
	<li>Cree la mezcla maestra de transfección en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml combinando 216 μL de medio sérico reducido con 9,48 μL de reactivo de transfección (consulte la Tabla 1 para conocer las proporciones de reactivos y la escala de reacción). Mezclar bien pipeteando arriba y abajo, y reservar.</li>
	<li>Agregue 1.58 μL de reactivo potenciador a cada uno de los tubos sin control de color, control de color único y todos los tubos de control de color. Añadir 79 μL de reactivo potenciador a cada uno de los tubos de mezcla de politransfección. Mezclar cada tubo individualmente pipeteando vigorosamente.</li>
	<li>Agregue la mezcla maestra de transfección a cada tubo que contenga ADN.<ol><li>Agregue 37.58 μL de mezcla maestra de transfección a cada uno de los tubos sin control de color, control de color único y todos los tubos de control de color. Mezclar cada tubo individualmente pipeteando vigorosamente.</li>
		<li>Añadir 18,79 μL de mezcla maestra de transfección a cada uno de los tubos de mezcla de politransfección. Mezclar cada tubo individualmente pipeteando vigorosamente.</li>
	</ol></li>
	<li>Dispense las mezclas de transfección en los pozos.<ol><li>Pipetear 65,97 μL de cada mezcla de transfección para los controles sin color, de un solo color y de todos los colores en los pocillos correspondientes.</li>
		<li>Pipetear 32,98 μL de la mezcla de politransfección 1 en el pocillo de politransfección y agitar la placa rápida pero suavemente en un patrón apretado en forma de ocho a lo largo de una superficie plana para distribuir los complejos de manera efectiva. A continuación, pipetear 32,98 μL de la mezcla de politransfección 2 en el mismo pocillo de politransfección y agitar la placa de la misma manera.</li>
	</ol></li>
	<li>Colocar la placa en una incubadora a 37 °C, con un 5% deCO2 y sin agitar, durante un período de 48 h. NOTA: Para aumentar la viabilidad celular, los medios celulares se pueden reemplazar cada 6 h después de la transfección (aunque esto no siempre es necesario, y con las células HEK293 y sus derivados, se debe tener cuidado de no separar las células de la placa al cambiar el medio).</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reactivo</td>
			<td colspan="3">Importe</td>
			<td colspan="3">Escalada</td>
		</tr><tr><td>Medio sérico reducido para la mezcla de ADN</td>
			<td colspan="3">36 μL por tubo de control, 18 μL por tubo de politransfección</td>
			<td colspan="3">0,05 μL Medio sérico reducido/ng de ADN por tubo, con un volumen adicional del 10-20% para tener en cuenta el pipeteo</td>
		</tr><tr><td>ADN</td>
			<td colspan="3">300-600 ng por tubo</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>P3000</td>
			<td colspan="3">1,58 μL por tubo de control, 0,79 μL por tubo de politransfección</td>
			<td colspan="3">0,0022 μL P3000/ng de ADN por tubo, con un 10-20% adicional</td>
		</tr><tr><td>Medio sérico reducido para Lipo master mix</td>
			<td colspan="3">36 μL por tubo de control, 18 μL por tubo de politransfección</td>
			<td colspan="3">0,05 μL de medio sérico reducido/ng de ADN total, con un volumen adicional del 10-20% para tener en cuenta el pipeteo</td>
		</tr><tr><td>Reactivo de transfección y potenciador</td>
			<td colspan="3">1,58 μL por tubo de control, 0,79 μL por tubo de politransfección</td>
			<td colspan="3">0.0022 μL Lipofectamina 3000/ng ADN, con 10-20% extra</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Incrustación de reactivos para transfecciones. La tabla indica la proporción correcta de reactivo a incluir para la cantidad de ADN incluida en un solo pozo. Esto se puede usar para escalar reacciones de manera efectiva y formar mezclas maestras. Las cantidades de reactivo se han escalado para incluir un exceso del 20%.
3. Preparación de células para citometría de flujo
<ol><li>Precaliente al menos 4,2 ml de la solución DMEM a 37 °C. Precaliente al menos 4,2 ml de tripsina y 4,2 ml de PBS a 37 °C. Mantenga la solución tampón de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) a 4 °C hasta que esté lista para usar.</li>
	<li>Resuspender las células en la solución tampón FACS (PBS suplementado con BSA al 1%, ácido etilendiaminotetraacético [EDTA] de 5 mM y azida de sodio al 0,1% [NaN3], para reducir la aglutinación; consulte la Tabla de materiales) como se describe a continuación.<ol><li>Aspirar y desechar los medios actuales en cada pozo. Dispense 5 ml de PBS en cada pocillo para lavar las células. Aspirar y desechar el PBS.</li>
		<li>Dispense 5 ml de tripsina en cada pocillo. Coloque el plato en una incubadora a 37 °C durante 3 minutos, o hasta que las células ya no se adhieran al plato. Devuelva la placa al gabinete de bioseguridad y diluya las soluciones celulares dispensando 5 ml de solución DMEM en cada pocillo.</li>
		<li>Para cada pocillo, mezcle la solución pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo varias veces. Para cada pocillo, aspire todos los medios y colóquelos en un tubo cónico de 15 ml.</li>
	</ol></li>
	<li>Centrifugar las células a 300 x g durante 3 min para granularlas. Aspirar el medio, teniendo cuidado de no aspirar las células y desecharlo. En cada tubo, resuspender las células en 5 ml de solución tampón FACS, mezclando pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.</li>
	<li>Pase cada solución de suspensión celular a través de un colador (para eliminar grumos) en tubos cónicos de citometría de flujo separados. Mantenga estos tubos en hielo durante no más de 1 h y realice la citometría de flujo lo antes posible.</li>
</ol>4. Realización de citometría de flujo
NOTA: El funcionamiento de un citómetro de flujo requiere una capacitación adecuada y el conocimiento de las tareas necesarias. Como el software y el equipo pueden variar y los usuarios deben ser entrenados en general, esta sección se refiere a operaciones específicas que son útiles para realizar.
<ol><li>Primero, examine las células transfectadas con el control del plásmido de relleno (sin control de color) para seleccionar las características celulares y evitar anomalías (incluidos agregados, desechos, etc.). Si bien hay muchas combinaciones de parámetros para distinguir celdas, utilice las siguientes tres opciones generales como una buena manera de visualizar las características distintivas.<ol><li>Mire el área de dispersión lateral (escala logarítmica o lineal por preferencia/tipo de celda) frente al área de dispersión directa (escala lineal).</li>
		<li>Mire la altura de dispersión lateral (escala logarítmica) frente al ancho de dispersión lateral (escala lineal).</li>
		<li>Mire el ancho de dispersión hacia adelante (escala lineal) frente a la altura de dispersión hacia adelante (escala lineal).</li>
	</ol></li>
	<li>A continuación, observe los controles de un solo color. Utilice el control de todo el color para ajustar los voltajes del instrumento, de modo que las señales de cada proteína fluorescente se normalicen a unidades arbitrarias equivalentes (u.a.) de fluorescencia. A continuación, ejecute los controles de color único para cada proteína fluorescente, que se utilizan para establecer la matriz de compensación, lo que permite la corrección del sangrado. NOTA: Idealmente, el rango dinámico completo de los valores de fluorescencia debería ser visible. Se puede hacer una mayor normalización de las señales de proteínas fluorescentes mediante la conversión a unidades estandarizadas (por ejemplo, moléculas de fluoresceína equivalente [MEFL; ver Beal et al.15]). Para habilitar la conversión MEFL durante el análisis, ejecute perlas de calibración arco iris. Dicha calibración también es útil para reducir la variación de la señal de instrumento a instrumento y del día a día16.</li>
	<li>Haga funcionar el tubo de muestra de politransfección. NOTA: Siempre que sea posible, se recomienda ejecutar celdas de 1,000 x 10^ (^ = mezclas), ya que las politransfecciones de dimensiones superiores deben subdividirse en más contenedores durante el análisis, y cada contenedor necesita suficientes celdas (idealmente >10) para hacer comparaciones estadísticamente significativas.</li>
</ol>5. Realización de análisis post-experimento
<ol><li>Inicialmente, utilice los datos de los controles (y, si corresponde, las cuentas) para garantizar resultados precisos. Utilice una de las herramientas de software disponibles para realizar la activación de células vivas (utilizando las puertas descritas anteriormente), la compensación y la corrección de autofluorescencia. NOTA: Normalmente utilizamos código MATLAB personalizado (por ejemplo, https://github.com/jonesr18/MATLAB_Flow_Analysis o Cytoflow17), que tiene una interfaz gráfica de usuario y una biblioteca de Python adecuada para la fase de preprocesamiento y para el análisis de politransfección.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Método</td>
			<td>Complejo</td>
			<td>ng Marcador fluorescente</td>
			<td>ng L7ae (fracción)</td>
			<td>ng Reportero (fracción)</td>
			<td>ng ADN de relleno (fracción)</td>
			<td>Total (ng)</td>
		</tr><tr><td>Politransfección 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>600</td>
		</tr><tr><td>→</td>
			<td>1</td>
			<td>150</td>
			<td>75 (½)</td>
			<td></td>
			<td>75 (½)</td>
			<td>300</td>
		</tr><tr><td>→</td>
			<td>2</td>
			<td>150</td>
			<td></td>
			<td>75 (½)</td>
			<td>75 (½)</td>
			<td>300</td>
		</tr><tr><td>Politransfección 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>600</td>
		</tr><tr><td>→</td>
			<td>1</td>
			<td>150</td>
			<td>25 (1/6)</td>
			<td></td>
			<td>125 (5/6)</td>
			<td>300</td>
		</tr><tr><td>→</td>
			<td>2</td>
			<td>150</td>
			<td></td>
			<td>125 (5/6)</td>
			<td>25(1/6)</td>
			<td>300</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 2: Cantidades de ADN para poli-transfección demostradas en el protocolo, y un ejemplo de experimento de seguimiento con proporciones de plásmidos sintonizados. La mitad superior de la tabla muestra la composición de los plásmidos utilizados en un experimento simple de politransfección. La mitad inferior muestra la composición de un experimento actualizado que ajusta las proporciones de plásmidos para submuestrear mejor un espacio de concentración hipotético, donde el modulador de la expresión génica está en una proporción más óptima de 1: 5 en relación con su reportero, produciendo más células transfectadas para muestrear alrededor de esta relación.

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<li>Sekuklu, S. D., Donoghue, M. T. A., Spillane, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-21+as+a+key+regulator+of+oncogenic+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">miR-21 as a key regulator of oncogenic processes.</a> Biochemical Society Transactions. 37, 918-925 (2009).</li>
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<li>Stanton, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+transfer+of+prokaryotic+sensors+and+circuits+to+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Systematic transfer of prokaryotic sensors and circuits to mammalian cells.</a> ACS Synthetic Biology. 3 (12), 880-891 (2014).</li>
</ol>

R.W. es cofundador de Strand Therapeutics y Replay Bio; R.W. y R.J. presentaron una patente provisional relacionada con un clasificador de tipo celular.

Los métodos de creación rápida de prototipos, como el diseño asistido por computadora (CAD), el breadboard y la impresión 3D, han revolucionado las disciplinas mecánicas, eléctricas y de ingeniería civil. La capacidad de buscar rápidamente a través de muchas soluciones posibles a un desafío dado acelera enormemente el progreso en un campo. Creemos que la politransfección es una tecnología análoga para la ingeniería biológica, que permite la creación rápida de prototipos de circuitos genéticos. Además, otras tecnologías d...

El campo de la biología sintética de mamíferos ha progresado rápidamente, desde el desarrollo de partes simples de detección y respuesta en líneas celulares cultivadas hasta la optimización de redes complejas de genes para abordar los desafíos del mundo real en diagnóstico y terapéutica1. Estos sofisticados circuitos son capaces de detectar entradas biológicas desde perfiles de microARN hasta citoquinas y fármacos de moléculas pequeñas, e implementar circuitos de procesamiento lógico que incluyen transistores, filtros de paso de banda, interruptores de palanca y osciladores. También han mostrado resultados prometedores en modelos animales de enfermedades como el cáncer, la artritis, la diabetes y muchos más 1,2,3,4,5. Sin embargo, a medida que crece la complejidad de un circuito, optimizar los niveles de cada uno de sus componentes se vuelve cada vez más desafiante.
Un tipo particularmente útil de circuito genético es un clasificador celular, que puede programarse para detectar y responder a los estados celulares. La producción selectiva de proteínas o salidas de ARN en estados celulares específicos es una herramienta poderosa para guiar y programar la diferenciación de células y organoides, identificar y destruir células enfermas y/o tipos de células indeseables, y regular la función de las células terapéuticas 1,2,3,4,5 . Sin embargo, la creación de circuitos en células de mamíferos que puedan clasificar con precisión los estados celulares de múltiples especies celulares de ARN y / o proteínas ha sido muy desafiante.
Uno de los pasos más lentos del desarrollo de un circuito de clasificación celular es optimizar los niveles de expresión relativos de los genes componentes individuales, como sensores y factores de procesamiento, dentro del circuito. Para acelerar la optimización de circuitos y permitir la construcción de circuitos más sofisticados, trabajos recientes han utilizado modelos matemáticos de circuitos clasificadores celulares y sus componentes para predecir composiciones y topologías óptimas 6,7. Si bien esto ha mostrado resultados poderosos hasta ahora, el análisis matemático está limitado por la necesidad de caracterizar sistemáticamente el comportamiento de entrada-salida de los genes componentes en el circuito, lo que lleva mucho tiempo. Además, una miríada de problemas dependientes del contexto pueden surgir en circuitos genéticos complejos, haciendo que el comportamiento de un circuito completo desafíe las predicciones basadas en caracterizaciones de partes individuales 8,9.
Para desarrollar y probar más rápidamente circuitos complejos de mamíferos, como los clasificadores de estado celular, nuestro laboratorio desarrolló una técnica llamada politransfección10, una evolución de los protocolos de cotransfección de plásmidos. En la cotransfección, múltiples especies de ADN plásmido se complejan junto con un reactivo lipídico o polimérico cargado positivamente, y luego se entregan a las células de manera correlacionada (Figura 1A). En la politransfección, los plásmidos se complejan por separado con el reactivo, de modo que el ADN de cada complejo de transfección se entrega a las células de manera descorrelacionada (Figura 1B). Usando este método, las células dentro de la población transfectada están expuestas a numerosas combinaciones de proporciones de dos o más cargas útiles de ADN que transportan diferentes componentes del circuito.
Para medir las proporciones de los componentes del circuito entregados a cada célula, cada complejo de transfección dentro de una politransfección contiene un reportero fluorescente expresado constitutivamente que sirve como un proxy para la absorción celular del complejo. El ADN de relleno que no contiene ningún elemento activo dentro de una célula de mamífero se utiliza para ajustar la cantidad relativa del reportero fluorescente y los componentes del circuito entregados a una célula en un solo complejo de transfección y se discute con más detalle en la discusión. Un ejemplo de ADN de relleno utilizado en el laboratorio de Weiss es un plásmido que contiene una secuencia terminadora, pero no promotor, secuencia codificante, etc. Las células con diferentes proporciones de componentes del circuito se pueden comparar para encontrar proporciones óptimas para la función del circuito génico. Esto a su vez produce predicciones útiles para elegir promotores y otros elementos del circuito para lograr niveles óptimos de expresión génica cuando se combinan componentes del circuito en un solo vector para la integración genética (por ejemplo, un lentivirus, transposón o plataforma de aterrizaje). Por lo tanto, en lugar de elegir relaciones entre los componentes del circuito basadas en la intuición o mediante un proceso de prueba y error que consume mucho tiempo, la politransfección evalúa una amplia gama de estequiometrías entre partes genéticas en una reacción de un solo bote.
En nuestro laboratorio, la politransfección ha permitido la optimización de muchos circuitos genéticos, incluidos clasificadores celulares, controladores de retroalimentación y feedforward, y motivos biestables. Este método simple pero poderoso acelera significativamente los ciclos de diseño para circuitos genéticos complejos en células de mamíferos. Desde entonces, la politransfección se ha utilizado para caracterizar varios circuitos genéticos para revelar sus funciones multidimensionales de transferencia de entrada-salida a alta resolución 10, optimizar una topología de circuito alternativo para la clasificación del estado celular11 y acelerar varios proyectos publicados 12,13 y en curso.
Aquí describimos y describimos el flujo de trabajo para usar la politransfección para optimizar rápidamente un circuito genético (Figura 2). El protocolo muestra cómo generar datos de politransfección de alta calidad y evitar varios errores comunes en el protocolo de politransfección y el análisis de datos (Figura 3). Luego demuestra cómo usar la politransfección para caracterizar componentes de circuitos simples y, en el proceso, comparar los resultados de la politransfección con la cotransfección (Figura 4). Finalmente, los resultados de la politransfección muestran una optimización del circuito clasificador de cáncer (Figura 5).

<table><tbody><tr><td>Tubos cónicos Corning Falcon de 15 ml</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de 24 pocillos</td><td>Cualquier empresa de elección</td><td></td> <td>(no pirógeno, estéril, RNasa, DNasa, ADN y libre de pirógenos)</td></tr><tr><td>Albbúmina sérica bovina</td><td>Centrífuga NEB</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Cualquier empresa de elección</td><td></td><td>Capaz de exponer tubos Falcon de 15 ml a 300 rcf</td></tr><tr><td>Countess 3 Contador de células automatizado</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMQAX2000</td><td></td></tr><tr><td>Countess Portaobjetos de cámara de recuento de células</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Cytoflow</td><td>Paquete</td><td></td> de software no comercial <td>https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/#&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>VWR</td><td>10-013-CV</td><td>Utilice el medio correcto para su tipo de célula</td></tr><tr><td>EDTA&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>03690-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Células HEK</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td>Utilice el tipo de célula correspondiente para sus experimentos. Las células HEK tienden a transfectar de manera muy eficiente.</td></tr><tr><td>Celdas HeLa</td><td>ATCC</td><td>CRL-12401</td><td>Utilice el tipo de célula correspondiente para sus experimentos.</td></tr><tr><td>Lipofectamina 3000 y potenciador P3000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3000001</td><td>Utilice el reactivo correcto para su tipo de célula; reactivo de transfección y potenciador</td></tr><tr><td>LSRFortessa citómetro de flujo</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solución de aminoácidos no esenciales</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga, 1,5 mL</td><td>Cualquier empresa de su elección</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985070</td><td>medio sérico reducido</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Rainbow Perlas de calibración</td><td>Spherotech</td><td>URCP-100-2H</td><td></td></tr><tr><td>Azida sódica</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>VWR</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr></tbody></table>

desarrollo rápido de circuitos de identificación del estado celular con politransfección

Rapid Development of Cell State Identification Circuits with Poly-Transfection

Los circuitos genéticos de mamíferos han demostrado el potencial para detectar y tratar una amplia gama de estados de enfermedad, pero la optimización de los niveles de los componentes del circuito sigue siendo un desafío y requiere mucha mano de obra. Para acelerar este proceso, nuestro laboratorio desarrolló la politransfección, una extensión de alto rendimiento de la transfección tradicional de mamíferos. En la politransfección, cada célula de la población transfectada esencialmente realiza un experimento diferente, probando el comportamiento del circuito en diferentes números de copias de ADN y permitiendo a los usuarios analizar un gran número de estequiometrías en una reacción de un solo recipiente. Hasta ahora, se han demostrado politransfecciones que optimizan las proporciones de circuitos de tres componentes en un solo pocillo de células; En principio, el mismo método se puede utilizar para el desarrollo de circuitos aún más grandes. Los resultados de la politransfección se pueden aplicar fácilmente para encontrar proporciones óptimas de ADN a cotransfecto para circuitos transitorios o para elegir niveles de expresión para componentes de circuitos para la generación de líneas celulares estables.
Aquí, demostramos el uso de la politransfección para optimizar un circuito de tres componentes. El protocolo comienza con los principios de diseño experimental y explica cómo la politransfección se basa en los métodos tradicionales de cotransfección. A continuación, se lleva a cabo la politransfección de células y seguida de citometría de flujo unos días después. Finalmente, los datos se analizan examinando cortes de los datos de citometría de flujo de una sola célula que corresponden a subconjuntos de células con ciertas proporciones de componentes. En el laboratorio, la politransfección se ha utilizado para optimizar clasificadores celulares, controladores de retroalimentación y feedforward, motivos biestables y muchos más. Este método simple pero poderoso acelera los ciclos de diseño para circuitos genéticos complejos en células de mamíferos.

En la Figura 1, comparamos la co-transfección con la poli-transfección. En una co-transfección, todos los plásmidos se entregan en la misma mezcla de transfección, lo que resulta en una alta correlación entre la cantidad de cada plásmido que recibe cualquier célula individual (Figura 1A). Si bien el número total de plásmidos entregados a cada célula varía significativamente, la fluorescencia de las dos proteínas reporteras en las células individuales en toda la ...

Los circuitos genéticos complejos requieren mucho tiempo para diseñar, probar y optimizar. Para facilitar este proceso, las células de mamíferos se transfectan de una manera que permite la prueba de múltiples estequiometrías de los componentes del circuito en un solo pozo. Este protocolo describe los pasos para la planificación experimental, la transfección y el análisis de datos.

Desarrollo rápido de circuitos de identificación del estado celular con politransfección

Mammalian genetic circuits have demonstrated the potential to sense and treat a wide range of disease states, but optimization of the levels of circuit ...

Nuestro protocolo hace que sea más fácil y rápido entender las relaciones entre las partes biológicas. Podemos probar el comportamiento de muchas combinaciones métricas de proporción de partes en un solo pozo. Esta técnica permite a los investigadores caracterizar las complejas relaciones entre los componentes del circuito de manera más exhaustiva con una mayor eficiencia experimental que los enfoques convencionales.Este método es aplicable para la biología sintética y para cualquier pregunta biológica, sondeando cambios de comportamiento en una célula en respuesta a diferentes niveles de genes transfectados donde la salida se puede medir a través de citometría de flujo. Comience a preparar tubos para cada agregado de ADN reservando tubos de microcentrífuga de 1.5 mililitros etiquetados como sin control de color, control mKO2, control TagBFP, control verde neón, control de todo color, mezcla de politransfección uno y mezcla de politransfección dos. Agregue 36 microlitros de medio sérico reducido al control sin color, control mKO2, control TagBFP, control verde neón y todos los tubos de control de color, luego agregue 18 microlitros de medio sérico reducido a cada mezcla de politransfección uno y mezcla de politransfección dos tubos.A continuación, agregue 600 nanogramos de plásmido de relleno al tubo de control sin color, 300 nanogramos de mKO2 y 300 nanogramos de plásmido de relleno al tubo de control de color mKO2 y agregue 300 nanogramos de TagBFP y 300 nanogramos de plásmido de relleno al tubo de control de color TagBFP. Al tubo de control de color verde neón, agregue 300 nanogramos de verde neón constitutivo y 300 nanogramos de plásmido de relleno, luego agregue 100 nanogramos de cada mKO2, TagBFP, verde neón constitutivo y 300 nanogramos de plásmido de relleno al tubo de control de todo color. A la mezcla de poli-transfección un tubo, agregue 150 nanogramos de mKO2, 75 nanogramos de plásmido verde neón reportero y 75 nanogramos de plásmido de relleno.A la mezcla de poli-transfección de dos tubos, agregue 150 nanogramos de TagBFP, 75 nanogramos de plásmido L7Ae y 75 nanogramos de plásmido de relleno. Una vez hecho esto, cree la mezcla maestra de transfección en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros combinando 216 microlitros de medio sérico reducido con 9,48 microlitros de reactivo de transfección. Mezclar bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo antes de reservar.Agregue 1.58 microlitros de reactivo potenciador sin control de color, control de color único y todos los tubos de control de color y agregue 79 microlitros de reactivo potenciador a cada tubo de mezcla de politransfección. Mezclar cada tubo individualmente pipeteando vigorosamente. Agregue 37.58 microlitros de mezcla maestra de transfección a los tubos sin control de color, control de color único y todos los tubos de control de color y mezcle pipeteando vigorosamente.A continuación, agregue 18.79 microlitros de mezcla maestra de transfección a cada tubo de mezcla de politransfección y mezcle bien cada tubo con un pipeteo vigoroso. Dispense las mezclas de transfección en los pocillos pipeteando 65.97 microlitros de cada mezcla de transfección para los controles sin color, de un solo color y de todo el color en los pocillos correspondientes, luego transfiera 32.98 microlitros de la mezcla de politransfección uno al pozo de politransfección y distribuya los complejos de manera efectiva girando la placa rápida pero suavemente en un apretado, Calcule el patrón a lo largo de una superficie plana, luego pipete 32.98 microlitros de la poli-transfección mezcle dos en el mismo pocillo de poli-transfección y gire la placa de la misma manera. Incubar las células durante dos días.Realice citometría de flujo para leer la fluorescencia de los marcadores de transfección y el reportero de salida para cada célula. Una co-transfección bien realizada, distinta de la poli-transfección que se muestra en el video, muestra una estrecha correlación entre TagBFP y EYFP, expresando plásmidos que fueron co-entregados. En contraste, una co-transfección mal realizada muestra una correlación pobre entre los dos plásmidos.La politransfección bien realizada mostró una buena cobertura del espacio bidimensional y una buena compensación de cualquier sangrado espectral entre las proteínas fluorescentes. Los datos de politransfección con un bajo número de células vivas fueron difíciles de subdividir en suficientes contenedores con un número suficiente de células en cada contenedor para el análisis. Una politransfección con poca eficiencia de transfección dio como resultado una cobertura dispersa del espacio bidimensional para el análisis.La relación efectiva de ADN en la expresión de salida se probó colocando una proteína represora, L7Ae con mKO2, y una proteína de salida, verde neón con TagBFP, en mezclas de transfección separadas. La expresión verde neón fue monitoreada en diferentes niveles de mKO2 y TagBFP. Los resultados de co-transfección y poli-transfección se compararon para este circuito.Los resultados de 11 cotransfecciones individuales que combinaron las partes de ADN mostradas anteriormente se recopilaron en un solo conjunto de datos y se compararon con los datos de politransfección. La comparación de las curvas de dosis-respuesta de L7Ae que reprimían el reportero de salida mostró que el nivel medio de salida por contenedor era muy similar entre los datos de co-transfección y poli-transfección. Se demostró una aplicación exitosa de politransfección para optimizar un clasificador de tipo celular.El micro ARN-21 presente en las células HeLa y las células no-HEK actúa para derribar la expresión de BM3R1 porque BM3R1 reprime la producción de la salida del circuito mKO2. Cuando el micro ARN 21 está presente en una célula, se activará la expresión de mKO2. La cantidad de Gal4-VP16 sintoniza la expresión de mKO2 a niveles bajos de BM3R1.Cada componente del circuito fue entregado conjuntamente con un marcador fluorescente diferente. Esta politransfección cuantifica la cantidad de cada componente del circuito que recibió cada célula. mKO2 se produce en MIR21, produciendo células HeLa pero no en células HEK.La salida de mKO2 se analizó después de entregar estos componentes del circuito en mezclas de transfección separadas con distintos reporteros fluorescentes para indicar la cantidad de cada componente del circuito recibido por una celda en particular. Este submuestreo predijo que en esta relación, el circuito cotransfectado tenía una especificidad del 91%, una sensibilidad del 62% y una precisión del 77%, al clasificar HEK293 versus células HeLa. El punto de dolor más común en este protocolo es la falta de una correlación estrecha dentro de cada mezcla de transfección.Así que recuerde mezclar vigorosamente los tubos de transfección justo después de agregar el reactivo potenciador y luego sea suave con la mezcla y pipeteo de los tubos de transfección después de agregar la mezcla de transfección que contiene lípidos Los componentes genéticos en este procedimiento podrían reemplazarse con cualquier otro componente genético para responder preguntas sobre su rendimiento funcional en diversos entornos. Este método ha desarrollado rápidamente circuitos genéticos, como clasificadores celulares, controladores de retroalimentación y feedforward, motivos biestables y muchos más.

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Investigación

JoVE Journal

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Bioingeniería

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Una plataforma automatizada de alto rendimiento para el desarrollo de líneas celulares de fabricación de proteínas terapéuticas

Se describe un método de imágenes de células vivas que da una idea de la dinámica de proteínas durante el proceso de activación de células T. Se demuestra el uso combinado de la T-célula ensayo de difusión, microscopía confocal y análisis de imágenes para producir resultados cuantitativos para seguir la formación de complejos de señalización a través de la activación de células T.

En tiempo real de imágenes en vivo de las células T de señalización Formación de complejos

A continuación, presentamos nuestro método establecido para reprogramar las células somáticas humanas en transgenes libre iPSCs humanas con virus Sendai, que muestra resultados consistentes y una mayor eficiencia.

Eficiente generación, por actividad humana células madre pluripotentes de células somáticas humanas con virus Sendai-

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Modulación reversible mediada por luz de la vía de la proteína quinasa activada por mitógeno durante la diferenciación celular y<em&gt; Xenopus</em&gt; Desarrollo embrionario

Describimos la ingeniería de una nueva ARN polimerasa T7 atada al ADN para regular las reacciones de transcripción in vitro. Discutimos los pasos para la síntesis y caracterización de proteínas, validamos la regulación transcripcional de prueba de concepto y discutimos sus aplicaciones en computación molecular, diagnóstico y procesamiento de información molecular.

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