Registro de corriente de potasio dependiente del voltaje en cardiomiocitos H9c2 mediante la técnica de pinza de parche de células enteras

Este protocolo registra con éxito los efectos de la aconitina en el IKv de las células H9C2. Promover nuevas fases para investigar el mecanismo de cardiotoxicidad de los fármacos desde la perspectiva de los canales iónicos. La técnica de pinza de parche de células enteras es el estándar de oro de la investigación del canal iónico con alta sensibilidad, alta precisión y alta especificidad.

La técnica de patch-clamp de células enteras se puede emplear para explorar los mecanismos farmacológicos o tóxicos de la yuxta-gating de canales iónicos específicos para enfermedades multisistémicas, como el sistema cardiovascular y el sistema nervioso. Para comenzar, digiera las células con 0,25% de tripsina durante 30 segundos, una vez que la placa de cultivo de H9C2 se convierta en 80% confluente. Cultivo de 2 veces 10 a 5 células por mililitro con medio normal o medio que contiene fármaco en un plato de 35 milímetros alfombrado con placas de vidrio durante 24 horas a 37 grados centígrados, con una atmósfera de 5% de dióxido de carbono y 70 a 80% de humedad relativa.

Encienda el extractor de micropipetas y precaliente durante 30 minutos. Luego coloque un capilar de vidrio de borosilicato con un filamento en el extractor de micropipetas. Seleccione el programa y haga clic en enter en el panel de control.

Haga clic en el programa de rampa en la esquina superior derecha para determinar el valor de calor del capilar de vidrio. Escriba el programa para tirar del electrodo de acuerdo con el valor determinado por la prueba de rampa y haga clic en tirar para comenzar a fabricar las pipetas. Encienda el convertidor analógico digital, el amplificador de señal, el micromanipulador, el microscopio y la cámara.

Abra la aplicación de imágenes, el software del amplificador de señal y el software de adquisición de datos en secuencia. Haga clic en adquirir y seleccione editar protocolo en el software de adquisición de datos. Edite el programa en la interfaz de forma de onda.

Introduzca los valores para el primer nivel, el nivel delta, la primera duración y la duración delta para la época A, la época B y la época C.A continuación, haga clic en la interfaz de velocidad de modo y establezca los datos de la jerarquía de prueba. A continuación, haga clic en editar protocolo para seleccionar el botón de estímulo y establecer el programa de sustracción de fugas en el cuadro de diálogo de sustracción de fugas de PM. Para establecer la ruta de almacenamiento de datos, haga clic en archivo y seleccione establecer nombres de archivos de datos en el software de adquisición de datos.

Luego abra el protocolo lKv establecido seleccionando adquirir y haciendo clic en abrir protocolo en el software de adquisición de datos. Finalmente, haga clic en la opción herramientas y seleccione prueba de membrana para comenzar a ejecutar el protocolo. Agregue la solución extracelular al baño celular en el aparato de abrazadera de parche de células enteras y coloque el deslizamiento de la cubierta hacia arriba con las células H9C2 en el baño.

Llene el 30% de la pipeta con la solución extracelular e instálela en el soporte del electrodo de registro integrado en el aparato de sujeción de parche. Apriete la pipeta con el soporte del electrodo de grabación. A continuación, deje caer la pipeta en el baño con el micromanipulador.

Haga clic en la interfaz de desplazamiento de pipeta del software del amplificador de señal para mantener la línea de base de corriente lKv en cero picoamperios. Administre manualmente una presión positiva adecuada con una jeringa de 1,0 mililitros, conectada al soporte del electrodo de grabación, a través de un tubo de plástico. Mueva ligeramente la pipeta manipulando el micromanipulador en tres dimensiones para entrar en contacto con la célula.

Una vez que la membrana prueba las caídas de onda cuadrada de un tercio a la mitad después de que la pipeta toque la membrana celular, elimine la presión positiva y administre manualmente una presión negativa adecuada. Luego haga clic en la interfaz de parche del software de adquisición de datos para formar el gigaseal. Utilice el software amplificador de señal lenta de compensación de capacitancia rápida y compensación de capacitancia lenta durante el techo de la celda para compensar la capacitancia rápida y lenta.

Aplique pulsos breves de presión negativa para romper un parche de la membrana celular. Ejecute la compensación de capacitancia de membrana de toda la célula haciendo clic en el botón de celda completa del software del amplificador de señal. Finalmente, guarde y grabe los datos, haciendo clic en el botón de grabación de datos.

Abra los datos lKv guardados con el software de análisis de datos. Guarde las relaciones de voltaje de corriente. Haga clic en analizar para seleccionar estadísticas.

Seleccione el rango como Cursores 1 2 para el análisis de datos, haga clic en los botones amplitud máxima y media y, a continuación, haga clic en aceptar para ver los datos en la página de resultados. Finalmente, copie la columna de datos medios de lKv en el software de dibujo de funciones para su posterior análisis. Guarde las trazas de corriente representativas de lKv.

Haga clic en editar para seleccionar los rastros de transferencia, luego seleccione el rastreo completo en la región para transferir. A continuación, haga clic en seleccionar en la selección de traza y seleccione IN 0 en las señales. Finalmente, haga clic en aceptar para ver los datos en la página de resultados y copie los datos totales en el software de dibujo de funciones para dibujar los trazos actuales.

Guarde el protocolo lKv. Haga clic en editar para seleccionar crear señal de forma de onda de estímulo y seleccione OK. A continuación, repita el paso para dibujar trazas de corriente sin seleccionar la señal.

El lKv fue activado por 150 milisegundos de estímulo de pulso despolarizante de menos 40 a más 60 milivoltios a un potencial de retención de menos 60 milivoltios. El lKv de los cardiomiocitos de rata H9C2, apareció por primera vez alrededor de menos 20 milivoltios, y luego la amplitud aumentó con una mayor despolarización. En comparación con el grupo control, la amplitud del lKv se redujo notablemente después de los cinco minutos de tratamiento con 1,5 milimolar 4-AP.

Además, el lKv disminuyó significativamente a potenciales de membrana de 10 a 60 milivoltios de una manera dependiente de la dosis, después del tratamiento de CA de 24 horas. La célula individual después de registrar el canal iónico, se puede utilizar para evaluar otras ómicas unicelulares, como la genómica de una sola célula, la transcriptómica, la proteómica y la metabolómica.