Generación de organoides hepáticos endodérmicos funcionales

Nuestra investigación tiene como objetivo desarrollar modelos hepáticos in vitro relevantes para humanos para pruebas de eficacia y seguridad de fármacos, imitando de cerca los tejidos hepáticos sanos y enfermos en estudios preclínicos. Reproducir la complejidad hepática completa, lograr una funcionalidad a largo plazo, estandarizar protocolos y escalar la producción de organoides para aplicaciones de alto rendimiento siguen siendo un desafío experimental importante en la investigación de organoides. Recientemente modelamos la fibrosis hepática a partir de organoides hepáticos sanos y establecimos modelos de enfermedades raras hepáticas, incluida la citrulinemia y la deficiencia de piruvato carboxilasa, a partir de células derivadas de pacientes. A diferencia de otros métodos, nuestro protocolo eHEPO proporciona organoides hepáticos funcionales de forma rápida y a escala, lo que respalda la funcionalidad a largo plazo y múltiples ensayos de una población inicial consistente.

[Narrador] Para comenzar, agregue 6 mililitros de DMEM / F-12 frío en un tubo cónico de 15 mililitros. Agregue inmediatamente 80 microlitros de matriz de membrana basal FOD o BMM al tubo y mezcle bien. Cubra una placa de pocillos tratada con cultivo de tejidos con la solución BMM y dispense la solución para cubrir la superficie de la placa de pocillos. Incube la placa en una incubadora a 37 ° Celsius durante al menos una hora. Tome una placa de células madre pluripotentes inducibles o IPSC y aspire el medio específico de IPSC. Enjuague la placa con DMEM / F-12 o DPBS y agregue 1 mililitro de la enzima específica a un pocillo de una placa de 6 pocillos. Después de incubar durante un minuto, aspire la enzima e incube la placa a 37 ° Celsius durante cinco a siete minutos. A continuación, agregue 1 mililitro de medio IPSC precalentado a la placa y golpee suavemente el costado para separar los agregados de colonias indiferenciadas de la superficie de la placa. Mezcle suavemente la suspensión con una pipeta serológica de 5 mililitros y luego siembre la suspensión celular a la densidad deseada en el pocillo recubierto de BMM. Incubar las células a 37° Celsius durante tres a cinco días para alcanzar una confluencia del 70%. Reemplace el medio IPSC con el medio endoderm antes de comenzar la diferenciación. Las células adquieren una forma puntiaguda después de la diferenciación, lo que indica la interacción célula-célula. Enjuague las células del endodermo con PBS. Agrega 300 microlitros de tripsina. E incube las células durante cinco minutos en la incubadora. Agregue 3 mililitros de DMEM / F-12 frío a las celdas y pipetee con puntas de filtro de 1,000 microlitros para generar celdas individuales. Recoger la suspensión celular en un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugar las células a 300 x g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de desechar el sobrenadante, lave el gránulo con 10 mililitros de tampón FACS. Para hacer una suspensión de una sola célula, filtre las células con un colador de malla de 100 micrómetros y luego con un colador de malla de 40 micrómetros antes de centrifugar la suspensión celular durante cinco minutos. Vuelva a suspender 15 millones de celdas con 105 microlitros de tampón FACS y agregue 45 microlitros de FcR y 15 microlitros de EpCAM a la suspensión. Incube las células durante 10 minutos a 4° Celsius, protegiendo el tubo de la luz. Luego agregue 500 microlitros de tampón FACS para lavar la suspensión celular. Después de centrifugar las células, vuelva a suspender el sedimento en 500 microlitros de tampón FACS y agregue 0,5 micromolares por mililitro de DAPI a la suspensión celular para cuantificar las células muertas. Después de la clasificación de las células, centrifugar las células a 300 x g durante cinco minutos. Retire el sobrenadante. Y resuspender de 3,000 a 5,000 células en 20 microlitros de BMM. Siembre las células agregando una gota de BMM al centro de cada placa de 48 pocillos e incube las células durante dos minutos a 37 ° Celsius hasta que el BMM se solidifique. Superponga la gota con el medio de expansión. Para dividir la gota de organoide, deseche el medio organoide y agregue 500 microlitros de Ad-DMEM / F-12 frío al pozo. Utilice puntas de filtro de 1.000 microlitros para pipetear vigorosamente las gotas de BMM. Recoja un máximo de 10 gotas de BMM en tubos cónicos de 15 mililitros y agregue 5 mililitros de Ad-DMEM / F-12 frío. Coloque el tubo en hielo durante tres a cinco minutos. Centrifugar las células a 200 x g durante cinco minutos a 4° Celsius y desechar el sobrenadante hasta que quede 1 mililitro del sobrenadante. Pipetee vigorosamente el sedimento celular de 30 a 40 veces con puntas de filtro de 200 microlitros. Después de la disociación mecánica, agregue 5 mililitros de Ad-DMEM / F-12 frío antes de centrifugar las células durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante. Y coloque la suspensión en hielo. Siembre una gota de BMM de 50 microlitros. Y agregue 25 nanogramos por mililitro de BMP7 al medio de expansión. Después de cultivar durante tres días, reemplace el medio con el medio de diferenciación y cultive las células durante al menos 14 días. Se realizó un análisis de inmunotinción para validar si los organoides que se originan en las células EpCAM+ están comprometidos con el linaje hepático. La presencia de células CK19+ y HNF4ɑ+ indica que las células progenitoras de hepatoblastos y vías biliares están presentes en los organoides. Además, los organoides que expresan marcadores de tejido epitelial, como las células E-CAD+ y las células epiteliales cúbicas o poliédricas que expresan ZO-1, indican la presencia de uniones estrechas entre las células. La inmunohistoquímica reveló que las células E-CAD+ mostraban una estructura epiteloide poligonal, lo que refleja un fenotipo similar a un hepatocitos. Aquí se muestran las imágenes de microscopía electrónica de transmisión de eHEPO. Los círculos blancos indican los complejos de unión intercelular. Las flechas negras muestran diferenciación de la superficie apical. Y la flecha roja muestra una sección transversal de microvellosidades. El análisis de qPCR mostró que los organoides obtuvieron marcadores de hepatocitos maduros como ALB, A1AT, CYP3A4 y CYP3A7. El área teñida de rosa en la tinción de PAS indica la capacidad de almacenamiento de glucógeno de los organoides. Además, nuestro análisis mostró la capacidad de los organoides para secretar ALB en los medios de cultivo, eliminar el amoníaco de los medios de cultivo, la actividad de la enzima CYP3A4 y la capacidad de transporte de ácidos biliares.