Name: Generación de organoides hepáticos endodérmicos funcionales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Aprende a generar organoides hepáticos endodérmicos funcionales en solo dos semanas con este protocolo reproducible. Estos modelos tridimensionales permiten cultivos de largo plazo para investigar enfermedades hepáticas y medicina regenerativa.

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<ol><li>Huch, M., Koo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+mouse+and+human+development+using+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Modeling mouse and human development using organoid cultures.</a> Development. 142 (18), 3113-3125 (2015).</li>
<li>Marsee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+consensus+on+definition+and+nomenclature+of+hepatic%2C+pancreatic%2C+and+biliary+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Building consensus on definition and nomenclature of hepatic, pancreatic, and biliary organoids.</a> Cell Stem Cell. 28 (5), 816-832 (2021).</li>
<li>Takebe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+and+functional+human+liver+from+an+iPSC-derived+organ+bud+transplant%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant.</a> Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).</li>
<li>Takebe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massive+and+reproducible+production+of+liver+buds+entirely+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Massive and reproducible production of liver buds entirely from human pluripotent stem cells.</a> Cell Reports. 21 (10), 2661-2670 (2017).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li>
<li>Guan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatic+organoids+for+the+analysis+of+human+genetic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Human hepatic organoids for the analysis of human genetic diseases.</a> JCI Insight. 2 (17), e94954(2017).</li>
<li>Ramli, M. N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cell-derived+organoids+as+models+of+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cell-derived organoids as models of liver disease.</a> Gastroenterology. 159 (4), 1471-1486 (2020).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. 21 (1), 3(1997).</li>
<li>Feldman, A. T., Wolfe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+processing+and+hematoxylin+and+eosin+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Tissue processing and hematoxylin and eosin staining.</a> Histopathology: Methods and Protocols. 1180, 31-43 (2014).</li>
<li>Akbari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((long-term+culture+of+endoderm-derived+hepatic+organoids+for+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">long-term culture of endoderm-derived hepatic organoids for disease modeling.</a> Stem Cell Reports. 13 (4), 627-641 (2019).</li>
<li>Meisenheimer, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proluciferin+acetals+as+bioluminogenic+substrates+for+cytochrome+P450+activity+and+probes+for+CYP3A+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metabolism+and+Disposition%22%5BJournal%5D)">Proluciferin acetals as bioluminogenic substrates for cytochrome P450 activity and probes for CYP3A inhibition.</a> Drug Metabolism and Disposition. 39 (12), 2403-2410 (2011).</li>
<li>Cali, J. J., Ma, D., Wood, M. G., Meisenheimer, P. L., Klaubert, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+assays+for+ADME+evaluation%3A+dialing+in+CYP+selectivity+with+luminogenic+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Metabolism+%26+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent assays for ADME evaluation: dialing in CYP selectivity with luminogenic substrates.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (9), 1115-1130 (2012).</li>
<li>Cali, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminogenic+cytochrome+P450+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Metabolism+%26+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Luminogenic cytochrome P450 assays.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 2 (4), 629-645 (2006).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%E2%88%92%CE%94%CE%94CT+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+physiological+events+in+2D+vs.+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture.</a> Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).</li>
<li>Rowe, R. G., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Genetics. 20 (7), 377-388 (2019).</li>
<li>Akbari, S., Arslan, N., Senturk, S., Erdal, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+liver+medicine+using+organoid+models%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+Development+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Next-generation liver medicine using organoid models.</a> Frontiers in Cell Development and Biology. 7, 345(2019).</li>
<li>Michalopoulos, G. K., Bowen, W. C., Mule, K., Stolz, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+organization+in+hepatocyte+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Histological organization in hepatocyte organoid cultures.</a> American Journal of Pathology. 159 (5), 1877-1887 (2001).</li>
<li>Shinozawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fidelity+drug-induced+liver+injury+screen+using+human+pluripotent+stem+cell-derived+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">High-fidelity drug-induced liver injury screen using human pluripotent stem cell-derived organoids.</a> Gastroenterology. 160 (3), 831-846 (2021).</li>
<li>Wu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+hepatobiliary+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Generation of hepatobiliary organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Hepatology. 70 (6), 1145-1158 (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Tubos de centrífuga cónicos de 15 ml</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>37 &grados; C baño de agua</td><td>N&uuml; ve</td><td>210.NB9</td><td></td></tr><tr><td>37 &grados; C, 5 % CO2 incubadora</td><td>Memmert</td><td>INCO 153</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga cónicos de 50 ml</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m y 40 &micro; m Filtro de células</td><td>Halcón</td><td>352350/ 352340</td><td></td></tr><tr><td>70% Etanol</td><td>Sigma</td><td>1009832511</td><td></td></tr><tr><td>A1AT</td><td>Abcam</td><td>AB166610</td><td>Dilución: 1/500 (IF), 1/50 (IHC)</td></tr><tr><td>A-83.01 (inhibidor de TGF-&beta;)</td><td>Tocris Biosciene</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Isolab</td><td>9,01,026</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos adhesivos para microscopio</td><td>Histobond</td><td>C981040</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12 avanzado</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>AFP</td><td>Abcam</td><td>AB3980</td><td>Dilución: 1/25 (IHC)</td></tr><tr><td>Agar-agar</td><td>EMS</td><td>10200</td><td></td></tr><tr><td>ALBA</td><td>Abcam</td><td>AB10241</td><td>Dilución: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)</td></tr><tr><td>Alexa Flour 488 (Ratón)</td><td>Invitrogen</td><td>Referencia A11001</td><td>Dilución: 1/1000 (IF)</td></tr><tr><td>Alexa Flour 488 (Conejo)</td><td>Invitrogen</td><td>A110034</td><td>Dilución: 1/1000 (IF)</td></tr><tr><td>Alexa Flour 594 (Ratón)</td><td>Invitrogen</td><td>Referencia A11005</td><td>Dilución: 1/1000 (IF)</td></tr><tr><td>Alexa harina 594 (Conejo)&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Referencia A11037</td><td>Dilución: 1/1000 (IF)</td></tr><tr><td>Kit de ensayo de amoníaco</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAK-310</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de amonio</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-202936</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento B27 50x</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Molde base</td><td>Sakura</td><td>4216</td><td></td></tr><tr><td>b-FGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Bioseguridad, CLASE II, CABINA DE SEGURIDAD</td><td>Termo</td><td>SEGURO 2020</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas calibradas</td><td>Gilson</td><td>F167380</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>Colilglicilamido-fluoresceína</td><td>Corning</td><td>451041</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de citrato pH 6.0</td><td>Bioóptica</td><td>15-M103</td><td></td></tr><tr><td>CK-18</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-51582</td><td>Dilución: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)</td></tr><tr><td>CK-19</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-6278</td><td>Dilución: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)</td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Zeiss</td><td>LSM880</td><td></td></tr><tr><td>Guantes de manipulación criogénica y protección ocular</td><td>Cryokit</td><td>5274</td><td></td></tr><tr><td>Criostato</td><td>Leica</td><td>CM 1950</td><td></td></tr><tr><td>Tubos crioviales</td><td>Corning</td><td>430659</td><td></td></tr><tr><td>LIMANDA</td><td>Roche</td><td>11718096001</td><td></td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5942</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Dispase&nbsp;</td><td>Tecnologías de células madre</td><td>7923</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F12</td><td>Gibco</td><td>31330038</td><td></td></tr><tr><td>E-CAD</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-8426</td><td>Dilución: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio electrónico</td><td>Zeiss</td><td>Sigma500</td><td></td></tr><tr><td>Kit ELISA</td><td>Fortis ciencias de la vida bethyl</td><td>E88-129</td><td></td></tr><tr><td>Kit de incrustación Embed 812</td><td>EMS</td><td>14121</td><td></td></tr><tr><td>Entellan</td><td>Merck</td><td>107961</td><td></td></tr><tr><td>Eosina Y %1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT110332</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td><td>Dilución: 1/11 (FACS)</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>1,00,98,32,511</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26010066</td><td></td></tr><tr><td>Forskolina (FSK)</td><td>Tocris Biosciene</td><td>1099</td><td></td></tr><tr><td>Contenedor de congelación (Sr. Frosty)</td><td>Termo</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Medio de congelación</td><td>Gibco</td><td>12648010</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur de vidrio</td><td>Isolab</td><td>084.01.001</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax 100x</td><td>Gibco</td><td>35050-068</td><td></td></tr><tr><td>Gluteraldehído %25, grado EM</td><td>EMS</td><td>16210-1L</td><td></td></tr><tr><td>Cabra Anti-Ratón HRP</td><td>Termo Fisher</td><td>62-6520</td><td>Dilución: 1/1000 (IHC)</td></tr><tr><td>Cabra Anti-Conejo HRP</td><td>Termo Fisher</td><td>31460</td><td>Dilución: 1/1000 (IHC)</td></tr><tr><td>Suero de cabra</td><td>Gibco</td><td>162-10-072</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Merck</td><td>107209</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxilina</td><td>Millipore</td><td>HX86017674</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, 1 M</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>HNF-4&alfa;</td><td>Abcam</td><td>AB55223</td><td>Dilución: 1/50 (IHC)</td></tr><tr><td>Hielo y hielo seco</td><td>casero</td><td>casero</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora (65 &deg; C)</td><td>N&uuml; ve</td><td>EN 400</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>24137</td><td></td></tr><tr><td>Leu15 Gastrin I humano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9145</td><td></td></tr><tr><td>Luminómetro</td><td>Tecnología Berthold</td><td>LB 960</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla maestra&nbsp;</td><td>Biosistemas aplicados</td><td>43676659</td><td></td></tr><tr><td>Matriz Matrigel, calificada por hESC</td><td>Corning</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Matriz de Matrigel, sin rojo de fenol</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Merck</td><td>179337</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga</td><td>Axygen</td><td>321-02-501</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Zeiss</td><td>AXIO VERT A1</td><td></td></tr><tr><td>Hoja de micrótomo</td><td>Pluma</td><td>S35, C35</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Tecnologías de células madre</td><td>SC-05850</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo en suspensión de múltiples pocillos</td><td>Sarstedt</td><td>83,39,21,500</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento de N2 100x</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-acetilcisteína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Referencia A9165</td><td></td></tr><tr><td>Formalina tamponada neutra %10</td><td>Tekkim</td><td>TK.60161.05001</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácido no esencial (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>Tejido-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Tetróxido de osmio</td><td>EMS</td><td>19110</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensayos P450-Glo</td><td>Promega</td><td>V9001</td><td></td></tr><tr><td>Pluma de Papanicolaou</td><td>Sigma</td><td>Z377821-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Parafina</td><td>Tekkim</td><td>TK.200661.01002</td><td></td></tr><tr><td>Kit de tinción PAS</td><td>Abcam</td><td>AB150680</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>BE17-516</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fosfotungústico</td><td>Ted Pella</td><td>19402</td><td></td></tr><tr><td>Ayuda de pipeta</td><td>Axygen</td><td>Motopet-1</td><td></td></tr><tr><td>Lector de placas varioskan flash&nbsp;</td><td>Termo</td><td>5250040</td><td></td></tr><tr><td>Montaje Prolong Antifade</td><td>Invitrogen</td><td>P36980</td><td></td></tr><tr><td>Óxido de propileno, grado EM</td><td>EMS</td><td>20401</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de PCR en tiempo real</td><td>Biosistemas aplicados</td><td>7500 Rápido&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Activina A humana recombinante</td><td>R& D</td><td>338-AC-050</td><td></td></tr><tr><td>BMP7 humano recombinante</td><td>Peprotech</td><td>120-03</td><td></td></tr><tr><td>EGF humano recombinante</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>FGF10 humano recombinante</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>FGF19 humano recombinante</td><td>Peprotech</td><td>100-32</td><td></td></tr><tr><td>HGF humano recombinante</td><td>Peprotech</td><td>100-39</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de la Rho quinasa, diclorhidrato Y-27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de 1,5 ml sin ARNasa/ADNasa</td><td>Axygen</td><td>31108101</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de filtro sin ARNasa/ADNasa</td><td>Sarstedt</td><td>703031255</td><td></td></tr><tr><td>Micrótomo rotativo</td><td>Leica</td><td>RM 2245</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medio</td><td>Gibco</td><td>61870010</td><td></td></tr><tr><td>Medio acondicionado con rspo1</td><td>Casero</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Patrón de diapositivas</td><td>Bioóptica</td><td>15-MEQ001</td><td></td></tr><tr><td>Sorenson' s Tampón de fosfato</td><td>EMS</td><td>11600-10</td><td></td></tr><tr><td>Hilador</td><td>Termo</td><td>MI GIRO 6</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas estériles</td><td>Halcón</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>Casete de tejido</td><td>Leica</td><td>3802240</td><td></td></tr><tr><td>Cortapatillas</td><td>Leica</td><td>EM TRIM2</td><td></td></tr><tr><td>Tritón X-100</td><td>Thermo Scientific</td><td>28314</td><td></td></tr><tr><td>Enzima TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605010</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotomo</td><td>Leica</td><td>EM UC7</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de uranilo</td><td>EMS</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>Vórtice</td><td>Termo</td><td>88880018</td><td></td></tr><tr><td>Proteína de fusión Wnt Surrogate-Fc</td><td>Inmunopreciso</td><td>N001</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>16446</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1</td><td>Invitrogen</td><td>40-2200</td><td>Dilución: 1/400 (IF)</td></tr></tbody></table>

generación de organoides hepáticos endodérmicos funcionales

Generation of Functional Endodermal Hepatic Organoids

En primer lugar, se cultivaron células de fibroblastos humanos o células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y se convirtieron en iPSC mediante reprogramación episomal. El nuevo suero knockout fue esencial para obtener iPSC saludables. A continuación, las iPSC se sembraron en las placas de cultivo recubiertas de BMM con una confluencia del 50%-60%. Tener colonias de iPSC de tamaño pequeño/mediano mejoró la eficiencia de diferenciación. A continuación, las iPSCs se diferenciaron en endodermo definitivo con ...

Generación de organoides hepáticos endodérmicos funcionales

Organoid technology has allowed us to generate a variety of human organ-like mini structures, such as for the liver, brain, and intestine, in vitro. The ...

Nuestra investigación tiene como objetivo desarrollar modelos hepáticos in vitro relevantes para humanos para pruebas de eficacia y seguridad de fármacos, imitando de cerca los tejidos hepáticos sanos y enfermos en estudios preclínicos. Reproducir la complejidad hepática completa, lograr una funcionalidad a largo plazo, estandarizar protocolos y escalar la producción de organoides para aplicaciones de alto rendimiento siguen siendo un desafío experimental importante en la investigación de organoides. Recientemente modelamos la fibrosis hepática a partir de organoides hepáticos sanos y establecimos modelos de enfermedades raras hepáticas, incluida la citrulinemia y la deficiencia de piruvato carboxilasa, a partir de células derivadas de pacientes. A diferencia de otros métodos, nuestro protocolo eHEPO proporciona organoides hepáticos funcionales de forma rápida y a escala, lo que respalda la funcionalidad a largo plazo y múltiples ensayos de una población inicial consistente.[Narrador] Para comenzar, agregue 6 mililitros de DMEM / F-12 frío en un tubo cónico de 15 mililitros. Agregue inmediatamente 80 microlitros de matriz de membrana basal FOD o BMM al tubo y mezcle bien. Cubra una placa de pocillos tratada con cultivo de tejidos con la solución BMM y dispense la solución para cubrir la superficie de la placa de pocillos. Incube la placa en una incubadora a 37 ° Celsius durante al menos una hora. Tome una placa de células madre pluripotentes inducibles o IPSC y aspire el medio específico de IPSC. Enjuague la placa con DMEM / F-12 o DPBS y agregue 1 mililitro de la enzima específica a un pocillo de una placa de 6 pocillos. Después de incubar durante un minuto, aspire la enzima e incube la placa a 37 ° Celsius durante cinco a siete minutos. A continuación, agregue 1 mililitro de medio IPSC precalentado a la placa y golpee suavemente el costado para separar los agregados de colonias indiferenciadas de la superficie de la placa. Mezcle suavemente la suspensión con una pipeta serológica de 5 mililitros y luego siembre la suspensión celular a la densidad deseada en el pocillo recubierto de BMM. Incubar las células a 37° Celsius durante tres a cinco días para alcanzar una confluencia del 70%. Reemplace el medio IPSC con el medio endoderm antes de comenzar la diferenciación. Las células adquieren una forma puntiaguda después de la diferenciación, lo que indica la interacción célula-célula. Enjuague las células del endodermo con PBS. Agrega 300 microlitros de tripsina. E incube las células durante cinco minutos en la incubadora. Agregue 3 mililitros de DMEM / F-12 frío a las celdas y pipetee con puntas de filtro de 1,000 microlitros para generar celdas individuales. Recoger la suspensión celular en un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugar las células a 300 x g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de desechar el sobrenadante, lave el gránulo con 10 mililitros de tampón FACS. Para hacer una suspensión de una sola célula, filtre las células con un colador de malla de 100 micrómetros y luego con un colador de malla de 40 micrómetros antes de centrifugar la suspensión celular durante cinco minutos. Vuelva a suspender 15 millones de celdas con 105 microlitros de tampón FACS y agregue 45 microlitros de FcR y 15 microlitros de EpCAM a la suspensión. Incube las células durante 10 minutos a 4° Celsius, protegiendo el tubo de la luz. Luego agregue 500 microlitros de tampón FACS para lavar la suspensión celular. Después de centrifugar las células, vuelva a suspender el sedimento en 500 microlitros de tampón FACS y agregue 0,5 micromolares por mililitro de DAPI a la suspensión celular para cuantificar las células muertas. Después de la clasificación de las células, centrifugar las células a 300 x g durante cinco minutos. Retire el sobrenadante. Y resuspender de 3,000 a 5,000 células en 20 microlitros de BMM. Siembre las células agregando una gota de BMM al centro de cada placa de 48 pocillos e incube las células durante dos minutos a 37 ° Celsius hasta que el BMM se solidifique. Superponga la gota con el medio de expansión. Para dividir la gota de organoide, deseche el medio organoide y agregue 500 microlitros de Ad-DMEM / F-12 frío al pozo. Utilice puntas de filtro de 1.000 microlitros para pipetear vigorosamente las gotas de BMM. Recoja un máximo de 10 gotas de BMM en tubos cónicos de 15 mililitros y agregue 5 mililitros de Ad-DMEM / F-12 frío. Coloque el tubo en hielo durante tres a cinco minutos. Centrifugar las células a 200 x g durante cinco minutos a 4° Celsius y desechar el sobrenadante hasta que quede 1 mililitro del sobrenadante. Pipetee vigorosamente el sedimento celular de 30 a 40 veces con puntas de filtro de 200 microlitros. Después de la disociación mecánica, agregue 5 mililitros de Ad-DMEM / F-12 frío antes de centrifugar las células durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante. Y coloque la suspensión en hielo. Siembre una gota de BMM de 50 microlitros. Y agregue 25 nanogramos por mililitro de BMP7 al medio de expansión. Después de cultivar durante tres días, reemplace el medio con el medio de diferenciación y cultive las células durante al menos 14 días. Se realizó un análisis de inmunotinción para validar si los organoides que se originan en las células EpCAM+ están comprometidos con el linaje hepático. La presencia de células CK19+ y HNF4ɑ+ indica que las células progenitoras de hepatoblastos y vías biliares están presentes en los organoides. Además, los organoides que expresan marcadores de tejido epitelial, como las células E-CAD+ y las células epiteliales cúbicas o poliédricas que expresan ZO-1, indican la presencia de uniones estrechas entre las células. La inmunohistoquímica reveló que las células E-CAD+ mostraban una estructura epiteloide poligonal, lo que refleja un fenotipo similar a un hepatocitos. Aquí se muestran las imágenes de microscopía electrónica de transmisión de eHEPO. Los círculos blancos indican los complejos de unión intercelular. Las flechas negras muestran diferenciación de la superficie apical. Y la flecha roja muestra una sección transversal de microvellosidades. El análisis de qPCR mostró que los organoides obtuvieron marcadores de hepatocitos maduros como ALB, A1AT, CYP3A4 y CYP3A7. El área teñida de rosa en la tinción de PAS indica la capacidad de almacenamiento de glucógeno de los organoides. Además, nuestro análisis mostró la capacidad de los organoides para secretar ALB en los medios de cultivo, eliminar el amoníaco de los medios de cultivo, la actividad de la enzima CYP3A4 y la capacidad de transporte de ácidos biliares.

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Investigación

JoVE Journal

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