Generación de ratones knockout específicos de grasa marrón utilizando un sistema combinado de ARN de guía única Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 y virus adenoasociado
24 de marzo de 2023
En este protocolo, describimos los procedimientos técnicos para generar ratones knockout específicos para tejido adiposo marrón (BAT) aprovechando un sistema combinado de ARN de guía única (sgRNA) de Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 y virus adenoasociado (AAV). Los pasos descritos incluyen el diseño de los sgRNAs, la preparación de las partículas AAV-sgRNA y la microinyección de AAV en los lóbulos BAT.
Este protocolo genera ratones knockout específicos de grasa marrón utilizando un sistema de ARN de guía única Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 y virus adenoasociados. Incluye una técnica quirúrgica para administrar AAV de forma segura en la grasa marrón. La principal ventaja de esta técnica es que puede generar rápidamente knockouts específicos de tejido sin necesidad de criar ratones selectivamente.
El enfoque para hacer knockout o knockdowns específicos del tejido se puede adaptar a otros tejidos si el procedimiento quirúrgico para inyectar AAV se modifica en función del órgano diana. Para comenzar, administrar el analgésico por vía subcutánea al ratón UCP1 Cre Cas9 anestesiado para minimizar y prevenir el dolor postoperatorio y la angustia. Luego afeite el pelaje en su área interescapular con una afeitadora y esterilice el área quirúrgica con al menos tres rondas alternas de un exfoliante a base de yodo o clorhexidina, seguido de etanol al 70%.
Usando un bisturí, haga una incisión de dos centímetros en la piel por encima del tejido adiposo marrón entre las escápulas para exponer la grasa interescapular. Después de hacer una sola incisión, corte los tejidos grasos en el borde entre la región distal de los tejidos grasos y los músculos. Luego, usando las tijeras quirúrgicas en la mano dominante, retire los tejidos grasos sin rodeos y verticalmente para exponer el tejido adiposo marrón mientras pellizca los tejidos grasos, incluido el tejido adiposo marrón, con la mano no dominante.
Use la vena de Sulzer como punto de referencia para indicar la ubicación precisa del tejido adiposo marrón. A continuación, para cada ratón, inyecte 20 microlitros de virus adenoasociado o AAV lentamente en cada lóbulo de los dos tejidos adiposos marrones utilizando una aguja afilada de calibre 32 conectada a una jeringa Hamilton de 100 microlitros. Confirme que la inyección exitosa indica que no hay fugas del sitio inyectado durante la administración de AAV.
Después de asegurar la homeostasis, coloque los tejidos grasos expuestos de nuevo en su posición normal para suturar el borde de los tejidos grasos y el músculo con un hilo de monofilamento absorbible 5-0. Finalmente, suturar la piel abierta con hilos trenzados sin teñir VICRYL recubiertos 5-0. La ubicación precisa del tejido adiposo marrón no se puede identificar sin exponerlo, sin embargo, el exceso de exposición daña el tejido.
Los defectos potenciales que pueden haber llevado a inyecciones fallidas incluyeron inyectar la solución de AAV en la región incorrecta, penetración de la aguja a través del tejido y abombamiento del tejido debido a un volumen excesivo de la solución AAV. La administración precisa de ARN guía único AAV al tejido adiposo marrón fue crucial para el éxito del protocolo. La clave del éxito al exponer el tejido adiposo marrón es la técnica quirúrgica de tijera, incluida la dirección y la profundidad de las tijeras, y la ubicación de la jeringa Hamilton.
Esta técnica tiene una carga de generación de tejido específico para animales knockout para comprender los reguladores moleculares del metabolismo energético relacionado con la grasa marrón.
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Descripción general
Este protocolo describe un método para generar ratones con deleción específica en el tejido adiposo pardo (TAP) mediante una combinación de las técnicas Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 y ARN guía único de virus asociado a adenovirus (AAV). Al utilizar estos métodos, los investigadores pueden crear rápidamente deleciones específicas de tejido sin necesidad de cruces selectivos.
Componentes Clave del Estudio
Área de Investigación
- Genética
- Biología celular
- Biología molecular
Antecedentes
- El tejido adiposo marrón es crucial para el metabolismo energético.
- La creación de eliminaciones específicas de tejido ayuda a comprender los procesos biológicos.
- Este método podría adaptarse potencialmente para otros tejidos.
Métodos Utilizados
- Aplicación de enfoques Cre-LoxP y CRISPR-Cas9.
- Modelo de ratón utilizado: ratones UCP1 Cre Cas9.
- Administración de AAV-sgRNA mediante microinyección quirúrgica.
Resultados principales
- Objetivo alcanzado y eliminación exitosa del tejido adiposo pardo.
- Eficacia demostrada del AAV en la edición génica específica de tejidos.
- Técnicas quirúrgicas clave validadas para la administración precisa.
Conclusiones
- El estudio muestra una técnica rápida para generar modelos knockout pertinentes al metabolismo de la grasa parda.
- Mejora la comprensión de los reguladores moleculares en el metabolismo energético.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La generación rápida de ratones knockout específicos para el tejido adiposo pardo (TAP) mediante el uso combinado de las tecnologías Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 y AAV-sgRNA permite acelerar la genómica funcional en la investigación metabólica. Este enfoque agiliza la validación de dianas y la reducción mecanicista de riesgos para genes implicados en la regulación energética, reduciendo los tiempos de ciclo en comparación con la cría tradicional. El método apoya las decisiones de cartera al proporcionar conocimientos específicos de tejido críticos para el descubrimiento temprano y la continuidad traslacional.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación directa de la función génica en el tejido adiposo pardo para obtener una mayor claridad mecanicista.
- Apoya la reducción de riesgos biológicos al aislar los efectos génicos en un tejido relevante para la enfermedad.
- Facilita la confianza predictiva en la selección de dianas para trastornos metabólicos.
Desarrollo de pruebas y cribado
- Proporciona modelos validados de knockout para la selección fenotípica posterior.
- Normaliza los fondos genéticos para obtener lecturas cuantitativas reproducibles.
- Acelera el desarrollo de ensayos al evitar ciclos largos de cría.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Alinea modelos preclínicos con mecanismos de enfermedades metabólicas humanas mediante edición génica específica de tejido adiposo pardo (BAT).
- Permite un avance ajustado al riesgo al aclarar la contribución del gen al metabolismo energético.
- Apoya la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica en la investigación metabólica.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método se integra en las etapas iniciales de descubrimiento y validación de dianas, proporcionando un puente hacia el desarrollo de modelos preclínicos para carteras de investigación metabólica y endocrina.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías en la regulación energética mediada por el tejido adiposo pardo (BAT).
- Tamizaje: Proporciona modelos de eliminación genética reproducibles para ensayos fenotípicos cuantitativos.
- Analítica: Permite la medición de efectos específicos de genes sobre los resultados metabólicos in vivo.
- Investigación Traducional: Facilita la alineación de modelos preclínicos con la biología del tejido adiposo pardo humano.
- Reutilización Empresarial: Protocolo adaptable para otros tejidos mediante la modificación de la entrega del AAV, lo que favorece una utilidad más amplia en I+D.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos.
- Valor operativo: Agiliza la generación de modelos mediante procedimientos estandarizados y reproducibles.
- Valor estratégico: Permite decisiones más rápidas de avance/no avance y una asignación eficiente de recursos con menor inversión de capital.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de objetivos metabólicos y endocrinos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microinyección quirúrgica y localización anatómica del tejido adiposo pardo (BAT).
- Necesita acceso a infraestructura para la producción de AAV e ingeniería genética con CRISPR-Cas9.
- Exige una rigurosa estandarización entre equipos para garantizar la reproducibilidad.
- Es necesario adaptar el protocolo para dirigirse a otros tejidos u órganos.
- El éxito depende de una administración precisa del AAV y de la minimización del daño tisular.
