Name: Aislamiento y cultivo de células madre derivadas de tejido adiposo humano con un innovador método libre de xenogénicos para terapia humana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T14:50:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Aprende un método libre de xenogénicos para aislar y expandir células madre derivadas de tejido adiposo humano. Esta técnica mejora la bios seguridad en terapia celular y facilita aplicaciones clínicas reproducibles.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los autores no tienen reconocimientos.

Las hASC se aislaron del tejido adiposo abdominal de una mujer sana que se sometió a una reconstrucción mamaria utilizando colgajos autólogos abdominales (colgajos perforantes epigástricos inferiores profundos, [DIEP]) en el Hospital Universitario de Lausana, CHUV, Lausana, Suiza. La parte desechada del colgajo y el tejido adiposo se obtuvieron después de que el paciente firmó el consentimiento informado. Todos los protocolos fueron revisados y aprobados por el Departamento de Biobanco DAL del hospital (número 314 GGC) y los comités de ética de acuerdo con la Declaración de Helsinki.
NOTA: Todos los pasos deben realizarse bajo una campana de flujo laminar y con condiciones asépticas. Siempre se deben usar guantes y batas de laboratorio para la protección personal, y todas las superficies deben lavarse con biocidas apropiados. El exceso de tejido debe eliminarse adecuadamente como desechos biomédicos.
1. Materiales necesarios y preparación de las soluciones de cultivo
<ol><li>Para el aislamiento, expansión y criopreservación celular, obtenga los siguientes instrumentos: tijeras estériles; bisturís estériles; pinzas estériles; una placa de Petri de 10 cm; tubos de 15 ml; Matraces T25; una cámara Burker; crioviales; un contenedor de congelación de celdas; un microscopio óptico con objetivos de aumento de 4x y 10x; y una centrífuga de cubo oscilante.</li>
	<li>Para el inmunofenotipado, obtener los siguientes instrumentos y reactivos: tubos FACS, solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS); Medio esencial mínimo (DMEM) de Dulbecco; hPL; sulfuro de dimetilo; y tripsina libre de animales.</li>
	<li>Prepare el medio de cultivo completo complementando DMEM con hPL libre de heparina al 5%. Conservar el medio a 4 °C durante un máximo de 3 semanas y utilizar siempre caliente (entre temperatura ambiente y 37 °C). Siguiendo las pautas GMP para la producción de medicamentos celulares destinados a la terapia humana, no agregue ningún antibiótico al medio de cultivo.</li>
	<li>Prepare un medio de congelación que contenga 20% de hPL y 10% de sulfuro de dimetilo en DMEM.</li>
</ol>2. Aislamiento de hASCs de la muestra de tejido adiposo
<ol><li>Procesar la muestra de tejido adiposo dentro de las 6 h siguientes a su obtención. Antes de proceder al método de aislamiento mecánico libre de xenogénico establecido, lave el tejido 2 veces con PBS durante 10 minutos hasta que se liberen el tejido conectivo y la sangre.</li>
	<li>Almacenar la muestra de tejido adiposo obtenida de la cirugía abdominoplástica en PBS a 4° C hasta su procesamiento y, en cualquier caso, no más de 24 h, para no dañar la viabilidad de hASC.</li>
	<li>Cortar el tejido adiposo en trozos más pequeños de aproximadamente 1cm2 con tijeras estériles.</li>
	<li>Con un bisturí, microdiseccionar cada pieza en pequeños fragmentos con diámetros <5 mm, y dispersar cinco de ellos en una placa de Petri de 10 cm (Figura 2A).</li>
	<li>Para unir cada fragmento, use el bisturí para crear incisiones en la superficie plástica, arrastrando cada fragmento hasta que esté firmemente pegado a la placa de Petri. Use pinzas para ayudar a manejar el fragmento (Figura 2B).</li>
	<li>Añadir suavemente 10 ml de medio de cultivo completo para cubrir todos los fragmentos sin desprenderlos.</li>
	<li>Incubar las placas de Petri a 37 °C y 5% deCO2. Las hASCs migrarán fuera del tejido y serán seleccionadas debido a su adherencia plástica sin digestión enzimática.</li>
	<li>Hasta la confluencia celular, monitoree la expansión hASC bajo un microscopio óptico con un aumento de 4x una vez al día. A medida que las hASC comienzan a salir del tejido, aparecen como pequeños grupos alrededor de las piezas de tejido con una morfología típica similar a los fibroblastos. Los hASC se seleccionan debido a su capacidad para adherirse a la superficie plástica. Cada 72 h, retire la mayor cantidad de medio posible y reemplácelo con un medio completo fresco para eliminar los restos celulares.</li>
	<li>Deje los fragmentos de tejido en su lugar hasta el primer paso de las células, que generalmente es después de 7 días.</li>
</ol>3. cultivo de hASC después de la fase de aislamiento
<ol><li>Cuando el cultivo hASC alcanza una confluencia del 70% al 80%, las hASC están listas para separarse y expandirse aún más para ser utilizadas para otros experimentos o almacenamiento a largo plazo.</li>
	<li>Con pinzas estériles, retire y deseche todos los trozos de tejido de la placa de Petri. Retire y deseche el medio agotado, teniendo cuidado de no tocar las hASCs para no desprenderlas.</li>
	<li>Lave cuidadosamente las células una vez con 10 ml de PBS. Añadir 1 ml de 1x tripsina libre de animales y dejar la placa de Petri en la incubadora a 37 °C durante 5 min.</li>
	<li>Verifique bajo un microscopio óptico con un aumento de 4x si todas las celdas se han desprendido; de lo contrario, deje la placa de Petri durante 2 minutos adicionales en la incubadora y, finalmente, golpee suavemente la superficie de plástico para soportar el desprendimiento de células.</li>
	<li>Detenga la acción de la tripsina agregando 2 ml de medio completo y recoja todas las células en un tubo de 15 ml.</li>
	<li>Para eliminar cualquier tripsina restante, centrifugar el tubo a 300 x g durante 5 min. Desechar el sobrenadante, suspender las células con 5 ml de medio completo y transferir la suspensión celular a un nuevo matraz T25. Mantenga los hASC en cultivo y expándalos hasta que sea necesario.</li>
</ol>4. Investigación del inmunofenotipo por citometría de flujo
<ol><li>Cuando el cultivo de hASC alcance una confluencia del 70%-80%, separe las hASC como se describió anteriormente en la sección 3.</li>
	<li>Después de recolectar las células, suspenderlas en 1 ml de medio completo y contar una alícuota con el contador celular bajo un microscopio óptico con un aumento de 10x.</li>
	<li>Centrifugar las hASCs a 300 x g durante 5 min, y suspenderlas a 1 x 106 células/ml de tampón FACS. Transfiera 100 μL de la suspensión que contiene 1 x 105 células a un tubo FACS. Utilice un tubo FACS para cada antígeno investigado, más uno más para cada control isotípico.</li>
	<li>Teñir las células con 100 μL de los siguientes anticuerpos diluidos en tampón FACS: anti-CD73 (1:1.000, IgG1, marcado con FITC), anti-CD105 (1:200, IgG1, marcado con PE); anti-CD34 (1:66, IgG1, marcado con FITC); anti-CD45 (1:66, IgG1, marcado con FITC); y controles isotípicos para cada fluoróforo, marcado con IgG1 FITC (1:1.000) e IgG1 PE (1:50).</li>
	<li>Incubar las muestras durante 1 h en la oscuridad con agitación a 4 °C. Centrifugar los tubos a 300 x g durante 5 min, desechar el sobrenadante y suspender las células en 500 μL de tampón FACS.</li>
	<li>Evaluar el inmunofenotipo celular con un instrumento de citometría de flujo, registrando 50.000 eventos para cada tubo dentro de la puerta seleccionada para excluir restos celulares. Calcule el porcentaje de células que expresan como la diferencia del control isotípico específico.</li>
</ol>5. Ensayo de proliferación de hASC
<ol><li>Cuando el cultivo de hASC alcance una confluencia del 70%-80%, separar las hASCs como se describe en la sección 3.</li>
	<li>Después de recolectar las células, suspenderlas en 1 ml de medio completo y contar una alícuota con el contador celular bajo un microscopio óptico con un aumento de 10x.</li>
	<li>Semilla 5 x 102 hASCs en 200 μL de medio completo en placas transparentes de 96 pocillos. Siembra las células en réplicas técnicas, con un pozo para cada punto de tiempo.</li>
	<li>A los 3 días después de la siembra, comience a detectar la proliferación celular utilizando un kit de ensayo de proliferación siguiendo las instrucciones del fabricante. En resumen, reemplace el medio de cultivo con 100 μL de medio fresco agregado a 20 μL de reactivo de ensayo por pocillo. Incubar las hASCs durante 2,5 h a 37 °C, 5% deCO2 para el desarrollo de reactivos, y luego detectar la absorbancia a 490 nm con un espectrofotómetro.</li>
	<li>Exprese la proliferación de hASC como el porcentaje de absorbancia después de eliminar la absorbancia en blanco.</li>
</ol>6. Criopreservación y almacenamiento de las hASCs
<ol><li>Separe las celdas como se describe en la sección 3 y cuente una alícuota con el contador de células bajo un microscopio óptico con un aumento de 10x.</li>
	<li>Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min, y desechar el sobrenadante. Suspender las células con mezcla de congelación a una densidad de 1 x 106 hASCs/mL, y transferir 1 mL de la solución celular a un criovial.</li>
	<li>Coloque los crioviales a -80 ° C en un recipiente de congelación que disminuya la temperatura en 1 ° C / min, y luego mueva los crioviales a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.</li>
</ol>

<ol><li>Naderi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regenerative+role+of+adipose-derived+stem+cells+%28ADSC%29+in+plastic+and+reconstructive+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22International+Wound+Journal%22%5BJournal%5D)">The regenerative role of adipose-derived stem cells (ADSC) in plastic and reconstructive surgery.</a> International Wound Journal. 14 (1), 112-124 (2017).</li>
<li>Guiotto, M., Riehle, M. O., Raffoul, W., Hart, A., di Summa, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+human+platelet+lysate+%28hPL%29+the+ideal+candidate+to+substitute+the+foetal+bovine+serum+for+cell-therapy+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Is human platelet lysate (hPL) the ideal candidate to substitute the foetal bovine serum for cell-therapy translational research.</a> Journal of Translational Medicine. 19 (1), 426(2021).</li>
<li>Condé-Green, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shift+toward+mechanical+isolation+of+adipose-derived+stromal+vascular+fraction%3A+Review+of+upcoming+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery.+Global+Open%22%5BJournal%5D)">Shift toward mechanical isolation of adipose-derived stromal vascular fraction: Review of upcoming techniques.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 4 (9), 1017(2016).</li>
<li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue%3A+Implications+for+cell-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies.</a> Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).</li>
<li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+of+adipose-derived+stem+cells+and+collagenase+in+fat+tissue+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Aesthetic+Plastic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Safety of adipose-derived stem cells and collagenase in fat tissue preparation.</a> Aesthetic Plastic Surgery. 37 (4), 802-808 (2013).</li>
<li>Spees, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internalized+antigens+must+be+removed+to+prepare+hypoimmunogenic+mesenchymal+stem+cells+for+cell+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Internalized antigens must be removed to prepare hypoimmunogenic mesenchymal stem cells for cell and gene therapy.</a> Molecular Therapy. 9 (5), 747-756 (2004).</li>
<li>Fadel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+obtainment+and+isolation+of+two+mesenchymal+stem+cell+sources+in+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cirurgica+Brasileria%22%5BJournal%5D)">Protocols for obtainment and isolation of two mesenchymal stem cell sources in sheep.</a> Acta Cirurgica Brasileria. 26 (4), 267-273 (2011).</li>
<li>Markarian, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+adipose-derived+stem+cells%3A+A+comparison+among+different+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Letters%22%5BJournal%5D)">Isolation of adipose-derived stem cells: A comparison among different methods.</a> Biotechnology Letters. 36 (4), 693-702 (2014).</li>
<li>Sherman, L. S., Condé-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-free+method+for+isolation+and+expansion+of+human+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (154), e59419(2019).</li>
<li>Lalu, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+of+cell+therapy+with+mesenchymal+stromal+cells+%28SafeCell%29%3A+A+systematic+review+and+meta-analysis+of+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Safety of cell therapy with mesenchymal stromal cells (SafeCell): A systematic review and meta-analysis of clinical trials.</a> PLoS One. 7 (10), 47559(2012).</li>
<li>Escobar, C. H., Chaparro, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xeno-free+extraction%2C+culture%2C+and+cryopreservation+of+human+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Xeno-free extraction, culture, and cryopreservation of human adipose-derived mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 5 (3), 358-365 (2016).</li>
<li>Vaidya, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet-C+irradiation+for+inactivation+of+viruses+in+foetal+bovine+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet-C irradiation for inactivation of viruses in foetal bovine serum.</a> Vaccine. 36 (29), 4215-4221 (2018).</li>
<li>Kyllönen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+different+serum+conditions+on+osteogenic+differentiation+of+human+adipose+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Effects of different serum conditions on osteogenic differentiation of human adipose stem cells in vitro.</a> Stem Cell Research & Therapy. 4 (1), 17(2013).</li>
<li>Schallmoser, K., Henschler, R., Gabriel, C., Koh, M. B. C., Burnouf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+quality+requirements+of+human+platelet+lysate%3A+A+position+statement+from+the+Working+Party+on+Cellular+Therapies+of+the+International+Society+of+Blood+Transfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Production and quality requirements of human platelet lysate: A position statement from the Working Party on Cellular Therapies of the International Society of Blood Transfusion.</a> Trends in Biotechnology. 38 (1), 13-23 (2020).</li>
<li>Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+platelet+lysate+to+substitute+fetal+bovine+serum+in+hMSC+expansion+for+translational+applications%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human platelet lysate to substitute fetal bovine serum in hMSC expansion for translational applications: A systematic review.</a> Journal of Translational Medicine. 18 (1), 351(2020).</li>
<li>Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+platelet+lysate+acts+synergistically+with+laminin+to+improve+the+neurotrophic+effect+of+human+adipose-derived+stem+cells+on+primary+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Human platelet lysate acts synergistically with laminin to improve the neurotrophic effect of human adipose-derived stem cells on primary neurons.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 658176(2021).</li>
<li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li>
<li>Cowper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+platelet+lysate+as+a+functional+substitute+for+fetal+bovine+serum+in+the+culture+of+human+adipose+derived+stromal%2Fstem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Human platelet lysate as a functional substitute for fetal bovine serum in the culture of human adipose derived stromal/stem cells.</a> Cells. 8 (7), 724(2019).</li>
<li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+for+the+treatment+and+prevention+of+graft-versus-host+disease%3A+Experiments+and+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells for the treatment and prevention of graft-versus-host disease: Experiments and practice.</a> Annals of Hematology. 92 (10), 1295-1308 (2013).</li>
<li>Palombella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+metal+micro+and+nano-particles+on+hASCs%3A+An+in+vitro+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomaterials%22%5BJournal%5D)">Effects of metal micro and nano-particles on hASCs: An in vitro model.</a> Nanomaterials. 7 (8), 212(2017).</li>
<li>Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stromal+vascular+fraction+cells%3A+Update+on+clinical+utility+and+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Eukaryotic+Gene+Expression%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stromal vascular fraction cells: Update on clinical utility and efficacy.</a> Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 25 (2), 145-152 (2015).</li>
<li>Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+medium+composition+and+translational+adult+bone+marrow-derived+stem+cell+research%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Cell culture medium composition and translational adult bone marrow-derived stem cell research.</a> Stem Cells. 24 (5), 1409-1410 (2006).</li>
<li>Perez-Ilzarbe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+ex+vivo+expansion+culture+conditions+of+mesenchymal+stem+cells+for+human+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Comparison of ex vivo expansion culture conditions of mesenchymal stem cells for human cell therapy.</a> Transfusion. 49 (9), 1901-1910 (2009).</li>
<li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+different+cell-detaching+methods+on+the+viability+and+cell+surface+antigen+expression+of+synovial+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells.</a> Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).</li>
<li>Shah, F. S., Wu, X., Dietrich, M., Rood, J., Gimble, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-enzymatic+method+for+isolating+human+adipose+tissue-derived+stromal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">A non-enzymatic method for isolating human adipose tissue-derived stromal stem cells.</a> Cytotherapy. 15 (8), 979-985 (2013).</li>
<li>Becherucci, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+platelet+lysate+in+mesenchymal+stromal+cell+expansion+according+to+a+GMP+grade+protocol%3A+A+cell+factory+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Human platelet lysate in mesenchymal stromal cell expansion according to a GMP grade protocol: A cell factory experience.</a> Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 124(2018).</li>
<li>Blande, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+mesenchymal+stem+cell+expansion+in+animal+serum-free+medium+supplemented+with+autologous+human+platelet+lysate%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue mesenchymal stem cell expansion in animal serum-free medium supplemented with autologous human platelet lysate.</a> Transfusion. 49 (12), 2680-2685 (2009).</li>
<li>Castegnaro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+platelet+lysate+on+the+functional+and+molecular+characteristics+of+mesenchymal+stem+cells+isolated+from+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Effect of platelet lysate on the functional and molecular characteristics of mesenchymal stem cells isolated from adipose tissue.</a> Current Stem Cell Research & Therapy. 6 (2), 105-114 (2011).</li>
<li>Palombella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+review+and+meta-analysis+on+the+use+of+human+platelet+lysate+for+mesenchymal+stem+cell+cultures%3A+Comparison+with+fetal+bovine+serum+and+considerations+on+the+production+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Systematic review and meta-analysis on the use of human platelet lysate for mesenchymal stem cell cultures: Comparison with fetal bovine serum and considerations on the production protocol.</a> Stem Cell Research & Therapy. 13 (1), 142(2022).</li>
<li>Palombella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+platelet+lysate+as+a+potential+clinical-translatable+supplement+to+support+the+neurotrophic+properties+of+human+adipose-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Human platelet lysate as a potential clinical-translatable supplement to support the neurotrophic properties of human adipose-derived stem cells.</a> Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 432(2020).</li>
<li>Krähenbühl, S. M., Grognuz, A., Michetti, M., Raffoul, W., Applegate, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+human+adipose-derived+stem+cell+expansion+and+stability+for+clinical+use%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Enhancement of human adipose-derived stem cell expansion and stability for clinical use.</a> International Journal of Stem Cell Research & Therapy. 2 (1), 007(2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Las células madre derivadas de tejido adiposo han atraído el interés de la investigación traslacional en la última década debido a su abundancia, métodos de aislamiento rápidos y asequibles, alta tasa de proliferación in vitro/in vivo y propiedades de tallo/diferenciación18,19,20. Como resultado, las hASCs son consideradas un excelente candidato para estrategias basadas en células en medicina regenerativa<sup c...

En las últimas décadas, la creciente demanda de tratamientos terapéuticos innovadores ha dado lugar a importantes esfuerzos e inversión de recursos en el campo de la medicina traslacional1. Los productos basados en células están asociados con riesgos determinados por la fuente celular, el proceso de fabricación (aislamiento, expansión o modificación genética) y los suplementos no celulares (enzimas, factores de crecimiento, suplementos de cultivo y antibióticos), y estos factores de riesgo dependen de la indicación terapéutica específica. La calidad, seguridad y eficacia del producto final podrían verse profundamente influenciadas por los elementos indicados anteriormente2. La terapia con células madre requiere la adhesión a los principios de bioseguridad; Los riesgos potenciales de transmisión patógena con productos derivados de animales en cultivo celular podrían ser problemáticos, y la prueba exhaustiva de cualquier producto introducido en la fabricación es esencial3.
El método tradicional para aislar células madre derivadas de tejido adiposo humano (hASCs) implica una digestión enzimática realizada con colagenasa seguida de pasos de lavado a través de centrifugación4. Si bien el aislamiento enzimático generalmente se considera más eficiente que otras técnicas mecánicas en términos de rendimiento celular y viabilidad, los componentes derivados de animales utilizados, como la colagenasa, se consideran más que mínimamente manipulados por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos. Esto significa que existe un riesgo significativamente mayor de reacciones inmunes o transmisión de enfermedades, lo que limita la traducción de la terapia con hASC a entornos clínicos 5,6.
La digestión basada en tripsina es otro protocolo enzimático para aislar las ASC. Se han descrito diferentes técnicas con ligeras modificaciones en cuanto a la concentración de tripsina, velocidad de centrifugación y tiempo de incubación. Desafortunadamente, este método no está bien descrito, y existe una falta de comparación en la literatura, particularmente con los protocolos de aislamiento mecánico7. Sin embargo, en términos de la traducibilidad del enfoque, la tripsina tiene los mismos inconvenientes de la colagenasa.
Los métodos alternativos de aislamiento para obtener ASC, basados en fuerzas mecánicas y sin adición de enzimas, implican la centrifugación a alta velocidad (800 x g o 1.280 x g, 15 min) de los fragmentos de tejido adiposo. A continuación, el pellet se incuba con un tampón de lisis de glóbulos rojos (5 min), seguido de otro paso de centrifugación a 600 x g antes de la resuspensión en medio de cultivo. A pesar de un mayor número de células aisladas en los primeros días en comparación con los métodos de explante, un estudio previo mostró menor o ausencia de proliferación más allá de la segunda semana de cultivo8.
Además de eso, la manipulación adicional con medio xenogénico agregado, como el suero bovino fetal (FBS), que se utiliza como un suplemento de factor de crecimiento para cultivo celular, se asocia con un mayor riesgo de reactividad inmune y exposición a infecciones virales, bacterianas o priónicas del paciente huésped 9,10. Las reacciones inmunes y el desarrollo de erupción urticariforme ya se han descrito en individuos que reciben varias dosis de células madre mesenquimales producidas con FBS11. Además, FBS está sujeto a variabilidad de lote a lote, lo que puede tener un impacto en la calidad del producto final12.
De acuerdo con las directrices de buenas prácticas de fabricación (GMP), se debe evitar la disociación enzimática del tejido, y FBS debe sustituirse con suplementos libres de xenogénicos. Estos pasos, junto con protocolos más confiables y reproducibles, son esenciales para apoyar la aplicación de la terapia celular 3,13.
En este contexto, el lisado plaquetario humano (hPL) ha sido sugerido como un sustituto del FBS, ya que es un suplemento libre de células, que contiene proteínas, enriquecido con factor de crecimiento, y se introdujo anteriormente entre los productos basados en células de grado clínico como aditivo del medio de crecimiento para el cultivo y expansión celular in vitro 14,15. Como el hPL es un producto derivado del ser humano, se utiliza con frecuencia como sustituto del FBS durante el cultivo in vitro de hASCs destinadas a aplicaciones clínicas, reduciendo así los problemas relacionados con las reacciones inmunológicas y las infecciones relacionadas con la traducibilidad del FBS15,16.
A pesar de los mayores costos de producción, ya se ha demostrado que, en comparación con FBS, hPL apoya la viabilidad celular para muchos tipos de células, aumenta la proliferación, retrasa la senescencia, asegura la estabilidad genómica y conserva el inmunofenotipo celular incluso en pasajes celulares tardíos; Todos estos elementos apoyan el cambio hacia este suplemento cultural11.
El objetivo de este trabajo fue desarrollar un protocolo estandarizado para aislar y cultivar hASCs con un método completo libre de animales, sin modificar la fisiología celular y las propiedades del tallo en comparación con las hASCs clásicas cultivadas con FBS (Figura 1).

<table><tbody><tr><td>Tubos de 15 mL</td><td>euroclon</td><td>ET5015B</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD105</td><td>BD Biosciences</td><td>BD560839</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD34</td><td>BD Biosciences</td><td>BD555821</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>BD555482</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD73</td><td>BD Biosciences</td><td>BD561254</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Solución de enjuague (tampón FACS)</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-222</td><td></td></tr><tr><td>BD Aparato Accuri C6 (instrumento de citometría de flujo)</td>BD Cámara <td>Accuri-Burker</td><td></td> Blaubrand 717810 Contenedor de <td></td></tr><tr><td>congelación de células</td><td>Corning</td><td>CLS432002</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter 96 AQueous One Solution Ensayo de proliferación celular</td><td>Promega</td><td>G3582</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> CoolCell Contenedor de congelación Corning <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>CLS432002</tr><tr><td>Cryovials</td><td>clearline</td><td>390701</td><td></td></tr><tr><td>sulfuro de dimetilo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-100mL</td><td></td></tr><tr><td>bisturí de hoja desechable</td><td>paragon</td><td>bs 2982</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium - high glucose</td><td>GIBCO</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Lisado de plaquetas humanas FD (grado GMP)</td><td>Stemulate</td><td>PL-NH-500</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro Infinite F50</td><td>Microscopio</td> <td>Tecan-Óptico</td><td></td></tr> <tr><td>con objetivos de aumento de 4x y 10x</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri 10 cm</td><td>Greiner bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>Bisturíes estériles</td><td>Reda</td><td>07104-00</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras estériles</td><td>Bochem</td><td>4071</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas estériles</td><td>Bochem</td><td>1152</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de cubo oscilante</td><td>Sigma</td><td>3-16K</td><td></td></tr><tr><td>T25 Matraces</td><td>Greiner bio-one</td><td>6910170</td><td></td></tr><tr><td>TrypLe (sustituto de tripsina sin animales)</td><td>GIBCO</td><td>12604-013</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento y cultivo de células madre derivadas de tejido adiposo humano con un innovador método libre de xenogénicos para terapia humana

Isolation and Culture of Human Adipose-Derived Stem Cells With an Innovative Xenogeneic-Free Method for Human Therapy

Teniendo en cuenta el creciente impacto de la terapia con células madre, se han planteado preocupaciones de bioseguridad con respecto a la posible contaminación o transmisión de infecciones debido a la introducción de productos derivados de animales durante la manipulación in vitro . Los componentes xenogénicos, como la colagenasa o el suero bovino fetal, comúnmente utilizados durante los pasos de aislamiento y expansión celular podrían estar asociados con los riesgos potenciales de reactividad inmune o infección viral, bacteriana y priónica en los pacientes receptores. Siguiendo las pautas de buenas prácticas de fabricación, se debe evitar la disociación química del tejido, mientras que el suero bovino fetal (FBS) puede sustituirse con suplementos libres de xenogénicos. Además, para garantizar la seguridad de los productos celulares, es importante definir métodos más fiables y reproducibles. Hemos desarrollado un método innovador, completamente libre de xenogénicos, para el aislamiento y la expansión in vitro de células madre derivadas de tejido adiposo humano sin alterar sus propiedades en comparación con los protocolos estándar de cultivo FBS de colagenasa. Aquí, las células madre derivadas de tejido adiposo humano (hASCs) se aislaron del tejido adiposo abdominal. La muestra se picó mecánicamente con tijeras/bisturí, se microdisecó y se dispersó mecánicamente en una placa de Petri de 10 cm, y se preparó con incisiones de bisturí para facilitar la unión de los fragmentos de tejido y la migración de hASCs. Siguiendo los pasos de lavado, se seleccionaron hASCs debido a su adherencia plástica sin digestión enzimática. Las hASCs aisladas se cultivaron con medio suplementado con lisado plaquetario humano libre de heparina al 5% y se separaron con un sustituto de tripsina libre de animales. Siguiendo las instrucciones de buenas prácticas de fabricación (GMP) sobre la producción de productos celulares destinados a la terapia humana, no se utilizaron antibióticos en ningún medio de cultivo.

Aplicando el método de aislamiento detallado anteriormente, las hASCs se obtuvieron con éxito de muestras de tejido adiposo abdominal sin el uso de colagenasa. Además, las hASCs se expandieron en condiciones completamente libres de xenogénicas en presencia de hPL y sin ningún otro componente de origen animal. Los siguientes resultados apoyan el protocolo y se obtienen de hASCs cultivadas en paralelo con hPL y con FBS como condición de control.
Después de la aparición inicial del grupo, las hAS...

Los productos xenogénicos (químicos o derivados de animales) introducidos en los pasos de preparación/manipulación de la terapia celular se asocian con un mayor riesgo de reactividad inmune y transmisión patogénica en pacientes huéspedes. Aquí, se describe un método completo libre de xenogénicos para el aislamiento y la expansión in vitro de células madre derivadas de tejido adiposo humano.

Aislamiento y cultivo de células madre derivadas de tejido adiposo humano con un innovador método libre de xenogénicos para terapia humana

Considering the increasing impact of stem cell therapy, biosafety concerns have been raised regarding potential contamination or infection transmission ...

Nuestro método libre de exógenos para el aislamiento y la expansión in vitro de células madre derivadas de tejido adiposo humano es la respuesta a las preocupaciones de bioseguridad en torno a la terapia celular cuando se considera para su aplicación traslacional. Nuestros métodos de aislamiento y expansión son fáciles de replicar, rápidos y bajos en requisitos técnicos, lo que los hace útiles para todos. Investigamos la estrategia de terapia basada en células madre adiposas humanas para la reparación de nervios periféricos.Sin embargo, nuestra técnica se puede aplicar ampliamente cuando se necesitan nuevas células madre adiposas en diferentes configuraciones de investigación clínica. Lo mantuvimos simple para conservar una producibilidad más fácil. La esterilidad debe observarse cuidadosamente desde el quirófano hasta el cultivo celular.Para la manipulación de muestras y fragmentos, la microdisección corre el riesgo de contaminación. Después de obtener la muestra de tejido adiposo de la cirugía plástica abdominal, utilizando tijeras estériles, córtela en trozos de aproximadamente un centímetro cuadrado. Con un bisturí, micro diseccionar cada pieza en fragmentos más pequeños y dispersar cinco fragmentos en una placa de Petri de 10 centímetros.Para la fijación de fragmentos, use un bisturí para crear incisiones en la superficie plástica y arrastre cada fragmento. Suavemente, agregue 10 mililitros de medio de cultivo completo para cubrir todos los fragmentos sin separarlos e incube la placa de Petri a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Monitoree la expansión diaria de la célula madre derivada de tejido adiposo humano, o HASC, bajo un microscopio óptico hasta que las células se vuelvan confluentes.Reemplace el medio con un medio completo fresco cada 72 horas para eliminar los restos celulares y déjelos crecer hasta el primer paso. Una vez que el cultivo HASC alcance el 70 al 80% de confluencia, retire y deseche todas las piezas de tejido con pinzas estériles. Además, deseche el medio agotado evitando el desprendimiento del HASC de la placa de Petri.Lave cuidadosamente las células con 10 mililitros de PBS. Después de eliminar PBS, agregue un mililitro de tripsina libre de animales e incube a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Verifique si hay desprendimiento de células bajo un microscopio óptico e incube durante dos minutos más, si es necesario.Para soportar el desprendimiento celular, golpee suavemente la superficie de plástico. Detenga la acción de la tripsina agregando dos mililitros de medio completo y recoja todas las células en un tubo de 15 mililitros. Eliminar la tripsina restante por centrifugación.Después de desechar el sobrenadante, suspender las células en cinco mililitros de medio completo y transferir la suspensión celular a un nuevo matraz T25. Para la criopreservación, cuente una alícuota de células separadas separadas utilizando el contador de células bajo un microscopio óptico. Centrifugar las células a 300 G durante cinco minutos.Después de desechar el sobrenadante, suspenda las células en la mezcla de congelación a una densidad de una vez de 10 a la sexta células por mililitro y transfiera un mililitro de la suspensión celular a un vial criogénico. Coloque los viales criogénicos a menos 80 grados centígrados en un recipiente de congelación que disminuya la temperatura en un grado centígrado por minuto y luego mueva los viales criogénicos a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo. En la apariencia inicial del racimo, las HSC mostraron una forma clásica de husillo y eran más pequeñas, así como más alargadas en comparación con las células de control en presencia de FBS.El inmunofenotipo celular pareció ser similar entre las HASC cultivadas con los dos suplementos. Más del 80 al 90% de las HASC fueron positivas para CD73 y CD105 y menos del 5% se expresaron para CD34 y CD45. Finalmente, el ensayo de proliferación reveló un aumento significativo en el crecimiento celular cuando se agregó lisado de plaquetas humanas al medio en comparación con el control FBS.El paso más importante es la microdisección de fragmentos adiposos y su fijación con incisión de bisturí en placa de Petri. Se obtiene una población de células madre derivadas de tejido adiposo humano listo para usar con respecto a los criterios de bioseguridad GMP, manteniendo las propiedades celulares terapéuticas y mejorando la proliferación celular.

isolation-culture-human-adipose-derived-stem-cells-with-an-innovative

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

En 2001, investigadores de la UCLA describen el aislamiento de una población de células madre adultas, denominada células madre o las ASC derivadas de tejido adiposo, a partir de tejido adiposo. En este artículo se describe el aislamiento de las ASC de lipoaspirates utilizando un protocolo de digestión manual, enzimática utilizando colagenasa.

Aislamiento Manual de células madre derivadas de tejido adiposo de Lipoaspirates Humanos

La heterogeneidad transcripcional dentro de las células estromales derivadas del tejido adiposo humano se puede definir a nivel de célula individual utilizando marcadores de superficie celular y genes osteogénicos.  Describimos un protocolo que utiliza citometría de flujo para el aislamiento de subpoblaciones celulares con mayor potencial osteogénico, que puede usarse para mejorar la reconstrucción esquelética craneofacial.

El aislamiento y enriquecimiento de Human adiposo derivado de células estromales de la osteogénesis mejorada

Los adipocitos maduros pueden representar una fuente abundante de células madre a través de la desdiferenciación, lo que conduce a una población homogénea de células similares a los fibroblastos. La digestión de la colagenasa se utiliza para aislar los adipocitos maduros de la grasa humana. El objetivo de nuestro protocolo es obtener células grasas multipotentes y desdiferenciadas a partir de adipocitos maduros humanos.

Generación de células madre adiposas Humano a través Desdiferenciación de adipocitos maduros en culturas de techo

La diferenciación de los adipocitos blancos y beiges de tejido adiposo vascular progenitores tiene potencial para mejoramiento metabólico en obesidad. Se describen los protocolos para un CD34 + CD31 + aislamiento de células endoteliales de la grasa humana y un posterior en vitro expansión y diferenciación a adipocitos blancos y beiges. Se discuten varias aplicaciones posteriores.

Aislamiento, expansión y Adipogenic inducción de CD31 + CD34 + células endoteliales del humano omentales y subcutáneos de tejido adiposo

Este protocolo proporciona un método libre de enzimas para aislar las células madre mesenquimales de muestras de abdominoplastia y lipoaspiración utilizando un método explantado. La ausencia de enzimas duras o pasos de centrifugación proporciona células madre clínicamente relevantes que pueden utilizarse para estudios in vitro o transferirse de vuelta a la clínica.

Un método libre de enzimas para el aislamiento y la expansión de las células madre mesenquimales derivadas de adiposo humano

Aquí, presentamos microfragmentación libre de enzimas del tejido adiposo humano utilizando un dispositivo de sistema cerrado. Este nuevo método permite la obtención de racimos submilimétricos de tejido adiposo adecuado para el trasplante in vivo, el cultivo in vitro y el aislamiento y caracterización celular adicional.

Microfragmentación de tejido adiposo humano para fenotipado celular y caracterización de secretos

Describimos un sistema de cultivo in vitro de matriz-adipocitos extracelulares humanos 3D que permite la disección de las funciones de la matriz y los adipocitos en contribuir al fenotipo metabólico del tejido adiposo.

Un modelo de cultivo de matriz-adipocitos extracelulares 3D humano para el estudio de la conversación cruzada metabólica Matrix-Cell

El presente protocolo describe una metodología mejorada para el aislamiento de ADSC que resulta en un tremendo rendimiento celular con ganancia de tiempo en comparación con la literatura. Este estudio también proporciona un método sencillo para obtener un número relativamente grande de células viables después de la criopreservación a largo plazo.

Técnica para la obtención de células madre mesenquimales a partir de tejido adiposo y caracterización de fracciones vasculares estromales en criopreservación a largo plazo

Este protocolo describe una metodología para aislar e identificar células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo (MSC) de ratas Sprague Dawley.

Aislamiento e identificación de células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo de ratas Sprague Dawley

El tejido adiposo es una excelente fuente de células madre mesenquimales. Aquí, traemos el paso a paso de la extracción, el cultivo y la caracterización de células madre derivadas del tejido adiposo (ADSC) del tejido adiposo epididimario de ratones suizos.

Aislamiento, expansión in vitro y caracterización de células madre mesenquimales a partir de tejido adiposo epididimario de ratón

Aquí presentamos un método estándar para aislar de forma eficiente células madre y adipocitos derivados del adiposo, caracterizado por una reducción del &gt; del 90% en el tiempo de procesamiento, alta viabilidad celular y amplia compatibilidad.

Aislamiento eficiente de células madre y adipocitos derivados del adiposo a partir de tejido adiposo porcino

Aprende un método libre de xenogénicos para aislar y expandir células madre derivadas de tejido adiposo humano. Esta técnica mejora la bios seguridad en terapia celular y facilita aplicaciones clínicas reproducibles.

Aislamiento y cultivo de células madre derivadas de tejido adiposo humano con un innovador método libre de xenogénicos para terapia humana (Video) | JoVE Journal

Aislamiento y cultivo de células madre derivadas de tejido adiposo humano con un innovador método libre de xenogénicos para terapia humana

Explorar más videos