Name: Aislamiento de células endoteliales de venas safenas humanas y exposición a niveles controlados de esfuerzo cortante y estiramiento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T14:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Aprende a aislar células endoteliales de venas safenas humanas y cultivarlas bajo esfuerzo cortante y estiramiento cíclico. Este método permite estudiar las respuestas mecánicas en biología vascular.

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Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

El segmento de la vena safena debe tener al menos 2 cm para aislar con éxito los hSVEC. Los segmentos pequeños son difíciles de manejar y atan los extremos del vaso para mantener la solución de colagenasa para aislar las células. La superficie luminal reducida no produce suficientes células para expandir el cultivo. Para minimizar el riesgo de contaminación con no CE, la manipulación del segmento de la vena safena debe ser muy suave durante todo el procedimiento. Es importante tener cuidado al introducir las puntas de la...

La disfunción de las células endoteliales (CE) es un actor clave en el fracaso del injerto de vena safena 1,2,3,4. El aumento sostenido del esfuerzo cortante y el estiramiento cíclico induce el fenotipo proinflamatorio de las células endoteliales de la vena safena humana (hSVECs)3,4,5,6. Las vías moleculares subyacentes aún no se comprenden completamente, y los protocolos estandarizados para estudios in vitro pueden aprovechar los esfuerzos para obtener nuevos conocimientos en el área. Aquí, describimos un protocolo simple para aislar, caracterizar y expandir los hSVEC y cómo exponerlos a niveles variables de esfuerzo cortante y estiramiento cíclico, imitando las condiciones hemodinámicas venosas y arteriales.
Los hSVEC se aíslan por incubación de colagenasa y se pueden utilizar hasta el paso 8. Este protocolo requiere menos manipulación del vaso en comparación con los otros protocolos disponibles7, lo que reduce la contaminación con células musculares lisas y fibroblastos. Por otro lado, requiere un segmento de recipiente más grande de al menos 2 cm para tener una extracción eficiente de la CE. En la literatura, se ha relatado que las CE de grandes vasos también pueden obtenerse por eliminación mecánica 7,8. Aunque eficaz, el enfoque físico tiene las desventajas de un bajo rendimiento de EC y una mayor contaminación por fibroblastos. Para aumentar la pureza, se necesitan pasos adicionales utilizando perlas magnéticas o clasificación celular, aumentando el costo del protocolo debido a la adquisición de perlas y anticuerpos 7,8. El método enzimático tiene resultados más rápidos y mejores en cuanto a la pureza y viabilidad de la CE 7,8.
Las CE más utilizadas para estudiar la disfunción endotelial son las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs). Se sabe que el fenotipo CE cambia en diferentes lechos vasculares, y es esencial desarrollar métodos que representen el vaso investigado 9,10. En este sentido, el establecimiento de un protocolo para aislar un hSVEC y cultivarlo bajo estrés mecánico es una herramienta valiosa para comprender la contribución de la disfunción hSVEC en la enfermedad del injerto venoso.

<table><tbody><tr><td>Solución de tripsina al 0,25%-EDTA al 0,02%</td><td>Gibco</td><td></td> 25200072 <td></td></tr><tr><td>15 y micro; portaobjetos I 0,4 Luer&nbsp;</td><td>Ibidi</td><td>80176</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dilactato (DAPI)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Estación de carga equibiaxial de 6 pocillos de 25 mm&nbsp;</td><td>Corporación Internacional Flexcell</td><td>LS-3000B25. Portaobjetos de cámara VJW</td><td></td></tr><tr><td>de 8 pocillos con pocillo extraíble</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>154453</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Acético (Glacial)</td><td>Millipore</td><td>100063</td><td></td></tr><tr><td>Lámina acrílica</td> de <td>plexiglás</td><td></td><td></td>de 1 cm de espesor</tr><tr><td>Anticuerpo anti-CD31</td><td>Abcam</td><td>ab24590</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31, anticuerpo FITC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MHCD3101</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-VE-cadherina</td><td>Señalización celular</td><td>2500</td><td></td></tr><tr><td>placas Bioflex colágeno I</td><td>Flexcell International Corporation</td><td>BF3001C</td><td></td></tr><tr><td>Solución de albúmina sérica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8412</td><td></td></tr><tr><td>Sutura de algodón EP 3.5 15 x 45 cm</td><td>Brasutura</td><td>AP524</td><td></td></tr><tr><td>Ciclofilina imprimación hacia adelante</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Custom diseñado</td><td></td></tr><tr><td>Ciclophilin reverse primer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Diseño</td><td></td>personalizado</tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 medio basal</td><td>Lonza</td><td>CC3156</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 SingleQuots suplementos</td><td>Lonza</td><td>CC4176</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2657-029</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de tensión Flexcell FX-5000</td><td>Flexcell International Corporation</td><td>FX-5000T</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje acuoso fluorado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina de piel porcina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2500</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-ratón IgG Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-Conejo IgG Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Heparina sódica de la mucosa intestinal porcina 5000 UI/mL</td><td>Blau Farmac&ecirc; utica</td><td>SKU 68027</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de bombeo Ibidi (Bomba + Unidad Fluida)</td><td>Ibidi</td><td>10902</td><td></td></tr><tr><td>Imprimación directa KLF2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Imprimación</td> inversa KLF2 diseñada <td></td></tr> a <tr><td></td> medida <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Imprimación</td> directa KLF4 diseñada <td></td></tr><tr><td>a</td> medida <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Imprimación</td> inversa KLF4 diseñada <td></td></tr><tr><td>a medida</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Analizador</td> de óxido nítrico NOA 280 diseñado <td></td>a medida</tr><tr><td></td><td>Sievers Instruments</td><td>NOA-280i-1</td><td></td></tr><tr><td>Imprimación directa NOS3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Imprimación</td> inversa NOS3 diseñada <td></td></tr> a <tr><td></td> medida <td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td> Paraformaldehído (PFA) diseñada <td></td>a</tr> <tr><td></td><td>medidaSigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Juego de perfusión 15 cm, ID 1,6 mm, rojo, depósitos de 10 mL</td><td>Ibidi</td><td>10962</td><td></td></tr><tr><td>Faloidina - Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Faloidina - Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12380</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Yoduro de</td> <td>potasioSigma-Aldrich</td><td>221945</td><td></td></tr><tr><td>QuanTitec SYBR kit de PCR verde</td><td>Qiagen</td><td>204143</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 12K flex platform&nbsp;</td><td>Biosystems Aplicados</td><td>4471087</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy micro kit&nbsp;</td><td>Quiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>Vidrio deslizante (24 mm x 60 mm)</td><td>Knittel Glass</td><td>VD12460Y1D.01</td><td></td></tr><tr><td>Nitrito de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31443</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV sistema de síntesis de primera cadena</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18091200</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tinte azul tripano 0.4%</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa tipo II de Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento de células endoteliales de venas safenas humanas y exposición a niveles controlados de esfuerzo cortante y estiramiento

Human Saphenous Vein Endothelial Cell Isolation and Exposure to Controlled Levels of Shear Stress and Stretch

La cirugía de injerto de derivación de la arteria coronaria (CABG, por sus siglas en inglés) es un procedimiento para revascularizar el miocardio isquémico. La vena safena sigue siendo utilizada como conducto de la CABG a pesar de la reducción de la permeabilidad a largo plazo en comparación con los conductos arteriales. El aumento abrupto del estrés hemodinámico asociado con la arterialización del injerto resulta en daño vascular, especialmente el endotelio, que puede influir en la baja permeabilidad del injerto de vena safena (SVG). Aquí, describimos el aislamiento, caracterización y expansión de las células endoteliales de la vena safena humana (hSVEC). Las células aisladas por digestión de colagenasa muestran la morfología típica de adoquines y expresan marcadores celulares endoteliales CD31 y VE-cadherina. Para evaluar la influencia del estrés mecánico, se utilizaron protocolos en este estudio para investigar los dos estímulos físicos principales, el esfuerzo cortante y el estiramiento, en SVG arterializados. Los hSVEC se cultivan en una cámara de flujo de placa paralela para producir esfuerzo cortante, mostrando alineación en la dirección del flujo y mayor expresión de KLF2, KLF4 y NOS3. Los hSVEC también se pueden cultivar en una membrana de silicio que permite un estiramiento celular controlado que imita el estiramiento venoso (bajo) y arterial (alto). El patrón de actina F de las células endoteliales y la secreción de óxido nítrico (NO) se modulan en consecuencia por el estiramiento arterial. En resumen, presentamos un método detallado para aislar hSVECs para estudiar la influencia del estrés mecánico hemodinámico en un fenotipo endotelial.

Por lo general, los CE adheridos se pueden observar 3-4 días después de la extracción. Los hSVEC inicialmente forman grupos de células y muestran una morfología típica de "adoquines" (Figura 1B). Expresan los marcadores CE CD31 (Figura 1C,D) y VE-cadherina (Figura 1D). Los hSVEC se pueden propagar fácilmente en una placa de cultivo celular tratado no recubierto, y conservan el fenotipo endotelial en cultivo hasta oc...

Describimos un protocolo para aislar y cultivar células endoteliales de venas safenas humanas (hSVECs). También proporcionamos métodos detallados para producir esfuerzo cortante y estiramiento para estudiar el estrés mecánico en hSVEC.

Aislamiento de células endoteliales de venas safenas humanas y exposición a niveles controlados de esfuerzo cortante y estiramiento

Coronary artery bypass graft (CABG) surgery is a procedure to revascularize ischemic myocardium. Saphenous vein remains used as a CABG conduit despite the ...

La vena safena se expone repentinamente a afecciones arteriales después de la cirugía de derivación de la arteria coronaria. Comprender su respuesta de adaptación al estrés mecánico puede ayudar a diseñar herramientas terapéuticas para prevenir el fracaso del injerto venoso. Este protocolo de aislamiento de células endoteliales es muy sencillo y sólo requiere incubación con colagenasa.Con una manipulación mínima de los vasos, esto reduce la contaminación con células musculares lisas y fibroblastos. El protocolo para aislar los SVEC humanos y cultivarlos bajo esfuerzo cortante y estiramiento cíclico es esencial para comprender la contribución de las fuerzas mecánicas en la disfunción de las células endoteliales asociadas con el fracaso del injerto de vena safena. El cultivo celular endotelial previo es muy exigente en términos de suplementos de medios celulares.Es obligatorio agregar factores de crecimiento para aislar con éxito un cultivo, los SVEC humanos. Para aislar células endoteliales primarias de la vena safena humana o SVEC humanas, recolecte al menos un segmento de vena safena de dos a tres centímetros de largo. Trabajando bajo una campana de flujo laminar estéril, transfiera el segmento de la vena a una placa de Petri llena de PBS precalentado.Para eliminar toda la sangre del interior de la luz, inserte una punta de pipeta unida a una pipeta y llénela con PBS en un extremo de la vena y enjuáguela suavemente. Enjuague hasta que el flujo de lavado se aclare por completo. Luego cierre un extremo de la vena con una sutura de algodón estéril.Llene cuidadosamente el vaso con un miligramo por mililitro de solución de colagenasa tipo 2 y cierre el otro extremo del recipiente con una sutura de algodón. Incubar el recipiente con solución de colagenasa en una atmósfera humidificada de 5% de dióxido de carbono a 37 grados centígrados durante una hora. Luego corte un extremo del recipiente sobre un tubo de 15 mililitros para recolectar la solución de colagenasa antes de cortar el otro extremo.Enjuague la superficie luminal con uno o dos mililitros de PBS para recoger todas las células endoteliales desprendidas dentro del tubo con colagenasa. Centrifugar el tubo a 400 g a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de retirar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet celular en tres o cuatro mililitros de medio celular endotelial completo que contenga una solución adicional de heparina.Coloque las células en una placa de cultivo celular de 60 milímetros pre-recubierta con 3% de peso por volumen de gelatina. Incubar las células en una atmósfera humidificada durante cuatro días sin cambiar el medio. Después de eso, cambie el medio cada dos días sin agregar la suplementación con heparina.Examine la placa bajo el microscopio para asegurarse de que se hayan eliminado los glóbulos rojos. Después de uno a cuatro días después de la extracción, dependiendo del tamaño y diámetro del segmento de la vena, visualice los SVEC humanos mediante microscopía de contraste de fase para evaluar el grado de confluencia y su morfología de adoquines. Continúe cambiando los medios cada dos días hasta que las células alcancen el 70% al 80% de confluencia.Cubra el portaobjetos de la cámara de flujo con 0,1% de peso por volumen de gelatina e incube durante al menos 30 minutos a 37 grados centígrados. Para equilibrar la unidad fluídica y el conjunto de perfusión estéril que tiene depósitos de 10 milímetros, incubarlos durante la noche en una atmósfera humidificada. Para el experimento de esfuerzo cortante, sembrar 200, 000 células endoteliales suspendidas en 100 microlitros de medio de cultivo en el portaobjetos de la cámara de flujo recubierta de gelatina.Para unir las células a la superficie de cultivo, incubar las células durante cuatro horas. Coloque el conjunto de perfusión en la unidad fluídica. Llene los depósitos y el conjunto de perfusión con aproximadamente 12 mililitros de medio celular endotelial completo precalentado.Retire las burbujas de aire del conjunto de perfusión para equilibrar el nivel de ambos depósitos a cinco mililitros. Coloque la unidad fluídica en el equipo de perfusión montado sin la corredera de la cámara en la incubadora y conecte su cable eléctrico a la bomba regulada por computadora. Al ejecutar el protocolo predefinido en el software de control de la bomba, elimine todas las burbujas de aire de los depósitos y del conjunto de perfusión.Tome la unidad fluídica con el conjunto de perfusión montado en la campana de flujo laminar y fije los portaobjetos que tienen una monocapa de celda de confluencia. Después de colocar toda la unidad con las guías en la incubadora, conecte su cable eléctrico a la bomba. En el software de control de la bomba, ajuste la configuración de la unidad fluídica seleccionando el tipo de portaobjetos y ajustando la viscosidad del medio.En los parámetros de flujo, introduzca el valor de esfuerzo cortante y establezca la duración del ciclo y el tipo de flujo. A continuación, haga clic en el botón de reproducción para iniciar el experimento. Recuerde mantener el portaobjetos con células tratadas con el mismo medio sin exposición al flujo como controles estáticos.Aplique lubricante a base de silicona en la parte superior y lateral de la estación de carga equibiaxial de 25 milímetros y 6 pocillos. Semilla 400, 000 células suspendidas en tres mililitros a cada pocillo de las placas de cultivo de fondo flexible de 6 pocillos recubiertas con colágeno uno. Incubar las células en aire humidificado hasta que alcancen el 100% de confluencia.Antes de comenzar el protocolo de estiramiento, lave las células una vez con PBS precalentado y agregue tres mililitros de medio de cultivo fresco por pocillo. Inserte la placa base con todas las estaciones de carga lubricadas en la incubadora y conecte adecuadamente el tubo con el equipo controlador del sistema de biorreactor de estiramiento de células de tensión. Fije cada placa de cultivo a una junta roja proporcionada por el sistema de biorreactor.Luego colóquelos en la placa base en la incubadora. Coloque las cuatro placas de cultivo en la placa base para lograr una carga de vacío y estiramiento adecuada. Encienda el equipo controlador y el sistema informático.Abra el software de control FlexCell y configure el régimen deseado, incluido el porcentaje de elongación, la forma de onda, la frecuencia y el tiempo. Guarde el régimen. Encienda el sistema de vacío, luego seleccione el régimen y haga clic en iniciar en la pantalla de la computadora para ejecutar el estiramiento.Compruebe que la membrana de silicona se está moviendo y estirando las células. Las células endoteliales adheridas se podían observar de 4 a 10 días después de la extracción. Inicialmente forman grupos de células que muestran una morfología típica de adoquines.Expresaron los marcadores CE CD31 y VE-cadherina. Los hSVEC cuando se cultivan bajo tensión de cizallamiento se alinean en la dirección del flujo. El esfuerzo cortante de 20 dinas por centímetro cuadrado durante 72 horas induce la expresión de genes mecanosensibles típicos, KLF2, KLF4 y NOS3, lo que indica la efectividad del estímulo de cizallamiento.El resultado del estiramiento cíclico dependió de la intensidad aplicada a los SVEC humanos. Las células bajo bajo estiramiento mostraron un patrón cortical de actina F similar a las células estáticas. Sin cambios en la liberación de óxido nítrico durante un máximo de 72 horas, nuestros niveles arteriales de estiramiento remodelaron el citoesqueleto de actina después de 24 horas y disminuyeron la liberación de NO después de 72 horas.Además de los estudios de estrés mecánico, los investigadores pueden usar las células aisladas para realizar varios métodos para ampliar el conocimiento de la función y disfunción de las células endoteliales. Siguiendo el protocolo demostrado, es posible estudiar cualquier otro tipo de células endoteliales bajo esfuerzo cortante y estiramiento.

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Investigación

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Medicine

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Este primer artículo se describe un procedimiento para aislar las células endoteliales humanas de las venas umbilicales y, a continuación se muestra cómo utilizar estas células para examinar la transmigración de neutrófilos bajo condiciones de flujo. Mediante el uso de una cámara de flujo de bajo volumen hecha de un polímero con las características ópticas de vidrio, en vivo de células de imagen fluorescente de poblaciones celulares raras también es posible.

Aislamiento de células endoteliales de vena umbilical y su uso en el Estudio de la transmigración de neutrófilos bajo condiciones de flujo

Cámaras de flujo de microfluidos grabadas por fotolitografía y fabricada a partir de PDMS se aplican para investigar los resultados funcionales asociados con la disfunción CE y la inflamación. En un experimento representativo, la capacidad de esfuerzo cortante diferencial para modular la adhesión celular monocítica a citoquina activado monocapas CE se demuestra.

On-Chip fenotipificación inflamatoria endotelial

Los mecanismos que conducen al desarrollo de hiperplasia de la íntima (IH) y la insuficiencia injerto de vena son aún poco conocidos. Este estudio describe un sistema ex vivo para perfundir venas humanos bajo flujo y presión controladas. Además, la eficiencia de refuerzo de malla externa para limitar el desarrollo de la IH se evaluó.

Procedimiento para safena humana Venas Ex Vivo Perfusión y refuerzo externo

Se conocen diferentes niveles y patrones de cizallamiento del fluido para modular la expresión génica endotelial, el fenotipo y la susceptibilidad a la enfermedad. Discutimos el ensamblaje y el uso de 'anillos de cizallamiento': un modelo que produce patrones de esfuerzo cortante unidireccionales y periódicos. Los anillos de cizallamiento son fáciles de ensamblar, económicos y pueden producir altos rendimientos de celda.

La Asamblea y la Aplicación de &#39;Shear Anillos&#39;: A Novel endotelial Modelo de Orbital, unidireccional y periódica flujo de fluido y la tensión de cizallamiento

Aquí, se presenta un flujo de trabajo para el análisis de expresión cultura y genes de células endoteliales bajo tensión de esquileo líquido. Incluido es un arreglo físico para simultáneamente y monitoreo de múltiples cámaras de flujo en un entorno controlado y el uso de un RNA de referencia exógena para PCR cuantitativa.

Análisis de expresión génica de las células endoteliales expuestas a estrés mediante múltiples cámaras de placas paralelas flujo del esquileo

El objetivo de este protocolo es describir una cámara de flujo de placa paralela modificada para su uso en la investigación de la activación en tiempo real de canales iónicos sensibles al mecano sensible por tensión de cizallamiento.

Grabaciones electrofisiológicas de corrientes de iones de una sola célula bajo estrés de cizallamiento bien definido

Este protocolo describe un método de recubrimiento para restringir el crecimiento de células endoteliales a una región específica de una placa de 6 pozos para la aplicación de esfuerzo de cizalladura utilizando el modelo de agitador orbital.

Segmentación Del Crecimiento De Las Células Endoteliales En Placas De 6 Pozos En Una Coctelera Orbital Para Estudios Mecanobiológicos

Aquí, establecemos un protocolo para visualizar y analizar simultáneamente múltiples complejos SMAD utilizando el ensayo de ligadura de proximidad (PLA) en células endoteliales expuestas a condiciones patológicas y fisiológicas de estrés por cizallamiento de fluidos.

Visualización y cuantificación de la señalización TGFβ/BMP/SMAD bajo diferentes condiciones de tensión por cizallamiento de fluidos mediante ensayo de ligadura de proximidad

Aquí, desarrollamos un modelo de órgano en un chip de células musculares lisas de la aorta humana para replicar la tensión biomecánica in vivo de las células del músculo liso en la pared aórtica humana.

Construcción de un modelo de órgano en un chip de células musculares lisas de la aorta humana para recapitular la tensión biomecánica en la pared aórtica

Aquí se describe un flujo de trabajo simple para diferenciar las células endoteliales de las células madre pluripotentes humanas, seguido de un protocolo detallado para su estimulación mecánica. Esto permite el estudio de la mecanobiología del desarrollo de las células endoteliales. Este enfoque es compatible con los ensayos posteriores de células vivas recogidas del chip de cultivo después de la estimulación mecánica.

In vitro Modelo de vaso humano fetal en chip para estudiar la mecanobiología del desarrollo

Aprende a aislar células endoteliales de venas safenas humanas y cultivarlas bajo esfuerzo cortante y estiramiento cíclico. Este método permite estudiar las respuestas mecánicas en biología vascular.

Aislamiento de células endoteliales de venas safenas humanas y exposición a niveles controlados de esfuerzo cortante y estiramiento (Video) | JoVE Journal

Aislamiento de células endoteliales de venas safenas humanas y exposición a niveles controlados de esfuerzo cortante y estiramiento

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