Name: Plataforma de impedancia eléctrica basada en células para evaluar los inhibidores del virus del Zika en tiempo real (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: Aprende a utilizar la impedancia eléctrica celular para evaluar inhibidores del virus Zika en tiempo real con células A549. Esta técnica no invasiva permite monitorear la replicación viral y determinar valores IC50 con precisión.

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Los autores agradecen a Clément Heymann y Gorrit Lootsma por la revisión del manuscrito. El estudio fue apoyado por subvenciones internas del Laboratorio de Virología y Quimioterapia (Rega Institute, KU Leuven).

Todos los pasos descritos se llevan a cabo en condiciones estériles en un gabinete de flujo laminar de un laboratorio de nivel 2 de Bioseguridad. Todos los virus usados se obtuvieron y utilizaron según lo aprobado, de acuerdo con las reglas de una junta de revisión institucional belga (Departement Leefmilieu, Natuur en Energie, protocolo SBB 219 2011/0011) y el Comité de Bioseguridad de KU Leuven.
1. Mantenimiento del cultivo celular
NOTA: Este protocolo se realiza con una selección de líneas celulares, pero, por supuesto, se puede adaptar a cualquier línea celular adherente, solo requiere optimización de la densidad de siembra celular.
<ol><li>Cultivar la línea celular de adenocarcinoma de pulmón humano A549, la línea celular de glioblastoma maligno humano U87 y las células de fibroblastos de pulmón embrionario humano HEL 299 en matraces de cultivo T75 a 37 °C y 5% deCO2 en una incubadora humidificada.</li>
	<li>Subcultivo de las células al 80%-95% de confluencia. Todos los reactivos deben estar a temperatura ambiente (RT) antes de cultivar las células.</li>
	<li>Retire el medio de cultivo acondicionado de las células. Use 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco para lavar la monocapa celular una vez.</li>
	<li>Distribuir 1 ml de ácido tripsina-etilendiaminotetraacético (EDTA) al 0,25% uniformemente sobre la monocapa celular. Luego, incubar hasta 3 minutos a 37 ° C hasta que las células comiencen a desprenderse.</li>
	<li>Agregue 9 ml de medio de crecimiento completo fresco (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles). Pipet suavemente hacia arriba y hacia abajo para resuspender las células.</li>
	<li>Transfiera el volumen deseado de suspensión celular a un nuevo matraz de cultivo T75 y añada un volumen adecuado de medio de cultivo fresco para obtener un volumen total de 15 ml. NOTA: Las líneas celulares in vitro utilizadas en este protocolo se subcultivan en diluciones 1:4 a 1:10, dependiendo de la línea celular específica, para permitir condiciones ideales de crecimiento. Los subcultivos se realizan cada 3-4 días, por lo que el volumen de suspensión celular deseado también puede variar según el número de días de incubación.</li>
</ol>2. Preparación de la placa CEI
<ol><li>Tome una placa de 96 pocillos con electrodos interdigitados (consulte la Tabla de materiales) y llene todos los pocillos con 100 μL de medio de cultivo de crecimiento.</li>
	<li>Llene los espacios entre los pozos con DPBS. NOTA: Esto se hace para reducir el efecto de borde debido a la evaporación que se observa al cultivar células en placas de 96 pocillos.</li>
	<li>Incubar la placa durante 4 h a 37 °C en una incubadora con 5% deCO2.</li>
</ol>3. Siembra de células
<ol><li>Separar las células del matraz de cultivo, como se describe en la sección 1, y resuspenderlas en un medio de crecimiento fresco en un tubo de 50 ml.</li>
	<li>Cuente el número de celdas viables utilizando el método de elección. NOTA: En el caso de las células A549, la viabilidad generalmente alcanza ~ 100%. Para determinar el número de células, utilizamos un sistema automatizado de análisis celular basado en la tinción de naranja de acridina / yoduro de propidio (ver Tabla de materiales). Otros métodos de conteo celular funcionan igual de bien.</li>
	<li>Resuspender las células en medio de crecimiento fresco para obtener la densidad celular deseada. En este estudio, la densidad óptima de células A549 es de 0,15 × 106 células (viables)/ml.</li>
	<li>Saque la placa de 96 pocillos con electrodos interdigitados de la incubadora y retire el medio con una pipeta multicanal.</li>
	<li>Dispensar 100 μL de la suspensión celular (correspondiente a 15 × 103 celdas en este caso) por pocillo en la placa de 96 pocillos.</li>
	<li>Permita que las células se equilibren durante 15 minutos a temperatura ambiente antes de colocarlas en el dispositivo CEI.</li>
</ol>4. Configuración y ejecución del ensayo CEI
<ol><li>Coloque la incubadora que alberga el soporte de placa del dispositivo CEI a 37 °C y 5%CO2.</li>
	<li>Coloque la placa de 96 pocillos en el dispositivo.</li>
	<li>Abra el software del dispositivo y configure un nuevo experimento haciendo clic en Configuración en el panel Recopilar datos. Espere a que la computadora portátil se conecte al dispositivo ECIS y configure la placa verificando las impedancias de los pocillos. Compruebe si todos los pozos están configurados correctamente, como lo indica un color verde. Si no es así, repita el paso 4.2 hasta que todos los pocillos estén verdes.</li>
	<li>En el panel Configuración de pozo, seleccione el tipo de matriz, según el material de cultivo utilizado.</li>
	<li>Seleccione el modo Frecuencia / Tiempo múltiple. NOTA: En este modo, el dispositivo mide los cambios de impedancia en un rango de frecuencias.</li>
	<li>Inicie la medición haciendo clic en Iniciar. NOTA: La impedancia en tiempo real se puede monitorear en la interfaz del software. Seleccione la frecuencia deseada que desea mostrar. En este ejemplo, se eligen 16 kHz.</li>
</ol>5. Preparación e incubación de compuestos
NOTA: Como ejemplo de un compuesto antiviral, se utiliza laberinthopeptin A1 (Ver Tabla de materiales). Dado que este protocolo se puede generalizar a todos los compuestos con actividad antiviral potencial, nos referimos a él como "el compuesto".
<ol><li>Permitir que el medio de cultivo celular completo sin la adición de suero bovino fetal (FBS) (denominado "tampón de ensayo") se equilibre en RT.</li>
	<li>Mantenga los compuestos en hielo.</li>
	<li>Preparar una dilución concentrada 10x de cada compuesto en medio de ensayo en tubos de polipropileno de 5 ml.</li>
	<li>Diluir en serie los compuestos en medio de ensayo en tubos de polipropileno de 5 ml para obtener las concentraciones deseadas de 10x.</li>
	<li>Pause el dispositivo CEI haciendo clic en Pausa en el panel Configuración de recopilación de datos. Espere a que se complete el punto de tiempo actual y saque la placa de 96 pocillos.</li>
	<li>Verificar la adherencia y la formación de monocapa de las células bajo un microscopio óptico.</li>
	<li>Retirar 20 μL de cada pocillo con una pipeta multicanal.</li>
	<li>Añadir 20 μL de solución compuesta o vehículo en los pocillos deseados. Prepare un diseño con las condiciones específicas para un pipeteo adecuado.</li>
	<li>Incubar la placa durante 15 min a 37 °C con 5% deCO2. NOTA: Se utiliza una incubadora de células normal para este paso de incubación en lugar de un dispositivo CEI. Los pozos de control celular (CC) son pozos tratados con vehículos.</li>
</ol>6. Preparación del virus e infección
<ol><li>Descongele un vial de cepas de virus. En este ejemplo, se utilizan ZIKV MR766 y ZIKV PRVABC59.</li>
	<li>Preparar diluciones de virus en el MOI deseado o diluciones en medio de ensayo en un tubo de polipropileno de 15 ml. NOTA: En este ejemplo representativo, se utilizan MOI 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001, 0.005 y 0.00005.</li>
	<li>Añadir 100 μL de dilución de virus en los pocillos asignados de la placa de 96 pocillos. Agregue medio de ensayo a los pocillos CC.</li>
	<li>Descontaminar los contenedores de virus empleados.</li>
	<li>Vuelva a colocar la placa en el dispositivo CEI y continúe las mediciones durante 6 días consecutivos haciendo clic en Reanudar experimento. NOTA: Los pocillos de control de virus (VC) son células infectadas tratadas con vehículos, mientras que en los pocillos CC, se agrega medio de ensayo en lugar de dilución del virus. Si se evalúa la citotoxicidad de los compuestos, añadir 100 μL de tampón de ensayo en lugar de dilución del virus.</li>
</ol>7. Análisis de datos
<ol><li>Finalice el experimento haciendo clic en Finalizar y agregue comentarios de resumen opcionales, como información sobre las condiciones experimentales específicas en la ventana que aparece. Haga clic en Aceptar cuando se complete la recopilación de datos.</li>
	<li>Seleccione la frecuencia deseada en el panel Gráfico donde se mide la mayor diferencia de impedancia entre CC y VC al final del experimento.<ol><li>Para determinar la mejor frecuencia, ejecute un experimento piloto con células no infectadas e infectadas y elija la frecuencia que, en el punto de tiempo donde la impedancia de las células infectadas ha caído a su nivel de referencia, conduce a la mayor diferencia de impedancia observada entre las células no infectadas e infectadas. En el caso de las células A549 infectadas con ZIKV, esto es 16 kHz.</li>
	</ol></li>
	<li>Para exportar todos los datos en formato de hoja de cálculo, asegúrese de que todos los pozos estén seleccionados en el panel Configuración de pozos y haga clic en Archivo | Exportar datos | Datos gráficos.</li>
	<li>Normalice los datos restando el valor promedio de impedancia VC medido al final del experimento de todos los puntos de datos y dividiéndolo por el valor promedio de impedancia CC del último punto de tiempo medido antes de la infección.</li>
	<li>Trazar los datos normalizados en función del tiempo para obtener gráficos de perfil CEI.</li>
	<li>Calcular el área normalizada bajo la curva (AUCn) de cada condición para determinar parámetros tales como concentraciones inhibitorias del 50% (IC50).</li>
	<li>Calcule otros parámetros útiles, como CIT50, para, por ejemplo, comparar la infectividad de varias cepas de virus.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores confirman que no existe conflicto de intereses.

Este artículo describe el uso del ensayo CEI en la investigación antiviral del ZIKV. El ensayo tiene el beneficio de la monitorización en tiempo real y, por lo tanto, se puede utilizar para evaluar la cinética de la infección por ZIKV y la inhibición antiviral con compuestos selectivos. Los datos obtenidos con este método permiten una observación objetiva y visual del CPE inducido por el virus y la potencia de un posible compuesto antiviral.
Dado que CEI es un método muy sensible, se debe tener mucho cuidado al realizar este ensayo celular. Es crucial que se realice un pipeteo preciso para evitar la variación del pipeteo tanto como sea posible. Además, otros factores que podrían influir en los resultados experimentales, como el número de células y el stock viral utilizado, deben mantenerse constantes entre las repeticiones del experimento. Estos son factores que influyen en gran medida en la cinética del crecimiento celular y la infección y, por lo tanto, podrían conducir a una variación en los valores calculados de CIT50 y / u otros parámetros.
Al realizar el ensayo CEI en presencia de compuestos antivirales (potenciales), es importante determinar si influyen en la impedancia de las células en ausencia de un virus. La técnica es tan sensible que los cambios de impedancia pueden medirse muy por debajo de las concentraciones citotóxicas del compuesto19.
Aunque solo se muestran datos de ZIKV en este artículo, el ensayo se puede aplicar fácilmente a otros virus citopatógenos (flavi), con un esfuerzo de optimización mínimo, como la determinación óptima de la frecuencia de monitoreo CEI. Las adaptaciones del ensayo CEI se han empleado con varios virus humanos y animales, como chikungunya, influenza A y herpesvirus humanos y equinos25,26,27,28. Aquí, también se utiliza como un método simple para la cuantificación de títulos virales o para la identificación de compuestos antivirales. Estos estudios utilizaron el análisis celular en tiempo real, un método alternativo de CEI.
El uso de la tecnología CEI se limita a los tipos de células adherentes, ya que el principio del ensayo se basa en las propiedades de las células adherentes para extenderse a través de los pozos embebidos con electrodos. Los recubrimientos superficiales de pozos, como la fibronectina, pueden usarse para mejorar la unión celular29. La metodología tiene algunos otros inconvenientes, el primero relacionado con su costo. Además de la inversión en el dispositivo de monitoreo CEI y el hardware y el software que lo acompañan, los consumibles también son algo caros. Además, dado que el protocolo requiere monitorear la infección viral durante varios días, se puede evaluar una placa de 96 pocillos por semana. Junto con el alto costo, esto limita el uso a configuraciones de bajo a medio rendimiento.
Debido a estos problemas de rendimiento, la tecnología no es adecuada para entornos de detección antiviral. Sin embargo, es muy atractivo en las fases experimentales iniciales, por ejemplo, cuando se evalúa la susceptibilidad celular para el estudio de la infección por ZIKV en un determinado entorno relacionado con la enfermedad. La tecnología también es útil con líneas celulares transfectadas o knockout para observar fácilmente los cambios en la cinética de la infección, por ejemplo, en presencia o ausencia de ciertos receptores de entrada. Esto es interesante cuando se investiga la participación de factores celulares en la infección por ZIKV. Además, en fases preclínicas posteriores, cuando se ha seleccionado un determinado candidato principal, el ensayo CEI se puede utilizar para una caracterización más profunda de un compuesto seleccionado. Los biosensores CEI también pueden modificarse inmovilizando ciertos elementos de biorreconocimiento, como anticuerpos específicos del virus, para la detección de virus18. En conjunto, esto resalta el uso versátil de CEI en un entorno virológico.

Los brotes del virus del Zika (ZIKV) están asociados con complicaciones graves de la enfermedad, como la microcefalia y el síndrome de Guillain-Barré 1,2,3. Aunque las epidemias futuras son plausibles debido a diversos factores de riesgo, como la propagación de la distribución de vectores de mosquitos y el aumento de la urbanización, hasta la fecha, ninguna vacuna o medicamento antiviral ha llegado al mercado 3,4. Por lo tanto, los métodos tradicionales de investigación del ZIKV deben complementarse con nuevas herramientas para estudiar este virus y sus posibles compuestos antivirales. La investigación antiviral a menudo se basa en ensayos fenotípicos, donde el punto final es la presencia de un parámetro específico, como la aparición de un efecto citopático inducido por virus (CPE) o la producción de una proteína inducida por virus en particular por medio de un gen informador 5,6,7. Sin embargo, estos métodos tienen lecturas de punto final, requieren mucha mano de obra y pueden requerir un análisis complejo. Por lo tanto, los métodos basados en la impedancia ofrecen una alternativa atractiva.
La impedancia eléctrica basada en células (CEI) se define como la resistencia al flujo de corriente de un electrodo a otro, causada por una capa celular adherente sembrada en pozos que contienen electrodos. La tecnología CEI establecida empleada en esta metodología es la detección de impedancia de sustrato celular eléctrico (ECIS), desarrollada originalmente por Giaever y Keese 8,9. Esto se utiliza en un amplio campo de dominios de investigación biológica, como metástasis del cáncer, toxicología y cicatrización de heridas10,11,12. Su principio se basa en un campo eléctrico que se genera mediante un barrido continuo de voltajes de corriente alterna (CA) en un rango de frecuencias13. Las células están expuestas a estos campos eléctricos no invasivos, y a intervalos predeterminados, se miden los cambios de impedancia causados por el crecimiento celular o cambios en la adherencia o morfología celular14. Además, la viabilidad celular alterada también conduce a cambios de impedancia, lo que hace que la tecnología sea una herramienta útil para monitorear la infección con virus citopatógenos15,16,17. Como los cambios morfológicos de la capa celular se detectarán en el rango de nanoescala, la tecnología ofrece una herramienta de detección altamente sensible. El ensayo CEI descrito en este artículo es un método fácil, no invasivo, en tiempo real y sin etiquetas para medir los cambios de impedancia de la capa celular a lo largo del tiempo.
Aunque el CEI no se ha utilizado para evaluar el curso de la infección por ZIKV o sus posibles antivirales, su uso como herramienta de diagnóstico se ha investigado antes delos 18 años. En un estudio reciente, el uso del ensayo CEI para determinar la actividad antiviral de varios inhibidores del ZIKV en células A549 fue validado por primera vez19. Este artículo de métodos describe este ensayo CEI con más detalle y lo expande a varias líneas celulares adherentes, así como a una variedad de cepas de ZIKV en varias multiplicidades de infección (MOI). De este modo, se demuestra el uso versátil de este método en la investigación antiviral de flavivirus. El método tiene el beneficio crucial del monitoreo celular en tiempo real, que permite la detección de puntos de tiempo de infección importantes y la actividad inhibidora dinámica de posibles compuestos antivirales. En conjunto, la tecnología CEI ofrece una herramienta poderosa y valiosa para complementar la gama actual de metodologías antivirales.

<table><tbody><tr><td>Células A549</td><td>American Type Culture Collection (ATCC)</td><td>CCL-185</td><td>Estas células se cultivan en MEM Rega-3 suplementado con 10% de FBS, 2 mM de L-glutamina, 0,075% de bicarbonato de sodio.</td></tr><tr><td>Tinción de naranja/yoduro de propidina</td><td>Logos</td><td>Biosystems F23001</td><td>Tinción viva/muerta</td></tr><tr><td>Tubos de polipropileno Cellstar, 15 mL</td><td>Greiner bio-one</td><td>1,88,271</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de polipropileno Cellstar, 50 mL</td><td>Greiner bio-one</td><td>2,27,261</td><td></td></tr><tr><td>Medio esencial modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>41965-039 Medio de</td><td>cultivo celular para U87 y células HEL 299</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS)</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>ECIS cultureware 96W20idf</td><td>Applied BioPhysics</td><td>96W20idf PET</td><td>Placa de ensayo para dispositivo CEI</td></tr><tr><td>Sensor de impedancia de sustrato de celda eléctrica (ECIS) Estación de matriz Z</td><td>Biofísica</td><td></td> <td>aplicadaDispositivo CEI, que incluye estación de 96 pocillos, módulo de control externo y computadora portátil con software de control, adquisición y visualización. El software necesario se instala antes del envío. NOTA: este dispositivo está actualmente fuera de producción y ha sido reemplazado por el dispositivo ECIS Z-Theta más avanzado</td></tr><tr><td>Tubos de poliestireno Falcon, 5 mL</td><td>Corning</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino (FBS)</td><td>Cytiva</td><td>SV30160.03</td><td>Aditivo de medio de cultivo celular para todas las células usadas</td></tr><tr><td>Células HEL 299</td><td>ATCC</td><td>CCL-137</td><td>Estas células se cultivan en DMEM suplementado con 10% de FBS y 0,01 M HEPES.</td></tr><tr><td>Tampón HEPES, 1 M</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>15630-056</td><td>Aditivo para medio de cultivo celular para células U87</td></tr><tr><td>Labyrinthopeptin A1</td><td>Amable regalo del Prof. Dr. Roderich S&uuml; ssmuth, Technische Universit&auml; t Berlín, Alemania</td><td></td><td>Compuesto antiviral utilizado como ejemplo en este protocolo. Se disuelve en DMSO.</td></tr><tr><td>L-glutamina, 200 mM</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-024</td><td>Aditivo para medio de cultivo celular para células A549</td></tr><tr><td>Portaobjetos de recuento de células Luna Logos</td><td>Biosystems</td><td>L12001</td><td></td></tr><tr><td>Luna-FL contador de células de doble fluorescencia</td><td>Logos Biosystems</td><td>L20001</td><td>Contador de viabilidad celular</td></tr><tr><td>Medio esencial mínimo Rega-3 (MEM Rega-3)</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>19993013</td><td>Medio de cultivo celular para células A549</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio, 7,5 %</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>25080-060</td><td>Aditivo para medio de cultivo celular para células A549</td></tr><tr><td>Matraz de cultivo de tejidos T75</td><td>TPP</td><td>Y9076</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA, 0,25 %</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>25200-056</td><td>Reactivo de disociación</td></tr><tr><td>U87</td><td>células ATCC</td><td>HTB-14</td><td>Estas células se cultivan en DMEM suplementado con un 10% de FBS y 0,01 M de HEPES.</td></tr><tr><td>&nbsp; Virkon Rely+On tabletas</td><td>Lanxess</td><td>115-0020</td><td>Solución desinfectante</td></tr> para el <tr><td>virus del Zika (ZIKV) MR766</td><td>ATCC</td><td>VR-84</td><td>Cepa prototipo de ZIKV, aislada de un mono centinela Rhesus en Uganda en 1968</td></tr><tr><td>ZIKV PRVABC59</td><td>ATCC</td><td>VR-1843</td><td>cepa de ZIKV aislada de un paciente en Puerto Rico en 2015</td></tr></tbody></table>

plataforma de impedancia eléctrica basada en células para evaluar los inhibidores del virus del zika en tiempo real

Cell-Based Electrical Impedance Platform to Evaluate Zika Virus Inhibitors in Real Time

La tecnología de impedancia eléctrica basada en células (CEI) mide los cambios en la impedancia causados por una monocapa celular adherente en crecimiento o manipulada en pocillos de placa de cultivo incrustados con electrodos. La tecnología se puede utilizar para monitorear las consecuencias de la infección por el virus Zika (ZIKV) y la replicación celular adherente en tiempo real, ya que este virus es altamente citopatogénico. Es un ensayo sencillo que no requiere el uso de etiquetas o métodos invasivos y tiene la ventaja de proporcionar datos en tiempo real. La cinética de la infección por ZIKV depende en gran medida de la línea celular empleada, la cepa del virus y la multiplicidad de la infección (MOI), que no se pueden estudiar fácilmente con ensayos de punto final convencionales. Además, el ensayo CEI también se puede utilizar para la evaluación y caracterización de compuestos antivirales, que también pueden tener propiedades inhibidoras dinámicas en el curso de la infección. Este artículo de métodos ofrece una explicación detallada de la ejecución práctica del ensayo CEI y sus posibles aplicaciones en la investigación del ZIKV y la investigación antiviral en general.

En este artículo, se describe en detalle el uso del ensayo CEI en la investigación del ZIKV. El flujo de trabajo de este ensayo se ilustra en la Figura 1. Demostramos la conveniencia del monitoreo en tiempo real de la infección por ZIKV en un tipo de célula deseado, así como la evaluación de la inhibición de la infección por un compuesto antiviral. Como ejemplo antiviral, utilizamos el bien descrito péptido laberinthopeptin A1 (Laby A1); Nos referimos a esto como "el compuesto", ya que sus propiedades específicas están más allá del alcance de este artículo de métodos y se discuten en otra parte20,21. Cabe destacar que la reproducibilidad del método no se discute en la sección de resultados, ya que queremos centrarnos en los perfiles de impedancia individuales obtenidos utilizando la metodología. Sin embargo, esto se ha descrito anteriormente19.
En el primer conjunto de experimentos, demostramos la importancia de la optimización de la densidad celular al realizar ensayos de infección CEI (Figura 2). Cuando se siembran demasiadas células, la monocapa celular habrá crecido completamente y no podrá propagarse más a través de los electrodos CEI. Esto conduce a una diferencia menor entre CC y VC, y por lo tanto una resolución más baja, disminuyendo la ventana de detección de la actividad antiviral. Esto está bien ejemplificado en la Figura 2E. Para ciertos tipos de células más grandes, como las células U87, sembrar células demasiado densamente podría incluso conducir a un desprendimiento completo de la monocapa celular al manipular la placa, como se demuestra aquí (Figura 2F). Esto también se observa microscópicamente.
La figura 2 también demuestra que el ensayo es muy útil para realizar estudios de susceptibilidad celular. De la figura 2A,B se desprende claramente que la cinética de infección depende en gran medida del tipo de célula. La Figura 2C demuestra que las células U87 solo son susceptibles a la infección por ZIKV a MOI altos.
En el segundo conjunto de experimentos, se destaca el uso versátil del ensayo de infección CEI utilizando varias cepas de ZIKV en diferentes MOI y en presencia de un compuesto antiviral bien descrito (Figura 3). Estos experimentos se realizan con células A549, un modelo comúnmente utilizado en la investigación de flavivirus22,23. Esta línea celular también ha sido utilizada en otros estudios que han demostrado su idoneidad en ensayos CEI24. En primer lugar, la cinética de infección por una cepa representativa del ZIKV del linaje africano MR766, se compara con la del linaje asiático PRVABC59. La Figura 3A demuestra que ambas cepas tienen patrones CEI comparables, con PRVABC59 con propiedades inductoras de CPE ligeramente más lentas. Esto también se refleja en los valores CIT50 (Figura 3B). Este interesante parámetro fue introducido por primera vez por Fang et al.16 y tiene en cuenta la cinética de las mediciones de CEI. Se define como el tiempo necesario para reducir la impedancia en un 50% en comparación con el control celular.
A continuación, las células se infectaron con tres MOI diferentes de ZIKV MR766 o PRVABC59, en presencia o ausencia de varias concentraciones de compuestos, y se monitorizaron los perfiles de impedancia. Como se puede observar en la figura 3C-H, ciertas concentraciones de compuestos inhiben o retrasan la caída de impedancia causada por la infección por ZIKV. Esto también se refleja cuando se calculan los valores AUC. Los resultados del ensayo CEI también demuestran visualmente que la actividad antiviral depende del MOI y del punto de tiempo de la evaluación de la potencia. Los cálculos de AUCn se pueden utilizar para determinar los valores de IC50, como se muestra en la Figura 3I. Finalmente, la Figura 3H muestra que los valores CIT50 también se pueden usar para determinar y comparar potencias compuestas. Los compuestos inactivos o las concentraciones de compuestos se caracterizan por perfiles CEI, AUC y valores CIT50 comparables a los de VC.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65149/65149fig01.jpg"> Figura 1: Descripción general esquemática del flujo de trabajo del ensayo. La línea de tiempo y los diferentes pasos de manejo e incubación del ensayo CEI se representan aquí. Abreviaturas: CEI = impedancia eléctrica basada en células; ZIKV = virus del Zika; D = días. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65149/65149fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65149/65149fig02.jpg"> Figura 2: Perfiles normalizados de CEI de células infectadas por ZIKV a diferentes densidades. (A,D) A549, (B,E) HEL 299, o (C,F) Las células U87 se sembraron en (A-C) 15,000-20,000 ("óptimas") o (D-F) 75,000 células ("subóptimas") por pocillo en una placa CEI de 96 pocillos. Después de 24 h de monitoreo de impedancia, las células se infectaron con diluciones MOI diez veces mayores de ZIKV MR766. La impedancia fue monitoreada adicionalmente durante 5 días consecutivos. Se muestran los perfiles CEI (media ± rango de dos réplicas técnicas) de un experimento representativo. Abreviaturas: CEI = impedancia eléctrica basada en células; MOI = multiplicidad de la infección; ZIKV = virus del Zika; Norma = normalizada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65149/65149fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65149/65149fig03.jpg"> Figura 3: Perfiles CEI normalizados de células A549 después de la infección con dos cepas de ZIKV e inhibición por un compuesto antiviral. (A) Las células A549 adherentes se infectaron con varios MOI de ZIKV MR766 o ZIKV PRVABC59, y la impedancia se monitoreó continuamente. Se muestra la media ± SD de tres réplicas técnicas de un experimento representativo. (B) Los valores CIT50 se calcularon sobre la base del perfil CEI de A y se compararon. Se muestra la media ± DE de tres réplicas técnicas realizadas. (C-H) Las células A549 adherentes fueron tratadas con varias concentraciones de compuestos y posteriormente infectadas con un MOI específico de ZIKV MR766 (C-E) o ZIKV PRVABC59 (F-H). La impedancia fue monitoreada continuamente. Se muestra la media ± rango de dos réplicas técnicas de un experimento representativo. (I) Para comparar la inhibición del compuesto contra diferentes cepas y diluciones del ZIKV, se calculó el AUC n y se determinaron los porcentajes inhibitorios restando todas las condiciones por el CC AUC n y dividiendo por el VC AUCn. (J) Los valores CIT50 del experimento mostrado en C-H se calcularon para comparar las diferentes cepas de ZIKV y MOI. Se muestra la media ± rango de dos réplicas técnicas. Abreviaturas: CEI = impedancia eléctrica basada en células; MOI = multiplicidad de la infección; ZIKV = virus del Zika; Norma = normalizada; CIT50 = tiempo en que la impedancia disminuyó en un 50% en relación con el control no tratado; AUC = área bajo la curva; CC = control celular; VC = control de virus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65149/65149fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aquí, demostramos el uso de la impedancia eléctrica basada en células (CEI) como un método muy fácil y directo para estudiar la infección y replicación del virus Zika en células humanas en tiempo real. Además, el ensayo CEI es útil para la evaluación de compuestos antivirales.

Plataforma de impedancia eléctrica basada en células para evaluar los inhibidores del virus del Zika en tiempo real

Cell-based electrical impedance (CEI)&#160;technology measures changes in impedance caused by a growing or manipulated adherent cell monolayer on culture ...

Las infecciones virales son altamente dinámicas, y los ensayos tradicionales de punto final en virología tienen la limitación de que un punto final elegido puede conducir a información perdida. La principal ventaja de esta técnica es que con la impedancia eléctrica basada en células, es posible seguir una infección viral y la actividad de los compuestos antivirales en tiempo real. Demostrando este procedimiento estará Eef Meyen, un técnico de laboratorio de nuestro laboratorio.Para comenzar, prepare la placa CEI tomando una placa de 96 pocillos basada en electrodos interdigitados. Agregue 100 microlitros de medio de cultivo de crecimiento a cada pozo y llene los espacios entre los pozos con DPBS. Luego, incubar la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante cuatro horas.Para sembrar las células A549, separarlas del matraz de cultivo como se describe en el manuscrito y resuspenderlas en un medio de crecimiento fresco. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 50 mililitros. Contar las células viables y diluirlas en un medio de crecimiento fresco para obtener la densidad celular deseada.Después de la incubación, retire el medio de cultivo de crecimiento con una pipeta multicanal de la placa de 96 pocillos. Dispensar 100 microlitros de suspensión celular por pocillo. Una vez que las células estén equilibradas, coloque la placa en el dispositivo CEI para configurar y realizar el ensayo CEI.Abra el software del dispositivo y, en el panel Recopilar datos, haga clic en Configuración para establecer un nuevo experimento. Conecte un ordenador portátil al dispositivo ECIS. Configure la placa comprobando las impedancias de los pozos como se indica con un color verde.En el panel Configuración de pozo, seleccione el tipo de matriz de acuerdo con el cultureware utilizado y haga clic en Modo de tiempo de frecuencia múltiple. A continuación, inicie la medición pulsando Inicio. Mantenga el compuesto en hielo.Haga la dilución concentrada 10 veces con un medio de ensayo equilibrado en un tubo de polipropileno de cinco mililitros y luego agregue el compuesto. En el panel Configuración de recopilación de datos, haga clic en Pausa y, después de completar el punto de tiempo actual, saque la placa de 96 pocillos. Observe la adherencia y la formación de monocapa de las células bajo un microscopio óptico.A continuación, aspire 20 microlitros de medio de cada pocillo utilizando una pipeta multicanal, y agregue 20 microlitros de solución compuesta o vehículo en los pocillos deseados. Incubar la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 15 minutos. Para preparar la solución de virus, descongele un vial de cepas de virus.Después de hacer diluciones en el MOI deseado con medio de ensayo en un tubo de polipropileno de 15 mililitros, agregue el stock de virus. Una vez que se agrega la dilución del virus en los pocillos asignados, agregue 100 microlitros de medio de ensayo a los pocillos de control celular. Luego, descontamine los contenedores de virus empleados.Vuelva a colocar la placa en el dispositivo CEI y haga clic en Reanudar para continuar con las mediciones durante seis días consecutivos. Para analizar los datos, haga clic en Finalizar para finalizar el experimento y agregar Introducir resumen del experimento. Una vez completada la recopilación de datos, seleccione Aceptar. Seleccione la frecuencia deseada en el panel Gráfico.Asegúrese de que todos los pozos estén seleccionados en el panel Configuración del pozo y haga clic en Archivo, luego en Exportar datos, seguido de Datos de gráficos para exportar los datos en formato de hoja de cálculo. El ensayo CEI mostró que la cinética de la infección dependía en gran medida del tipo de célula, y las células U87 solo eran susceptibles a la infección por el virus del Zika con MOI altos. Los ensayos CEI también demostraron una monocapa celular completamente desarrollada con una alta siembra celular y no puede propagarse más a través de los electrodos CEI, lo que lleva a una ligera diferencia entre el control celular y el control del virus.Para U87, un tipo de célula más grande, la siembra de células demasiado densamente podría haber llevado al desprendimiento completo de la monocapa celular. Una cepa representativa del virus Zika del MR766 africano en el linaje asiático PRVABC59 exhibió patrones CEI similares. Sin embargo, PRVABC59 tiene propiedades inductoras de efectos citopáticos ligeramente más lentas, también reflejadas por los valores de CIT50.Los perfiles de impedancia de tres MOI diferentes de ambas cepas del virus del Zika demostraron que la concentración particular del compuesto retrasó la caída de la impedancia causada por la infección por el virus del Zika. El ensayo CEI reveló que la actividad antiviral dependía de los cálculos de MOI y AUCN determinaron los valores de IC50. Los valores evaluados de CIT50 demostraron potencias compuestas en la cinética del crecimiento celular y la infección.CEI es una tecnología poderosa para evaluar y caracterizar compuestos contra la replicación del virus Zika en tiempo real, sin etiquetas y de manera no invasiva.

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Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

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En este video, demostramos el proceso de monitoreo en tiempo real de eventos celulares, incluida la proliferación de células adherentes, a través de un ensayo de impedancia celular. Aquí, las celdas adherentes actúan como aislantes, restringiendo el flujo de corriente entre los electrodos y aumentando la impedancia.

Análisis basado en impedancia celular para la monitorización de procesos celulares en tiempo real

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Virus Zika Sistema infecciosa cultivo celular y la<em&gt; In Vitro</em&gt; Profiláctica Efecto de los interferones

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El presente protocolo describe la propagación del virus del Zika (ZIKV) en células de riñón de mono verde africano Vero y la cuantificación del ZIKV utilizando métodos de inmunodetección colorimétrica basados en células en formatos de 24 y 96 pocillos (alto rendimiento).

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Monitorización de los cambios en las células endoteliales de la vena umbilical humana tras la infección viral mediante el análisis celular en tiempo real basado en la impedancia

El ensayo TCID50 aquí reportado utiliza mediciones de impedancia en tiempo real sin etiqueta y el módulo de Virología del sistema para monitorizar objetivamente los efectos citopáticos (CPE) inducidos por virus en tiempo real. Este ensayo simplificado reduce significativamente el tiempo de trabajo práctico, al tiempo que permite mediciones cuantitativas de CPE cinética de alto rendimiento y permite cálculos automatizados y en tiempo real de TCID50.

Un ensayo de dosis infecciosa de cultivo de tejidos (TCID50) en tiempo real y sin marcador, optimizado y sin marcador, utilizando impedancia para la cuantificación automatizada de títulos virales

Aprende a utilizar la impedancia eléctrica celular para evaluar inhibidores del virus Zika en tiempo real con células A549. Esta técnica no invasiva permite monitorear la replicación viral y determinar valores IC50 con precisión.

Plataforma de impedancia eléctrica basada en células para evaluar los inhibidores del virus del Zika en tiempo real

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