Soporte compuesto de matriz extracelular de microgel para la impresión 3D integrada de construcciones neuronales humanas
May 5th, 2023
Este trabajo describe un protocolo para la impresión 3D incrustada de forma libre de células madre neurales dentro de compuestos de matriz extracelular de partículas recibles autocurables. El protocolo permite el patrón programable de construcciones de tejido neural humano interconectadas con alta fidelidad.
La impresión 3D integrada dentro de los compuestos SHAPE supera las limitaciones tradicionales de biofabricación para permitir un patrón preciso de tejidos mecánicamente sensibles dentro de hidrogeles que se asemejan al entorno extracelular nativo. La caja de herramientas SHAPE se basa en el diseño modular de biomateriales, lo que permite cambios fáciles en la formulación del soporte de impresión. También aprovecha materiales de bajo costo y equipos accesibles para una simple adaptación por parte de otros grupos de investigación.
Este enfoque se puede aplicar para crear modelos de tejido neural humano definidos espacialmente para examinar el desarrollo neuronal y la comunicación en trastornos neurodegenerativos como el Parkinson. Comience preparando una solución de carbonato de calcio en agua ultrapura a una concentración de dos miligramos por mililitro. Mezclarlo con la solución de alginato en una proporción igual y removerlo magnéticamente a 650 RPM durante una hora a temperatura ambiente.
Luego agregue ácido acético a esta mezcla en una proporción de uno a 500 y revuelva nuevamente durante la noche. Al día siguiente, fragmente mecánicamente la solución de alginato gelatinado en micropartículas a 15, 000 RPM durante 10 minutos usando un homogeneizador. Luego centrifugar para obtener las micropartículas.
Deseche cuidadosamente el sobrenadante y resuspenda las partículas en el DMEM, que contiene dos hidróxido de sodio milimolar y estreptomicina al 1%. El color de la suspensión debe cambiar de nuevo a rojo. Incubar la suspensión durante la noche a cuatro grados centígrados.
Después de la incubación, homogeneice la suspensión durante tres minutos a 15, 000 RPM y centrifugar a 18, 500 G durante 10 minutos. Después de centrifugar, retire el sobrenadante y observe el pellet en busca de micropartículas de alginato apretadas. Para generar el compuesto SHAPE, mezcle el pellet de micropartículas de alginato con colágeno diluido y neutralizado en una proporción de dos a uno y pipetearlo hacia arriba y hacia abajo en hielo.
Transfiera el material compuesto generado a una placa enfriada de 24 pocillos. Antes de imprimir, disocie las células madre neurales humanas previamente cultivadas o hNSC utilizando una solución de tripsina al 0,025% durante cinco minutos a 37 grados centígrados. Luego neutralizar la tripsina con el medio de crecimiento y centrifugar la suspensión celular a 400 G durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Después de retirar el sobrenadante, resuspenda el pellet celular en dos o tres mililitros de medio de crecimiento. Usando una aguja de metal romo calibre 21, cargue 100 microlitros de micropartículas de alginato apretadas en la jeringa. Luego cargue la suspensión celular preparada en una jeringa.
Para imprimir, reemplace la aguja de carga con una aguja de metal romo de calibre 27. Usando el software de referencia, una vez que se diseña la estructura a imprimir, haga clic en generar para una generación de código G. Inserte la jeringa cargada con células en un cabezal de extrusión volumétrica en una bioimpresora basada en extrusión y registre la longitud de la aguja haciendo clic en iniciar el proceso de medición de la longitud de la aguja.
A continuación, coloque la placa de 24 pocillos cargada con el compuesto SHAPE en la impresora y haga clic en SHM para medir la altura de la superficie del pozo vacío. Seleccione pH 2 seguido del símbolo de llave inglesa. Luego, en el conjunto de parámetros, cambie el caudal volumétrico a 3.6 microlitros por segundo y presione Aplicar parámetro, seguido de Guardar y listo.
Cargue el código G en la interfaz de usuario de la impresora haciendo clic en un icono para abrir el código G. Seleccione el icono del programa de ejecución para iniciar el procedimiento de impresión. Inmediatamente después de imprimir, incubar el gel SHAPE a 37 grados centígrados durante 30 minutos para recocido.
A continuación, agregue suavemente el medio de crecimiento al soporte de gel SHAPE recocido. Para la inmunotinción, retire el exceso de medio del gel y, con una espátula, transfiera el gel a un recipiente que contenga DPBS. Una vez que la placa esté colocada en la campana extractora, retire el DPBS.
Cubra el gel con una solución de formaldehído al 4% e incube durante una hora a temperatura ambiente. Después de lavar con DPBS, agregue la solución de bloqueo al gel. Mece la placa suavemente e incuba durante seis horas a temperatura ambiente para evitar una unión inespecífica.
Una vez que se retire la solución de bloqueo, agregue el anticuerpo primario al gel y sacuda suavemente. Incubar el plato durante 48 horas a cuatro grados centígrados. Después del lavado DPBS, trate de manera similar el gel con la solución de anticuerpos secundarios durante 24 horas.
Coloque el gel teñido con una espátula en una placa de pocillo con un fondo de imagen delgado antes de obtener imágenes. En el presente estudio, la tinta hNSC imprimió un filamento de células con un diámetro de alrededor de 200 micrómetros. Las hebras impresas eran ricas en células viables con morfología alrededor.
Después de 30 días de impresión, las células exhibieron morfología neural con cuerpos celulares pequeños y procesos largos y delgados, lo que indicó la diferenciación exitosa de hNSC. La tinción con tubulina beta tres permitió la visualización de las redes neuronales generadas con geometría mantenida. Y durante el proceso de diferenciación, las células no migraron fuera de las hebras impresas.
El compuesto SHAPE se puede utilizar para producir canales perfusibles imprimiendo tinta de sacrificio en lugar de celdas. Además, el soporte puede incluir perlas sensibles al oxígeno para monitorear la tensión de oxígeno en estructuras impresas en 3D a lo largo del tiempo y el espacio.
Visión general
Este trabajo describe un protocolo para la impresión 3D integrada de células madre neurales dentro de compuestos de partículas y matriz extracelular anealables y de auto-reparación. Este método permite el modelado programable de construcciones de tejido neural humano interconectadas con alta fidelidad.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biofabricación
- Ingeniería de tejidos
Antecedentes
- Los métodos tradicionales de biofabricación enfrentan limitaciones para crear tejidos mecánicamente sensibles.
- Los compuestos SHAPE proporcionan un entorno extracelular nativo para el desarrollo de tejidos.
- El diseño modular de biomateriales permite una fácil adaptación y cambios en la formulación.
- Los materiales de bajo costo y el equipo accesible facilitan aplicaciones de investigación más amplias.
Propósito del estudio
- Desarrollar un protocolo para el modelado preciso de modelos de tejido neural.
- Examinar el desarrollo neuronal y la comunicación en trastornos neurodegenerativos.
- Proporcionar un marco para que otros grupos de investigación repliquen y adapten el método.
Métodos utilizados
- Preparación de solución de carbonato de calcio en agua ultrapura.
- Mezcla con solución de alginato en una proporción específica.
- Agitación magnética a velocidad y temperatura controladas.
- Utilización de compuestos SHAPE para la impresión 3D integrada.
Resultados principales
- Creación exitosa de modelos de tejido neural humano espacialmente definidos.
- Capacidad demostrada para modelar tejidos con alta fidelidad.
- Aplicaciones potenciales en el estudio de trastornos neurodegenerativos.
- Adaptabilidad del protocolo para varios entornos de investigación.
Conclusiones
- El protocolo mejora las capacidades de la biofabricación en neurociencia.
- Proporciona una herramienta valiosa para investigar interacciones neuronales.
- La investigación futura puede basarse en este método para explorar varias condiciones neurológicas.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Embedded 3D printing of human neural constructs within SHAPE composites addresses a critical gap in modeling neurodegenerative diseases by providing a tunable, ECM-mimetic environment that supports long-term culture and functional maturation. This approach enables biopharma R&D to generate reproducible, human-relevant neural tissue models for target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The modular, low-cost design supports scalable adoption across discovery workflows for Parkinson’s and related disorders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in human-derived neural tissue with preserved architecture and viability.
- Operational Value: Supports biological de-risking by maintaining printed cell localization and differentiation over extended culture periods.
- Predictive Value: Facilitates assessment of target engagement in spatially defined neural networks relevant to disease mechanisms.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Provides a standardized, reproducible support medium for long-term culture and quantitative imaging of neural constructs.
- Scalability: Uses accessible equipment and low-cost materials to enable platform reuse across multiple compound screening campaigns.
- Quantitative Output: Allows live-cell fluorescence and immunocytochemistry readouts to measure differentiation, axonal outgrowth, and network formation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Generates human neural tissue models applicable to studying neuronal development and communication in neurodegenerative disorders like Parkinson’s.
- Translational Continuity: Supports progression from discovery to preclinical validation by maintaining construct geometry and enabling functional readouts over weeks.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions through observable differentiation and network formation without cell migration from printed strands.
Pipeline & Workflow Integration
The SHAPE composite method integrates into the discovery continuum by enabling early-stage hypothesis testing in human neural models, supporting assay development for compound evaluation, and providing translational readouts that bridge to preclinical assessment.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by allowing precise patterning and long-term culture of human neural stem cells to study differentiation and network formation.
- Screening: Enables standardized, reproducible construct generation for compound exposure and functional readout via imaging and staining.
- Analytics: Delivers quantitative, spatially resolved data through live-cell imaging and immunocytochemistry to compare conditions and assess target modulation.
- Translational Research: Maintains construct integrity and supports axonal outgrowth, providing a disease-relevant system for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Leverages modular design and low-cost materials to allow adaptation across research groups and iterative use in discovery pipelines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by providing a tunable, ECM-like microenvironment that supports neural differentiation and network formation.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through self-healing, annealable support media and accessible fabrication protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by reducing reliance on complex systems and enabling broad adoption across discovery teams.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through observable, long-term neural maturation and network stability in printed constructs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in biomaterial preparation, particle generation, and sterile tissue culture techniques.
- Depends on access to homogenizers, centrifuges, bioprinters, and standard imaging and immunostaining equipment.
- Necessitates cross-team standardization of SHAPE composite formulation and printing parameters for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when extending to other cell types or ECM components beyond alginate and collagen.
- Includes practical limitations such as the need for precise particle sizing and annealing timing to maintain support fidelity during printing.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:46
Self Healing Annealable Particle: Extracellular Matrix (SHAPE) Composite Preparation
2:40
Human Neural Stem Cell (hNSC) Bioink Preparation and Embedded 3D Printing
6:19
Results: Characterization of 3D Printed Human Neural Construct
7:11
Conclusion
