Name: Un protocolo eficiente para el análisis CUT and RUN de células satélite de ratón aisladas de FACS (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-07T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Aprende el protocolo CUT&RUN para analizar células satélite de músculo esquelético de ratón aisladas mediante FACS. Este método permite estudiar la regulación de la transcripción y el reclutamiento de factores en cromatina in vivo.

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Agradecemos a Anastasia Bannwarth por brindar una excelente asistencia técnica. Agradecemos a las instalaciones del IGBMC, al cultivo celular, al Instituto Clínico del Ratón (ICS, Illkirch, Francia), a las imágenes, a la microscopía electrónica, a la citometría de flujo y a la plataforma GenomEast, miembro del consorcio 'France Génomique' (ANR-10-INBS-0009).
Este trabajo del Instituto Temático Interdisciplinario IMCBio, en el marco del programa ITI 2021-2028 de la Universidad de Estrasburgo, el CNRS y el Inserm, contó con el apoyo de IdEx Unistra (ANR-10-IDEX-0002) y del proyecto SFRI-STRAT'US (ANR 20-SFRI-0012) y EUR IMCBio (ANR-17-EURE-0023) en el marco del Programa Francés de Inversiones para el Futuro. El INSERM, el CNRS, Unistra, el IGBMC, la Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE11-0009, AR2GR), el programa estratégico AFM-Téléthon 24376 (a D.D.), INSERM recibió una beca para jóvenes investigadores (a D.D.), ANR-10-LABX-0030-INRT y un fondo estatal francés gestionado por la ANR en el marco del programa marco Investissements d'Avenir (ANR-10-IDEX-0002-02). J.R. contó con el apoyo del Programa CDFA-07-22 de la Université franco-allemande y el Ministère de l'Enseignement Supérieur de la Recherche et de l'Innovation, y K.G. de la Association pour la Recherche à l'IGBMC (ARI).

Aislamiento de células satélite a partir de músculos de extremidades de ratón y análisis de citometría de flujo

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<li>Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repairing+skeletal+muscle%3A+regenerative+potential+of+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).</li>
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<li>Kuang, S., Gillespie, M. A., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche+regulation+of+muscle+satellite+cell+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Niche regulation of muscle satellite cell self-renewal and differentiation.</a> Cell Stem Cell. 2 (1), 22-31 (2008).</li>
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<li>Gunther, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myf5-positive+satellite+cells+contribute+to+Pax7-dependent+long-term+maintenance+of+adult+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Myf5-positive satellite cells contribute to Pax7-dependent long-term maintenance of adult muscle stem cells.</a> Cell Stem Cell. 13 (5), 590-601 (2013).</li>
<li>Donlin, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+high-dimensional+analysis+of+cells+dissociated+from+cryopreserved+synovial+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Methods for high-dimensional analysis of cells dissociated from cryopreserved synovial tissue.</a> Arthritis Research & Therapy. 20 (1), 139(2018).</li>
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<li>Park, J. Y., Chung, H., Choi, Y., Park, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotype+and+tissue+residency+of+lymphocytes+in+the+murine+oral+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Phenotype and tissue residency of lymphocytes in the murine oral mucosa.</a> Frontiers in Immunology. 8, 250(2017).</li>
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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

El presente estudio reporta un método estandarizado, confiable y fácil de realizar para el aislamiento y cultivo de células satélite de ratón, así como la evaluación de la regulación transcripcional por el método CUT&RUN.
Este protocolo implica varios pasos críticos. La primera es la disrupción muscular y la digestión de la fibra para garantizar un alto número de células recolectadas. A pesar del aumento de la concentración de enzimas, se obtuvieron más células vivas que utilizando el Protocol...

Los músculos estriados esqueléticos representan en promedio el 40% del peso total del cuerpo humano1. Las fibras musculares exhiben una notable capacidad de regeneración ante una lesión, que se describe por la fusión de miocitos recién formados y la generación de nuevas miofibras que reemplazan a las dañadas2. En 1961, Alexander Mauro reportó una población de células mononucleares a las que denominó células satélite3. Estas células madre expresan el factor de transcripción pareado box 7 (PAX7), y se localizan entre la lámina basal y el sarcolema de las fibras musculares4. Se informó que expresan el grupo de diferenciación 34 (CD34; un marcador hematopoyético, progenitor endotelial y de células madre mesenquimales), la integrina alfa 7 (ITGA7; un marcador del músculo liso, cardíaco y esquelético), así como el receptor de quimiocinas C-X-C tipo 4 (CXCR4; un marcador linfocítico, hematopoyético y de células satélite)5. En condiciones basales, las células satélite residen en un microambiente particular que las mantiene en un estado de reposo6. Tras el daño muscular, se activan, proliferan y sufren miogénesis7. Sin embargo, al contribuir solo a una pequeña fracción del número total de células musculares, sus análisis de todo el genoma son particularmente desafiantes, especialmente en entornos fisiológicos (<1% del total de células).
Se han descrito varios métodos para el aislamiento de la cromatina a partir de células satélite, que implican la inmunoprecipitación de la cromatina seguida de la secuenciación paralela masiva (ChIP-seq) o los experimentos de escisión bajo objetivos y etiquetado (CUT&Tag). Sin embargo, estas dos técnicas presentan algunas limitaciones significativas que permanecen incuestionables. De hecho, ChIP-seq requiere una gran cantidad de material de partida para generar suficiente cromatina, una gran parte de la cual se pierde durante la etapa de sonicación. CUT&Tag es más apropiado para un número bajo de células, pero genera más sitios de escisión fuera del objetivo que ChIP-seq debido a la actividad de la transposasa Tn5. Además, dado que esta enzima tiene una alta afinidad por las regiones de cromatina abierta, el enfoque CUT&Tag podría utilizarse preferentemente para analizar las modificaciones de histonas o los factores de transcripción asociados con regiones del genoma transcritas activamente, en lugar de la heterocromatina silenciada 8,9.
A continuación se presenta un protocolo detallado que permite el aislamiento de células satélite de músculo de extremidades de ratón mediante FACS para su escisión bajo dianas y su liberación mediante el análisis de nucleasa (CUT&RUN)10,11. Los diversos pasos implican la alteración mecánica del tejido, la clasificación celular y el aislamiento de núcleos. La eficacia del método, en cuanto a la preparación de una suspensión celular viable, se demostró mediante la realización de análisis CUT&RUN para modificaciones covalentes de histonas y factores de transcripción. La calidad de las células aisladas hace que el método descrito sea particularmente atractivo para preparar cromatina que capture fielmente el estado de ocupación genómica nativa, y es probable que sea adecuado para capturar la conformación cromosómica en combinación con la secuenciación de alto rendimiento en loci específicos (4C-seq) o a niveles de todo el genoma (Hi-C).

<table><tbody><tr><td>Microtubo de 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>2080422</td><td></td></tr><tr><td>microtubo de 2 ml</td><td>Star Lab</td><td>S1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 5 ml</td><td>CORNING-FALCON</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 50 ml</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>anti-AR</td><td>abcam</td><td>ab108341</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD11b</td><td>eBioscience</td><td>25-0112-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD31</td><td>eBioscience</td><td>12-0311-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD34</td><td>eBioscience</td><td>48-0341-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45</td><td>eBioscience</td><td>12-0451-83</td><td></td></tr><tr><td>anti-CXCR4</td><td>eBioscience</td><td>17-9991-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-DMD</td><td>abcam</td><td>ab15277</td><td></td></tr><tr><td>anti-H3K27ac</td><td>Active Motif</td><td>39133</td><td></td></tr><tr><td>anti-H3K4me2</td><td>Active Motif</td><td>39141</td><td></td></tr><tr><td>anti-ITGA7</td><td>MBL</td><td>k0046-4</td><td></td></tr><tr><td>anti-PAX7</td><td>DSHB</td><td>AB_528428</td><td></td></tr><tr><td>anti-TER119</td><td>BD Pharmingen TM</td><td>553673</td><td></td></tr><tr><td>Beads</td><td>Polysciences</td><td>86057-3</td><td>BioMag&reg; Plus Concanavalin</td></tr><tr><td>A Colador de Células 100 &micro; m</td><td>Corning&reg; &nbsp;</td><td></td><td></td>431752</tr><tr><td>Filtro de Células 40 &micro; m</td><td>Corning&reg; &nbsp;</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de Células 70 &micro; m</td><td>Corning&reg; &nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga 431751 1 Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>521-0011</td><td>Centrífuga 5415 R</td></tr><tr><td>Centrífuga 2</td><td>Centrífuga 5805000010 Eppendorf</td><td></td><td>5804 R</td></tr><tr><td>Sistema de corredera de cámara&nbsp;</td><td>Sistema ThermoFischer</td><td>171080</td>;<td> me Nunc&trade; Lab-Tek&trade; </td></tr><tr><td>Agente de limpieza de</td> portaobjetos <td>de cámara Sigma&nbsp; &nbsp;</td><td>SLBQ7780V</td><td>RNasaZAPTM</td></tr><tr><td>Colgenasa, tipo I&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>17100017</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>Distribución</td><td>STEMCELL technologies</td><td>7913</td><td>5 U/mL</td></tr><tr><td>DynaMag&trade;-2 Aimant</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Tinción de viabilidad fijable</td><td>BD Biosciences</td><td>565388</td><td></td></tr><tr><td>Citómetro de flujo</td><td>BD FACSAria&trade; Citómetro de flujo</td><td>de fusión 23-14816-01</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount G con DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>00-4959-52</td><td></td></tr><tr><td>Navegador del genoma</td><td>IGV</td><td></td><td>http://software.broadinstitute.org/software/igv/</td></tr> <tr><td>Glicerol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Hidrogel</td><td>Corning&reg; &nbsp;</td><td>354277</td><td>Matrigel hESC Matriz calificada</td></tr><tr><td>Software de procesamiento de imágenes</td><td>Image J&reg;</td><td></td><td>V 1.8.0</td></tr><tr><td>Película</td><td>de laboratorio Sigma-Aldrich</td><td>P7793-1EA</td><td>PARAFILM&reg; M</td></tr><tr><td>Liberase LT</td><td>Roche</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>Galato de propilo</td><td>Secuenciador Sigma-Aldrich</td><td>2370</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Illumina Hiseq 4000</td><td>SY-401-4001</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua agitada</td><td>Bioblock Scientific polytest 20</td><td>18724</td><td></td></tr></tbody></table>

un protocolo eficiente para el análisis cut&amp;run de células satélite de ratón aisladas de facs

An Efficient Protocol for CUT&amp;RUN Analysis of FACS-Isolated Mouse Satellite Cells

Los análisis de todo el genoma con poblaciones de células pequeñas son una limitación importante para los estudios, particularmente en el campo de las células madre. En este trabajo se describe un protocolo eficiente para el aislamiento de células satélite del músculo de la extremidad, un tejido con un alto contenido de proteínas estructurales. Los músculos disecados de las extremidades de ratones adultos se interrumpieron mecánicamente mediante la picadura en medio suplementado con dispasa y colagenasa tipo I. Tras la digestión, el homogeneizado se filtró a través de filtros celulares y las células se suspendieron en tampón FACS. La viabilidad se determinó con tinción de viabilidad fijable y las células satélite inmunoteñidas se aislaron mediante FACS. Las células se lisaron con Triton X-100 y los núcleos liberados se unieron a perlas magnéticas de concanavalina A. Los complejos núcleo/perla se incubaron con anticuerpos contra el factor de transcripción o las modificaciones de histonas de interés. Después de los lavados, los complejos núcleo/perlas se incubaron con la proteína A-microcócica nucleasa y se inició la escisión de la cromatina con CaCl2. Después de la extracción del ADN, se generaron y secuenciaron bibliotecas, y se obtuvieron los perfiles de unión al factor de transcripción de todo el genoma y modificaciones de histonas covalentes mediante análisis bioinformático. Los picos obtenidos para las diversas marcas de histonas mostraron que los eventos de unión eran específicos para las células satélite. Además, el análisis de motivos conocidos reveló que el factor de transcripción estaba unido a la cromatina a través de su elemento de respuesta afín. Por lo tanto, este protocolo está adaptado para estudiar la regulación génica en células satélite musculares de extremidades de ratones adultos.

Las células satélite de los músculos esqueléticos de ratón se aislaron combinando los protocolos de Gunther et al. (en adelante Protocolo 1)12 y de Liu et al.23 (en adelante Protocolo 2). Dado que se observaron fibras musculares no digeridas después de la digestión cuando se utilizó la concentración de colagenasa y dispasa propuesta en el Protocolo 1, se aumentó la cantidad de enzimas para mejorar la disociación de las fibras musculares, como se describe en los pasos 1.2.1 ...

Se presenta aquí un protocolo eficiente para el aislamiento de células satélite de músculo de extremidades de ratón con aislamiento de células satélite de células satélite de células satélite de músculo de extremidades de ratón adaptado al estudio de la regulación de la transcripción en fibras musculares por escisión bajo dianas y liberación mediante nucleasa (CUT&RUN).

Un protocolo eficiente para el análisis CUT&amp;RUN de células satélite de ratón aisladas de FACS

Genome-wide analyses with small cell populations are a major constraint for studies, particularly in the stem cell field. This work describes an efficient ...

Desde hace más de 20 años, nuestro laboratorio está interesado en el papel fisiopatológico de los receptores nucleares. Para descifrar su función in vivo, diseñamos un modelo de ratón que permite el control espacial y temporal de su expresión. Paralelamente, desarrollamos técnicas de vanguardia para investigar su función molecular en los tejidos de ratón.Nuestro interés científico nos ha llevado recientemente a determinar la señalización de los secosteroides y de los receptores de esteroides en varios tejidos, incluido el músculo esquelético. Recientemente hemos demostrado que el receptor de andrógenos en las miofibras que diferencian las células del músculo esquelético es fundamental en sus funciones contráctiles y metabólicas. Nuestros hallazgos recientes brindan una comprensión más profunda de la dinámica fisiopatológica del músculo esquelético que es crucial para desarrollar tratamientos efectivos para los trastornos asociados a los músculos.Desarrollamos este protocolo para poder realizar análisis de cistroma en células madre musculares in vivo. Todos los protocolos anteriores utilizaron modales in vitro, lo que disocia completamente la investigación del contexto de un organismo completo. Además de ser de bajo costo y eficiente en el tiempo, este protocolo proporciona un entorno experimental eficaz para estudiar el reclutamiento de factores de transcripción y el panorama de la cromatina en las células progenitoras del músculo esquelético.La cromatina preparada por este protocolo ha proporcionado el primer análisis de todo el genoma del cistromo AR en células satélite, y facilitará futuros estudios sobre la regulación génica. Entre muchos, nuestro objetivo futuro sería extender estas investigaciones a otros receptores oxoesteroides y explorar sus correguladores específicos en los diversos tipos celulares involucrados en el proceso de regeneración en el músculo esquelético.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

El aislamiento y cultivo de una población pura de células satélite quiescentes, una población de células madre de músculo, es esencial para la comprensión de la biología de células madre del músculo y la regeneración, así como el trasplante de células madre para terapias en la distrofia muscular y otras enfermedades degenerativas.

Aislamiento, cultivo y trasplante de células musculares satélite

Se pueden aislar del corazón cardiomiocitos individuales de ratones de tipo salvaje y mutantes para estudiar su contractilidad y transitorios de calcio. Esto permite caracterizar la contribución de la disfunción celular a la disfunción cardíaca por cualquier causa.

Aislamiento y fisiológica Análisis de Ratón cardiomiocitos

El comportamiento de los fibroblastos subyace en un espectro de entidades clínicas, pero siguen estando mal caracterizadas, en gran parte debido a su heterogeneidad inherente. La investigación tradicional de fibroblastos se basa en la manipulación in vitro, enmascarando el comportamiento de los fibroblastos in vivo. Describimos un protocolo basado en FACS para el aislamiento de fibroblastos de piel de ratón que no requiere cultivo celular.

Murino fibroblastos dérmicos aislamiento por FACS

Los modelos de ratón permiten estudiar los mecanismos clave de la arritmogénesis. Para este propósito, los cardiomiocitos de alta calidad son necesarios para realizar mediciones de parche y pinza. Aquí, se describe un método para aislar miocitos aurinos y ventriculares a través de la perfusión de Langendorff retrógrada basada en enzimas, que permite mediciones simultáneas de transitorios de calcio y corriente de calcio de tipo L.

Aislamiento de miocitos aurículas y ventriculares murinas de alta calidad para mediciones simultáneas de transitorios de Ca2+ y corriente de calcio tipo L

El método presentado aquí resume los protocolos optimizados para evaluar la bioenergética celular en células madre hematopoyéticas de ratón no adherentes y células progenitoras primitivas (HSPC) utilizando el analizador de flujo extracelular para medir la tasa de acidificación extracelular (ECAR) y la tasa de consumo de oxígeno (OCR) de los HSPC en tiempo real.

Evaluación de la bioenergética celular en células madre hematopoyéticas de ratón y células progenitoras primitivas utilizando el analizador de flujo extracelular

CUT&amp;RUN y sus variantes se pueden utilizar para determinar la ocupación de proteínas en la cromatina. Este protocolo describe cómo determinar la localización de proteínas en la cromatina utilizando uliCUT&amp;RUN unicelular.

Localización de factor de una sola célula en cromatina utilizando escisión de entrada ultra baja bajo objetivos y liberación con nucleasa

La identificación precisa de las células progenitoras fibroadipogénicas (FAP) y las células madre musculares (MuSC) es fundamental para estudiar su función biológica en condiciones fisiológicas y patológicas. Este protocolo proporciona pautas para el aislamiento, purificación y cultivo de FAP y MuSC de músculos de ratones adultos.

FACS-aislamiento y cultivo de progenitores fibroadipogénicos y células madre musculares a partir de músculo esquelético de ratón imperturbable y lesionado

Los investigadores nuevos en el campo de la epigenética encontrarán en CUT&amp;Tag una alternativa significativamente más fácil que los ensayos ChIP. CUT&amp;Tag ha beneficiado enormemente a los estudios epigenéticos en poblaciones de células raras y primarias, generando datos de alta calidad a partir de muy pocas células. Este protocolo describe la realización de ensayos H3K4me1 CUT&amp;Tag en mioblastos de ratón aislados de músculos de las extremidades posteriores de ratón.

Uso del ensayo de escisión bajo objetivos y etiquetado (CUT&#38;Tag) en la investigación de mioblastos de ratón

Este protocolo describe un ensayo extracromosómico de unión de extremos no homólogos (NHEJ) y un ensayo de recombinación homóloga (HR) para cuantificar la eficiencia de NHEJ y HR en células HEK-293T.

Análisis de la unión de extremos no homólogos y la eficiencia de recombinación homóloga en células HEK-293T utilizando sistemas reporteros basados en GFP

Para obtener pericitos corticales cerebrales de ratón que cumplan con las demandas del scRNA-seq, presentamos un protocolo FACS críticamente optimizado basado en la selección CD13⁺/CD31⁻. Nuestros refinamientos clave mejoran significativamente la viabilidad celular y la integridad del ARN, permitiendo un perfil transcriptómico fiable.

Aislamiento de pericitos de tejido cortical de ratón usando FACS para secuenciación unicelular

Este protocolo proporciona un método estandarizado para aislar y enriquecer mioblastos primarios del músculo óseo de ratón adulto y neonatal mediante disociación tisular, filtración secuencial, pre-placado y condiciones definidas de cultivo, permitiendo el establecimiento y mantenimiento de cultivos de mioblastos derivados de células satélite para aplicaciones experimentales posteriores.

Aislamiento de células satélite del músculo esquelético para estudios in vitro de miogénesis

Aprende el protocolo CUT&RUN para analizar células satélite de músculo esquelético de ratón aisladas mediante FACS. Este método permite estudiar la regulación de la transcripción y el reclutamiento de factores en cromatina in vivo.

Un protocolo eficiente para el análisis CUT&RUN de células satélite de ratón aisladas de FACS

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