In vivo Imágenes de todo el cerebro de larvas de pez cebra usando microscopía de fluorescencia tridimensional
28 de abril de 2023
Aquí se presenta un protocolo para obtener imágenes in vivo de todo el cerebro de larvas de pez cebra utilizando microscopía de fluorescencia tridimensional. El procedimiento experimental incluye la preparación de muestras, la adquisición de imágenes y la visualización.
Estamos desarrollando sistemas inmunes ópticos y algoritmos computacionales para registrar y analizar la neuroactividad de todo el cerebro con una alta resolución espacial y temporal. El pez de laboratorio es un animal modelo ideal para la investigación. Gracias a cada transparencia óptica y la disponibilidad de diversas herramientas genéticas, la calidad óptica de la imagen puede degradarse debido a la aberración introducida por el gel de agarosa utilizado para el montaje de muestras, y los peces pueden moverse durante la grabación causando artefactos de movimiento en las imágenes o impidiendo la extracción de señales de precisión de las imágenes.
Los protocolos disponibles públicamente proporcionan solo una breve descripción del procedimiento experimental, viviendo partes sustanciales de los detalles, como las técnicas de montaje preciso de la solidificación de agarosa y el posicionamiento simple. Por lo tanto, se necesita un protocolo efectivo y reproducible para adquirir datos de imagen de alta calidad. Con un mínimo de ruido y movimiento.
Nuestro protocolo proporciona un procedimiento experimental optimizado y reproducible. Este protocolo permite obtener imágenes in vivo de todo el cerebro durante un período prolongado y visualizaciones de los datos de imágenes adquiridos. El flujo de trabajo se centró en imágenes de todo el cerebro, pero se puede aplicar fácilmente a la obtención de imágenes de otros órganos de muchos de nuestros peces cebra.
Nuestro objetivo es desentrañar los principios subyacentes de la computación neuronal. Para eso, continuaremos trabajando en una tubería que involucre imágenes a gran escala de la actividad y estructura neuronal y el análisis computacional de tales para el mapeo cerebral sistemático.
Descripción general
Este artículo presenta un protocolo detallado para la obtención de imágenes in vivo de todo el cerebro de peces cebra larvales utilizando microscopía de fluorescencia tridimensional. El modelo de pez cebra es preferido debido a su transparencia óptica y accesibilidad genética para estudiar el cálculo y la actividad neural. El protocolo aborda problemas comunes como artefactos por movimiento y aberraciones del gel de agarosa, asegurando la adquisición de datos de imágenes de alta calidad.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biofísica
- Técnicas de imagen
Antecedentes
- Los peces cebra larvales son un modelo esencial para estudios de neuroactividad debido a su transparencia.
- Los desafíos significativos incluyen aberraciones provocadas por el gel de agarosa y artefactos de movimiento durante la obtención de imágenes.
- Los protocolos actuales carecen de pasos detallados para el montaje y posicionamiento eficaz de muestras.
- La obtención de imágenes de alta resolución es fundamental para comprender el cálculo neural.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un protocolo reproducible para obtener imágenes de alta calidad de la actividad cerebral del pez cebra.
- Reducir el ruido y los artefactos por movimiento durante las sesiones de adquisición de imágenes.
- Facilitar el estudio del cómputo neuronal durante períodos prolongados.
Métodos Utilizados
- La plataforma principal utilizada es la microscopía de fluorescencia tridimensional.
- El modelo biológico implica peces cebra larvales, preparados e inmovilizados para la obtención de imágenes.
- Se establece un flujo de trabajo experimental optimizado para garantizar artefactos mínimos.
- Los pasos críticos incluyen la colocación precisa del pez cebra y los ajustes correctos de los parámetros de imagen.
- La visualización de los datos adquiridos se logra mediante herramientas de software como napari.
Resultados principales
- El protocolo de imagen permite la visualización completa de áreas cerebrales, incluyendo estructuras neuronales en el prosencéfalo, mesencéfalo y rombencéfalo.
- La actividad neuronal puede registrarse mediante imágenes de series temporales, revelando hallazgos importantes sobre las funciones neuronales.
- La visibilidad nítida de todas las regiones cerebrales indica la eficacia del protocolo.
Conclusiones
- Este estudio demuestra un enfoque de imagen novedoso que mejora la comprensión de la neuroactividad del pez cebra.
- El protocolo no solo establece un estándar para la imagen del pez cebra, sino que también tiene implicaciones para investigaciones neuronales más amplias.
- Se anticipa que el desarrollo adicional de tuberías de imagen mejore los estudios de mapeo cerebral y de cálculo neuronal.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La imagen tridimensional de fluorescencia de cerebros de larvas de pez cebra permite la cartografía de alta resolución in vivo de la estructura y actividad neural, apoyando el descubrimiento en etapas tempranas de la neurociencia. Este protocolo aborda la reproducibilidad y la reducción de artefactos, proporcionando una base sólida para la desactivación de mecanismos de riesgo y la validación de objetivos en la investigación neurobiológica. Su adaptabilidad y sus resultados cuantitativos lo posicionan como una capacidad reutilizable para los procesos de I+D empresariales centrados en el análisis de circuitos neuronales y en cribados funcionales.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación sistemática de las vías neuronales y la actividad celular en un modelo vertebrado.
- Apoya la reducción de riesgos biológicos al minimizar artefactos por movimiento y aberraciones de imagen.
- Facilita la confianza predictiva en la identificación de dianas neuronales mediante datos cuantitativos de todo el cerebro.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Prepara muestras de pez cebra inmovilizadas y validadas para flujos de trabajo de imagen reproducibles.
- Normaliza los parámetros de imagen y la posición de las muestras para garantizar la consistencia del ensayo.
- Genera datos cuantitativos volumétricos y series temporales adecuados para análisis posteriores y cribado.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Proporciona un sistema vertebrado relevante para la enfermedad para la cartografía funcional de circuitos neuronales.
- Permite la continuidad desde el descubrimiento mediante imágenes hasta el desarrollo de modelos preclínicos para compuestos neuroactivos.
- Apoya el avance ajustado al riesgo al ofrecer resultados de imágenes de alto contenido y reproducibles.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este protocolo de imagen se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la fase preclínica, permitiendo la comprobación de hipótesis, la cartografía de vías y el análisis cuantitativo en modelos de neurociencia vertebrados.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la cartografía basada en hipótesis de la actividad y estructura neural con resolución celular.
- Tamizaje: Proporciona resultados de imágenes cuantitativas y reproducibles para estudios con compuestos o perturbaciones genéticas.
- Análisis: Ofrece conjuntos de datos volumétricos y series temporales para análisis computacional y comparación entre diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Se alinea con el desarrollo de modelos preclínicos al permitir imágenes funcionales en un sistema vertebrado.
- Reutilización Empresarial: El protocolo es adaptable para la obtención de imágenes de otros órganos o sistemas en pececillos cebra larvales, lo que favorece la escalabilidad de la plataforma.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de dianas neuronales.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y la estandarización entre experimentos de imagen.
- Valor estratégico: Mejora la toma de decisiones de avance/no avance y la eficiencia del capital en carteras de neurociencia.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de dianas neuronales y ensayos funcionales.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo, inmovilización e imágenes de microscopía de fluorescencia de pez cebra.
- Exige acceso a plataformas de imágenes de fluorescencia confocales o personalizadas y herramientas computacionales de análisis.
- Necesita estandarización entre equipos en cuanto a la preparación de muestras y los parámetros de imagen.
- Es adaptable a otros órganos de larvas de pez cebra, aunque puede requerir optimización del protocolo para diferentes tejidos.
- Entre las limitaciones potenciales se incluyen artefactos de imagenación procedentes del agarosa y el movimiento si la inmovilización es incompleta.
