Name: Uso de la plataforma de tejido de barrera MicroSiM (μSiM) para modelar la barrera hematoencefálica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T12:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Aprende a usar la plataforma MicroSiM para modelar la barrera hematoencefálica in vitro con células madre pluripotentes humanas. Este método permite estudiar cómo la inflamación sistémica afecta la integridad de la barrera cerebral.

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J.L.M., B.E., T.R.G., M.C.M., P.K., M.T., K.C. y L.W. fueron financiados por la subvención R33 HL154249 de los NIH. J.L.M. fue financiado por R44 GM137651. M.M. fue financiado por el Premio del Programa Schmidt del Instituto Del Monte de Neurociencia, Universidad de Rochester. M.T. fue financiado por RF1 AG079138. K.C. fue financiado por la Fundación Internacional para la Investigación Ética.

Análisis de modelos de barrera hematoencefálica mediante tinción de inmunofluorescencia

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J.L.M. es cofundador de SiMPore y tiene una participación accionaria en la empresa. SiMPore está comercializando tecnologías ultrafinas basadas en silicio, incluidas las membranas utilizadas en este estudio.

Si bien las virutas de membrana han sido diseñadas para brindar estabilidad, pueden agrietarse o romperse si se manipulan incorrectamente durante el ensamblaje. Por lo tanto, es fundamental agarrar el chip en las muescas de la pinza de virutas y colocarlo suavemente en el accesorio. Al manipular los dispositivos en general, se deben tomar precauciones adicionales para no golpear ni dejar caer los dispositivos. Durante la unión de la viruta de membrana al accesorio A1, el chip debe colocarse plano y centrado en el pilar del accesorio A1 para evitar que la membrana se agriete durante la unión al componente 1. Además, se debe evitar cualquier contacto con las capas de PSA expuestas después de quitarse las máscaras protectoras. Al manipular el componente 2 después de quitar las máscaras protectoras, es aconsejable sostenerlo a lo largo del borde del componente y usar pinzas para agarrar la esquina triangular que no tiene PSA.
Si bien se describieron protocolos de cultivo celular para posibles modelos de BHE, el modelo de cocultivo BMEC/pericito de la BHE descrito aquí puede ser suficiente o insuficiente dependiendo del contexto fisiológico y de las cuestiones de interés. Por ejemplo, el tráfico de células inmunitarias se produce principalmente en las vénulas postcapilares del cerebro41,42. En estas regiones, un espacio perivascular separa la barrera BMEC/pericitos de los limitantes gliales establecidos por los astrocitos. Por lo tanto, en las vénulas postcapilares, la unidad neurovascular (VU) comprende dos barreras físicamente separadas en serie, y los pies terminales astrocíticos no entran en contacto directo con la barrera sanguínea BMEC/pericitos, que está bien representada por el modelo actual. Si el objetivo es un modelo de NVU que tenga en cuenta el impacto de los factores secretados por los astrocitos en la barrera hematológica, se podría añadir un compartimento de astrocitos al dispositivo que permita el intercambio de factores solubles a través del espacio perivascular. Este ejemplo se ilustró anteriormente34 y podría ampliarse para incluir otras células, como la microglía y las neuronas, en un compartimento "cerebral" 3D. La arquitectura modular de la plataforma permite utilizar estrategias de ensamblaje simples para lograr estas reconfiguraciones, de modo que la plataforma sea tan simple o compleja como sea necesario para abordar las hipótesis en cuestión. Cada configuración de cultivo celular; sin embargo, debe optimizarse para nuevas líneas celulares y multicultivos. Por ejemplo, debido a las propiedades de las membranas de nitruro de silicio, es posible que sea necesario ajustar las soluciones de recubrimiento en comparación con las placas de cultivo de tejidos. La inclusión de fibronectina generalmente ayuda en la unión celular y la supervivencia. Además, los usuarios podían cultivar células endoteliales y pericitos en direcciones opuestas. En este caso, puede ser necesario modificar, por ejemplo, la forma en que se realizan e interpretan las mediciones de permeabilidad. Sin embargo, proporcionar pasos para este tipo de cultura está más allá del alcance de este documento.
Otro desafío que se puede encontrar durante el cultivo celular es la rápida evaporación de los medios, ya que los dispositivos pueden ser más sensibles a las alteraciones en el medio ambiente en comparación con las placas y matraces estándar de cultivo de tejidos. Si se observa un exceso de evaporación o se ralentiza el crecimiento celular, se deben medir todos los parámetros críticos de la incubadora para garantizar ajustes precisos. Se puede agregar más agua a la tapa de tejido o a la pequeña placa de Petri colocada dentro de la cámara de cultivo celular, o se deben intercambiar medios con más frecuencia. Además, las burbujas pueden entrar en el canal inferior y atascarse en la zanja para los dispositivos de excavación de zanjas. Si bien se pueden eliminar, es más fácil evitar agregar burbujas en primer lugar. Para ello, es importante comprobar que no haya burbujas en la punta de la pipeta ni aire en el extremo de la punta de la pipeta antes de pipetear los medios en la cámara inferior. Además, la evaporación de los medios en el canal puede provocar un espacio entre la superficie de los medios y la parte superior del puerto. Se puede pipetear un pequeño volumen de medios en un puerto hasta que el medio llegue a la superficie del puerto opuesto, después de lo cual los medios se pueden intercambiar en ese puerto opuesto. Si bien los medios hECSR y E6 + 10% FBS no deben calentarse en el baño de agua, otros medios se pueden precalentar para reducir la formación de burbujas. Si entra una burbuja en la cámara inferior, se puede eliminar pipeteando rápidamente 100 μL a través del canal. Sin embargo, este método puede provocar contaminación entre cámaras o medios derramados por la superficie del dispositivo. También puede alterar las capas celulares. Alternativamente, los medios se pueden eliminar primero del canal y luego volver a introducirse con un volumen de 50 μL. Sin embargo, quitar primero los medios puede dar lugar a una mayor formación de burbujas en el canal. Si una burbuja no está directamente debajo del área de la membrana, puede dejarse en el canal sin efectos sobre el cultivo celular.
La adhesión y el crecimiento de los pericitos, como se demuestra en la Figura 2, pueden ser un desafío. El uso de una densidad de siembra optimizada es esencial para la formación de una capa con una proporción de células pericitos a endoteliales fisiológicamente relevante. Además, como los pericitos son sensibles al cizallamiento, todos los intercambios de medios en el canal deben realizarse muy lentamente para proteger las células. Para el cultivo de BPLC, se puede lograr una mejor adhesión recubriendo la cámara inferior con 800 μg/mL de colágeno tipo IV o 100 μg/mL de fibronectina.
La inmunocitoquímica en los dispositivos aquí descritos permite el análisis cualitativo de la salud y la función celular. Los métodos de tinción en placas de cultivo de tejidos u otras plataformas deben ser directamente traducibles a la plataforma. Para el cultivo celular solo en la cámara superior, después de la fijación, se puede agregar PBS en la cámara inferior y dejarse para los pasos restantes, con el bloqueo y la tinción realizados solo en la cámara superior. Esto minimiza los riesgos de romper las membranas o de que entren burbujas en la cámara inferior. Para la tinción de cocultivo, recomendamos utilizar ambas cámaras en todos los pasos. Es importante tener en cuenta que la viscosidad del fijador y PBS es diferente a la de los medios. Por lo tanto, puede ser más fácil agregar burbujas en la cámara inferior, y se debe tener especial cuidado al verificar si hay aire en las puntas de las pipetas en el extremo de la punta antes de pipetear en la cámara inferior.
El protocolo descrito para el ensayo de permeabilidad de moléculas pequeñas permite la evaluación funcional y cuantitativa de la función barrera de las células endoteliales cultivadas en el dispositivo μSiM. Un problema que puede surgir durante este ensayo es la extracción de burbujas de aire en la pipeta durante la recogida de muestras desde el canal inferior en el paso del protocolo 4.1.7.4. Para evitar este problema, es importante asegurarse de que la punta esté sellada en el puerto antes de comenzar la recolección de muestras y que la muestra no se extraiga demasiado rápido. Si eso no resuelve el problema, el tamaño de las puntas utilizadas puede ser demasiado pequeño o demasiado grande para caber en los puertos; utilice los consejos que se enumeran en la Tabla de materiales. Si se miden valores de permeabilidad inesperadamente altos a pesar de una monocapa confluente de aspecto saludable, se debe comprobar la integridad de la monocapa para detectar alteraciones durante la recogida de muestras. Recomendamos comprobar siempre la monocapa bajo el microscopio inmediatamente después de la recogida de la muestra. Si la monocapa sigue intacta y sana, se puede fijar la muestra y evaluar los marcadores biológicos de la función de barrera, por ejemplo, mediante inmunotinción de las proteínas de unión. Por el contrario, si se miden valores de permeabilidad inesperadamente bajos, es importante asegurarse de que se muestrean 50 μL de medio desde el canal inferior sin burbujas de aire. Si el medio sale del puerto de muestreo tan pronto como se coloca la punta del depósito, ese medio debe recogerse antes de colocar la pipeta en el puerto de muestreo, ya que la mayor parte de la pequeña molécula fluorescente estará presente en el volumen inicial de 10 μL muestreado desde el canal inferior. Dibujar círculos alrededor de los puertos con un bolígrafo hidrofóbico o colocar una cinta hidrofóbica con un orificio alrededor del puerto evita que se extiendan los medios bombeados pasivamente. Si se retiran burbujas durante el muestreo o no se retira la muestra completa de 50 μl, no se debe utilizar la muestra. Alternativamente, se puede determinar el volumen exacto y utilizarlo en el cálculo de la permeabilidad; sin embargo, esto solo debe hacerse si el volumen eliminado es de ≥40 μL, lo que corresponde a ~98-99% de recuperación de colorante34.

Los tejidos vivos están compartimentados por células especializadas que crean y mantienen barreras y regulan qué células y moléculas se transportan de un compartimento a otro. La regulación inadecuada de las funciones de barrera puede ser el origen tanto de enfermedades agudas como de enfermedades crónicas. La barrera hematoencefálica (BHE) es la barrera tisular más restrictivadel cuerpo humano. La disfunción de la barrera hematoencefálica subyace a una amplia gama de enfermedades del sistema nervioso central (SNC), como la enfermedad de Alzheimer2, la enfermedad de Parkinson3,4 y la esclerosis múltiple 5,6. La lesión de la barrera hematoencefálica también está relacionada con el deterioro cognitivo a largo plazo como resultado de trastornos agudos, como la sepsis7, la COVID-198 y el delirio postoperatorio9. El desarrollo de fármacos con el potencial de tratar trastornos cerebrales ha sido frustrantemente difícil debido al desafío de romper intencionalmente la barrera hematoencefálica para entregar moléculas bioactivas a objetivos enel cerebro. Por estas razones, los métodos para estudiar la función de la BHE in vitro son de suma importancia para la comprensión y el tratamiento de las enfermedades del SNC.
Los métodos básicos para medir la función barrera in vitro implican el establecimiento de una monocapa o cocultivo sobre una membrana semipermeable y la medición de la resistencia impartida por las células a la difusión de moléculas pequeñas o a las pequeñas corrientes eléctricas11,12,13,14. Si bien la aparición de los sistemas microfisiológicos (MPS) ha producido una gran cantidad de opciones para modelar la BHE en 3D15,16, la diversidad de geometrías de los sistemas dificulta la comparación de las mediciones de permeabilidad entre MPS o con los valores establecidos en la literatura. El establecimiento de valores basales confiables es particularmente importante en la investigación de BHE donde, debido a la extensa regulación de barrera por parte de las células endoteliales vasculares cerebrales, los valores de permeabilidad in vitro son altamente examinados 12,17,18. Por estas razones, las mediciones de permeabilidad a través de monocapas establecidas en membranas 2D seguirán siendo un elemento básico en los estudios de BBB en los próximos años. Esto es válido para otras barreras tisulares, incluidas las barreras epiteliales, donde los valores absolutos de permeabilidad basal se utilizan para validar y comparar modelos in vitro 19,20,21.
Con el objetivo de establecer una nueva herramienta valiosa para la comunidad de investigación de BBB, hemos introducido 22 yavanzado 23,24,25,26 el microdispositivoque presenta una plataforma de embrano de silicio (μSiM) para su uso en el modelado de tejido de barrera durante los últimos 5 años. La característica habilitante de la plataforma es una membrana ultrafina (<100 nm de espesor) con cientos de millones de nanoporos 27,28 o una mezcla de nanoporos y microporos29. Los chips de membrana independientes se producen en un "chip" de silicio de 300 μm que estabiliza las estructuras ultrafinas30 y permite manipularlas con pinzas para el montaje del dispositivo. Debido a su naturaleza ultrafina, las membranas tienen una permeabilidad que es dos órdenes de magnitud superior a la de las membranas convencionales grabadas con trazas utilizadas en dispositivos comerciales de cultivo de membranas31,32. En la práctica, esto significa que el obstáculo de la membrana para la difusión de moléculas más pequeñas que los nanoporos (<60 nm) es insignificante33. Por lo tanto, para las barreras celulares, solo las células y las matrices que depositan determinarán la velocidad de transporte de moléculas pequeñas desde los compartimentos apicales a los basales que están separados por la membrana34. El diseño del dispositivo y la naturaleza ultrafina de las membranas también proporcionan muchas ventajas para la microscopía óptica. Estos incluyen 1) la capacidad de seguir cultivos vivos utilizando contraste de fase o imágenes de campo claro, 2) la capacidad de teñir con fluorescencia e imágenes in situ sin la necesidad de extraer y transferir la membrana a un cubreobjetos, y 3) el hecho de que las membranas son más delgadas que las "rebanadas" confocales, de modo que los cocultivos directos tienen un espaciado más natural entre los tipos de células que el que se puede lograr con membranas grabadas con pistas de 6-10 μm de espesor.
Más recientemente, hemos avanzado la plataforma a un formato modular para facilitar el montaje rápido34 y la personalización35,36. Aprovechamos el formato modular para distribuir los componentes de los dispositivos entre nuestros laboratorios de bioingeniería y los laboratorios colaboradores de barrera cerebral. A continuación, desarrollamos conjuntamente protocolos para el ensamblaje de dispositivos, el monocultivo y el cocultivo, la tinción inmunofluorescente y la permeabilidad de moléculas pequeñas, y demostramos que estos métodos eran reproducibles entre laboratorios. Utilizando estos protocolos, también demostramos que la plataforma modular es compatible con una BHE validada desarrollada utilizando el método de cultivo endotelial extendido (EECM) para crear células endoteliales cerebrales de tipo microvascular (BMEC) a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs)37. El propósito del presente informe es revisar estos métodos con mayor detalle y, con la ayuda del video que lo acompaña, facilitar una adopción más amplia de la plataforma en la comunidad BBB.

<table><tbody><tr><td><Anticuerpos fuertes></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD31 Anticuerpo policlonal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PA5-32321</td><td></td></tr><tr><td>Claudin-5 anticuerpo IgG de ratón, 4C3C2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35-2500</td><td></td></tr><tr><td>Cabra &alpha;-Ratón IgG Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Cabra &alpha;-Conejo IgG Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11011</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>NG2, ratón IgG2a, 9.2.27</td><td>Millipore</td><td>&nbsp; </td><td></td>MAB2029</tr><tr><td>Anticuerpo IgG de ratón Occludin, OC-3F10</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>33-1500</td><td></td></tr><tr><td>PDGFR&beta;, anticuerpo IgG de conejo, 28E1</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3169</td><td></td></tr><tr><td>VE-cadherin ratón Clon IgG2B # 123413</td><td>R& D Systems</td><td>MAB9381</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo IgG de conejo ZO-1, policlonal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>40-2200</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Químicos, péptidos y proteínas recombinantes</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% Metanol</td><td>VWR</td><td>101443-718</td><td>Se puede sustituir por productos similares</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehído</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td>Se puede sustituir por productos similares</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplemento</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno IV de placenta humana</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5533</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno, solución tipo I de cola de rata</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3867-1VL</td><td>Puede ser sustituido por productos similares</td></tr><tr><td>DMEM/Ham' s F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 Medio de crecimiento de células endoteliales-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>Essential 6 medio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1516401</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Suero</td> pico <td>PS-FB1</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina de plasma bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina de proteína humana, de plasma</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>33016015</td><td>Puede ser sustituido por productos similares</td></tr><tr><td>hESFM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11111044</td><td></td></tr><tr><td>Lucifer Amarillo CH sal de dilitio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>861502</td><td></td></tr><tr><td>Suero de cabra normal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>500627</td><td>Puede ser sustituido por productos similares</td></tr><tr><td>PBS sin calcio, magnesio</td><td>Cytiva</td><td>SH30256.01</td><td>Puede ser sustituido por productos similares</td></tr><tr><td>Medio de pericito</td><td>ScienCell</td><td>1201</td><td>Utilice el kit completo (incluye suplementos)</td></tr><tr><td>Poly-L-Lisina, 10 mg/mL</td><td>ScienCell</td><td>0413</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>JT Baker</td><td>X198-05</td><td>Se puede sustituir por productos similares</td></tr><tr><td>Agua destilada ultrapura sin DNasa/RNasa</td><td>Invitrogen&comercio;</td><td>10977015</td><td>Puede ser sustituido por productos similares</td></tr><tr><td><fuerte>Modelos experimentales: Líneas celulares</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>barrera hematoencefálica hCMEC/D3 línea celular</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SCC066</td><td></td></tr><tr><td>Pericitos vasculares cerebrales humanos</td><td>ScienCell</td><td>1200</td><td></td></tr><tr><td>iPS(IMR90)-4 células madre pluripotentes inducidas humanas</td><td>WiCell</td><td>RRID:CVCL_C437</td><td></td></tr><tr><td>Cristalería y artículos de plástico</resistente></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>150 mm Placa de cultivo celular tratada con TC con</td> abrazaderas de <td>353025</td><td></td><td>Grid Falcon</td> de 20 mm</tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>MFLX06832-10</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos Corning (6 pocillos)</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Microplacas planas no aglomerantes de 96 pocillos</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655900</td><td></td></tr><tr><td>Soporte para dispositivo de portaobjetos de microscopio</td><td>&nbsp; SiMPore</td><td>USIM-SB</td><td>Dimensiones compatibles con los soportes de portaobjetos de microscopio</td></tr><tr><td>Nunc 15 mL Tubos de centrífuga de polipropileno estériles cónicos</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 50 mL Tubos de centrífuga de polipropileno estériles cónicos Los tapones de</td> los tubos <td>Thermo Fischer</td><td>339653</td> Scientific <td>se pueden llenar con agua para el cultivo celular Puntas</td></tr><tr><td>de pipeta P20-200</td><td>VWR</td><td>76322-516</td><td>Es posible que las marcas alternativas no sellen con la misma eficacia en los puertos</td></tr><tr><td>Filtros Transwell (12 pocillos, 12 mm, 0,4 y mu; m tamaño de poro, PC)</td><td>CoStar</td><td>3401</td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X Objetivo (para Andor)</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>MRD00105</td><td>Aire; WD: 4 mm; NA 0.45</td></tr><tr><td>Objetivo 10X (para Nikon)</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>MRP40102</td><td>Aire; WD: 6,2 mm; NA 0.25</td></tr><tr><td>Objetivo 40X (LWD) (Para Andor)</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>MRD77410</td><td>Inmersión en agua; WD: 590-610 mm; NA 1.15</td></tr><tr><td>Andor Spinning Disc Microscopio confocal</td><td>Oxford Instruments, Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ts2 Microscopio de contraste</td><td>de fase Nikon Instruments Inc.</td><td></td><td>Se puede sustituir por productos similares</td></tr><tr><td>TECAN Infinite M200</td><td>TECAN</td><td></td><td>Se puede sustituir por productos similares</td></tr><tr><td><fuerte>Otro</fuerte></td>Avanzado Pluma PAP Millipore Sigma Se recomienda una punta de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Z672548</td> de <td>2 mm</td></tr><tr><td>Kit de montaje con accesorios</td><td>SiMPore</td><td>USIM-JIGSET</td><td>Incluye fijación A1, A2, B1 y B2</td></tr><tr><td>Adaptador de cámara para microscopios</td><td>AmScope</td><td>CA-CAN-SLR Canon SLR / D-SLR</td><td>&Phi; 23.2 - &Phi; 30 adaptador para Nikon Eclipse Ts2</td></tr><tr><td>Canon EOS Rebel SL3 DSLR Cámara</td><td>Canon</td><td>EOS 250D, BH #CAEDRSL3B, MFR #3453C001</td><td>Se puede sustituir por productos similares</td></tr><tr><td>Filtro de celdas, 40 y micro; m</td><td>Millipore Sigma (Corning)</td><td>CLS431750</td><td></td></tr><tr><td>Componente 1</td><td>SiMPore</td><td>USIM-C1</td><td></td></tr><tr><td>Componente 2</td><td>SiMPore</td><td>USIM-C2</td><td></td></tr><tr><td>Chips de membrana</td><td>SiMPore</td><td>NPSN100-1L</td><td>Otros formatos de chips están disponibles Pinza de</td></tr><tr><td>manejo SMD doble ángulo</td><td>Techni-Tool</td><td>758TW003</td><td>"Pinzas para virutas"</td></tr><tr><td>Inoxidable pinza de precisión de acero GG</td><td>Techni-Tool</td><td>758TW534</td><td>"Pinzas rectas"</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>ImageJ</td><td></td><td>Para el procesamiento de imágenes</td></tr><tr><td>Fusion</td><td>Oxford Instruments, Andor</td><td></td><td>Instrucciones para la versión 2.3.0.44</td></tr><tr><td>i-control</td><td>TECAN</td><td></td><td>Instrucciones para la versión 2.0</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>Para el procesamiento de imágenes. Instrucciones para la versión 9.9.0</td></tr></tbody></table>

uso de la plataforma de tejido de barrera microsim (μsim) para modelar la barrera hematoencefálica

Use of the MicroSiM (&#181;SiM) Barrier Tissue Platform for Modeling the Blood-Brain Barrier

El microSiM (μSiM) es una plataforma de cultivo basada en membranas para modelar la barrera hematoencefálica (BBB). A diferencia de las plataformas convencionales basadas en membranas, el μSiM proporciona a los experimentadores nuevas capacidades, como la obtención de imágenes de células vivas, la señalización paracrina sin obstáculos entre las cámaras de "sangre" y "cerebro", y la capacidad de obtener imágenes directas de la inmunofluorescencia sin necesidad de extraer/volver a montar las membranas. Aquí demostramos el uso básico de la plataforma para establecer modelos de monocultivo (células endoteliales) y cocultivo (células endoteliales y pericitos) de la BHE utilizando membranas nanoporosas ultrafinas de nitruro de silicio. Demostramos compatibilidad tanto con cultivos celulares primarios como con cultivos de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC). Proporcionamos métodos para el análisis cualitativo de modelos de BBB mediante tinción de inmunofluorescencia y demostramos el uso de μSiM para la evaluación cuantitativa de la función de barrera en un ensayo de permeabilidad de moléculas pequeñas. Los métodos proporcionados deberían permitir a los usuarios establecer sus modelos de barrera en la plataforma, avanzando en el uso de la tecnología de chips de tejido para estudiar tejidos humanos.

El montaje de un dispositivo de excavación de zanjas se muestra en la Figura 1. Los accesorios guían el ensamblaje de los componentes y el chip de membrana. El componente 1 es principalmente acrílico con una superficie PSA para adherirse al chip y una abertura en la cámara inferior y puertos para el acceso de la pipeta a la cámara inferior. El componente 2 es la capa de canal y contiene un "triángulo" no adhesivo y sin PSA en la parte superior derecha para el agarre. Los dispositivos de zanja hacia abajo proporcionan un área de crecimiento de cultivo celular plana en la cámara superior, mientras que los dispositivos de zanja hacia arriba tienen una superficie plana para el cultivo celular en la cámara inferior.
Realizamos monocultivos endoteliales y cocultivos de hCMEC/D3 y HBVP y de células similares a EECM-BMEC derivadas de hiPSC IMR90-4 y BPLC y adquirimos imágenes de fase utilizando un microscopio de contraste de fase Nikon Eclipse Ts2 y un objetivo de 10x (Figura 2). Se muestran las densidades óptimas de siembra para el cultivo celular primario (imágenes tomadas 1 día después de la siembra), así como las HBVP subsembradas (Figura 2A). Las imágenes finales de la fase de cocultivo y monocultivo (6 días de cultivo de células endoteliales) pueden ser difíciles de distinguir (Figura 2C), y la confirmación de un cocultivo celular primario exitoso puede requerir tinción con inmunofluorescencia (ver sección 3 del protocolo). También se ilustran las densidades de siembra de BPLC derivadas de hiPSC bajas, altas y óptimas (Figura 2B). El cocultivo derivado de hiPSC es más claro de distinguir en las imágenes de contraste de fase en comparación con los cocultivos primarios (Figura 2D). La siembra baja de BPLC da como resultado una cobertura deficiente de pericitos y aglomeración de pericitos, mientras que la resiembra da como resultado que la capa de pericitos se desprenda de la membrana. Además, el intercambio del medio en la cámara inferior demasiado rápido puede resultar en la pérdida de pericitos, ya que estas células son muy sensibles al cizallamiento. La cobertura óptima de los pericitos es de ~90% para un modelo de BBB, sin huecos en la capa endotelial.
En la Figura 3 (6 días de cultivo de células endoteliales) se ilustran imágenes representativas del cocultivo derivado de hiPSC teñido con inmunocolor. Los BPLC derivados de IMR90-4 se tiñeron para el marcador de pericitos PDGFRβ, y las células similares a EECM-BMEC derivadas de IMR90-4 se tiñeron para el marcador de unión adherente VE-cadherina. Hoechst se utilizó para teñir los núcleos. Las imágenes se adquirieron en un microscopio confocal de disco giratorio utilizando un objetivo LWD de 40x con cortes de 0,2 μm y se procesaron con Imaris. Ambas capas celulares se pueden visualizar aunque no se vea la nanomembrana delgada.
Realizamos el ensayo de permeabilidad de moléculas pequeñas basado en muestreo utilizando las mismas condiciones experimentales en dos laboratorios físicamente distantes en la Universidad de Berna, Suiza, y la Universidad de Rochester, NY, EE. UU. para demostrar la reproducibilidad interlaboratorio de los resultados (Figura 4)34. Las células similares a EECM-BMEC derivadas de hiPSC IMR90-4 se cultivaron en el dispositivo μSiM durante 2, 4 o 6 días y en filtros transwell durante 6 días. El ensayo se realizó utilizando 150 μg/mL de Amarillo de Lucifer (457 Da) en ambos laboratorios. La alta variabilidad en la permeabilidad de las células endoteliales cultivadas durante 2 días en el dispositivo indica que 2 días de cultivo fueron insuficientes para la maduración de la barrera. No hubo diferencias significativas en la permeabilidad entre los laboratorios tras la maduración de la barrera, a partir de los 4 días. También demostramos que la permeabilidad de las células endoteliales cultivadas en filtros μSiM y transwell durante 6 días coincidía con la publicada previamente40.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65258/65258fig01.jpg"> Figura 1: Pasos del ensamblaje de μSiM . (A) Prepare el chip colocándolo en el accesorio A1. Coloque la zanja de viruta hacia arriba para un dispositivo final de zanja. Coloque la zanja de viruta hacia abajo para un dispositivo de zanja final. (B) Unir el componente 1 al chip quitando las máscaras protectoras del componente 1 y colocándolo boca abajo en FA1. Pega aplicando presión con el accesorio A2. (C) Unir el componente 2 y el componente 1 retirando el componente 2 de su hoja y despegando las capas protectoras superiores. Coloque el canal hacia arriba en el dispositivo B1 y coloque el componente 1 encima del componente 2 boca arriba. Pega aplicando presión con el accesorio B2. Abreviaturas: FAn = fixture An; FBn = fixture Bn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65258/65258fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65258/65258fig02.jpg"> Figura 2: Esquema de las imágenes de cocultivo y contraste de fase representativas del cultivo celular en dispositivos. (A) Localización de la siembra de pericitos y células endoteliales. (B) Esquema de vista lateral de las ubicaciones de las celdas a través de la zanja del chip de membrana. (C) Imágenes representativas de densidades de siembra bajas y óptimas para la línea celular endotelial cerebral primaria HBVP y hCMEC/D3. Las imágenes se adquirieron 1 día después de la siembra (HBVP) y 2 h después de la siembra (hCMEC/D3). (D) Imágenes representativas de densidades de siembra bajas, altas y óptimas para células similares a pericitos cerebrales derivadas de hiPSC. Las imágenes se adquirieron 1 día después de la siembra. (E) Imágenes representativas del cocultivo final de HBVP y hCMEC/D3 y del monocultivo de hCMEC/D3. Las imágenes se adquirieron 8 días después de la siembra de HBVP y 7 días después de la siembra de hCMEC/D3. (F) Imágenes representativas de cocultivo celular fallido y exitoso de BPLC y EECM-BMEC y monocultivo celular similar a EECM-BMEC. Las imágenes se adquirieron 7 días después de la siembra de BPLC y 6 días después de la siembra de EECM-BMEC. Los cultivos de BPLC subsembrados no tienen suficiente cobertura, mientras que los cultivos de BPLC que se resembran crecerán en exceso y comenzarán a agruparse o retroceder. Barras de escala = 100 μm (C-F). Abreviaturas: HBVP = pericitos vasculares cerebrales humanos; hiPSC = célula madre pluripotente inducida humana; BPLC = células cerebrales similares a los pericitos derivadas de hiPSC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65258/65258fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65258/65258fig03.jpg"> Figura 3: Imágenes representativas del cocultivo celular derivado de hiPSC teñido con inmunoalimentación en dispositivos. Las células se tiñeron para el marcador de células endoteliales VE-cadherina (verde), el marcador de pericitos PDGFRβ (rojo) y la tinción nuclear (azul). Se pueden ver dos capas de células muy próximas, separadas solo por una delgada nanomembrana de nitruro de silicio (la flecha blanca marca la ubicación de la membrana en la imagen de la izquierda). Barra de escala = 50 μm. Abreviaturas: hiPSC = célula madre pluripotente inducida humana; PDGFRβ = receptor beta del factor de crecimiento derivado de plaquetas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65258/65258fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65258/65258fig04.jpg"> Figura 4: Ensayo de permeabilidad de moléculas pequeñas basado en muestreo . (A) Esquema del flujo de trabajo experimental. (B) Demostración de la reproducibilidad entre laboratorios entre dos laboratorios físicamente distantes en la Universidad de Berna (UniBe), Suiza, y la Universidad de Rochester (UR), NY, EE.UU.: las células endoteliales derivadas de hiPSC se cultivaron en el dispositivo μSiM durante 2, 4 o 6 días y en filtros transwell durante 6 días. El ensayo de permeabilidad se realizó con 150 μg/mL de amarillo de Lucifer (457 Da). La barra roja indica los datos de permeabilidad de fluoresceína sódica (376 Da) publicados anteriormente de las mismas células endoteliales derivadas de hiPSC cultivadas durante 6 días en filtros transwell40. N = 4-16 por grupo. Se utilizó ANOVA de dos vías con la prueba post hoc de Tukey, y las comparaciones solo se mostraron para p relevantes &lt; 0,05. C) Demostración de la respuesta a las citocinas utilizando células similares a EECM-BMEC derivadas de hiPSC cultivadas en el μSiM durante 2 días; Se añadieron 0,1 ng/mL de TNFα + 2 UI/mL de IFNγ) o control del medio (no estimulado, NS) a la cámara superior durante 20 horas antes del ensayo de permeabilidad utilizando 150 μg/mL de Lucifer Yellow. N = 3 por grupo. Prueba t de Student, p &lt; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65258/65258fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Área de superficie de siembra de la cámara superior</td>
			<td>Volumen del pozo superior</td>
			<td>Área de superficie de siembra de la cámara inferior</td>
			<td>Volumen del canal inferior</td>
		</tr><tr><td>~37 mm2</td>
			<td>100 μL (puede contener ≥115 μL)</td>
			<td>~42 mm2</td>
			<td>10 μL (pipeta 20 μL para evitar burbujas)</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Superficie crítica de μSiM y volúmenes.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Blanco</td>
			<td>Fijador</td>
			<td>Solución de bloqueo</td>
			<td>Dilución</td>
		</tr><tr><td>VE-cadherina</td>
			<td>4 % de PFA o 100 % de MeOH</td>
			<td>5% GS + 0.4% Tx-100 o 10% GS + 0.3% Triton X-100</td>
			<td>1:50</td>
		</tr><tr><td>CD31</td>
			<td>4 % de PFA o 100 % de MeOH</td>
			<td>5% GS + 0.3-0.4% Triton X-100</td>
			<td>1:100</td>
		</tr><tr><td>Claudin-5</td>
			<td>100% MeOH</td>
			<td>5-10% GS + 0.3% Triton X-100</td>
			<td>1:200</td>
		</tr><tr><td>ZO-1</td>
			<td>100% MeOH</td>
			<td>5-10% GS + 0.3% Triton X-100</td>
			<td>1:200</td>
		</tr><tr><td>Ocludina</td>
			<td>100% MeOH</td>
			<td>5-10% GS + 0.3% Triton X-100</td>
			<td>1:50</td>
		</tr><tr><td>PDGFRβ</td>
			<td>4% PFA</td>
			<td>5% GS + 0.4% Triton X-100</td>
			<td>1:100</td>
		</tr><tr><td>NG2</td>
			<td>4% PFA</td>
			<td>5% GS + 0.4% Triton X-100</td>
			<td>1:100</td>
		</tr><tr><td>Cabra α-Ratón IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1:200</td>
		</tr><tr><td>Cabra α-Ratón IgG Alexa Fluor 568</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1:200</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 2: Anticuerpos y métodos de tinción validados para inmunocitoquímica de cocultivo en dispositivos μSiM. Abreviaturas: PFA = paraformaldehído; MeOH = metanol; GS = suero de cabra.
Archivo complementario 1: Plantilla para el cálculo del valor de permeabilidad. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65258/65258_SupplementalFile_SamplingCalcTemplate_Updated.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Este informe proporciona protocolos para el ensamblaje, el cultivo celular y los ensayos en la plataforma μSiM para la construcción de modelos de barrera hematoencefálica.

Uso de la plataforma de tejido de barrera MicroSiM (μSiM) para modelar la barrera hematoencefálica

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, ...

Estamos desarrollando un modelo GI tisular de la barrera hematoencefálica para comprender el impacto de la sepsis en el cerebro y la contribución de los factores transmitidos por la sangre. Uso de células madre pluripotentes inducidas por humanos. Planeamos evaluar la contribución de los factores genéticos a la susceptibilidad de ciertas poblaciones de pacientes.Los desafíos experimentales actuales dentro de la comunidad de chips de tejido son la reproducibilidad de los resultados y la adopción de técnicas por parte de laboratorios externos. Los diseños únicos de chips de tejido, los pequeños volúmenes dentro de los chips de tejido y la falta de ensayos funcionales estándar contribuyen a estos desafíos y, a menudo, limitan a los usuarios a los ensayos basados en fluorescencia como su resultado principal. Los dispositivos Micro simm ofrecen modularidad para un modelado in vitro versátil, una superficie de luz de vidrio ideal para imágenes de estilo de vida de alta resolución y una nanomembrana ultra syn de 100 nanómetros altamente producida, lo que garantiza una diafonía de factor soluble sin fisuras y ensayos de permeabilidad precisos.Con el micro simm, hemos visto que tipos específicos de células tienden a producir más proteínas de la matriz que proporcionan un andamio de soporte alrededor de los vasos sanguíneos del cerebro. Ahora podemos preguntarnos si la inflamación hace que estas mismas células fortalezcan o rompan sus matrices, alterando así la integridad de la barrera. En el futuro, añadiremos otro compartimento al modelo con células verdes como los astrocitos y la microglía para estudiar cómo interactúan esas células con la barrera hematoencefálica en casos de inflamación sistémica como la sepsis.También planeamos investigar causas adicionales de inflamación sistémica como el delirio postoperatorio, superpuesto a la demencia.

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Bioengineering

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Este método se describe cómo aislar e inmortalizar las células endoteliales microvasculares de cerebro de ratón. Se describe un protocolo paso a paso a partir de la homogeneización del tejido cerebral, las fases de digestión, la siembra y la inmortalización de las células. Por lo general, toma alrededor de cinco semanas para obtener una homogénea línea inmortalizada de células endoteliales microvasculares.

Generación de una línea murina Inmortalizado microvascular cerebral célula endotelial como<em&gt; In Vitro</em&gt; Barrera hematoencefálica modelo

Establecimiento de modelos humanos de la barrera sangre-cerebro (BBB) ​​puede beneficiar a la investigación de las condiciones del cerebro asociadas con la acreditación fracaso. Se describe aquí una técnica mejorada para la preparación de un modelo de acreditación de contacto, que permite que el cocultivo de astrocitos humanos y las células endoteliales del cerebro en los lados opuestos de una membrana porosa.

Método mejorado para la preparación de una base de células, Contacto Modelo Humano de la barrera hematoencefálica

Aquí, describimos un modelo murino in vitro de la barrera hematoencefálica que hace uso de la espectroscopia de células de impedancia, con un enfoque en las consecuencias sobre la integridad y permeabilidad de las células endoteliales al interactuar con las células T activadas.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de la barrera sangre-cerebro mediante Espectroscopia de Impedancia: Un enfoque en la interacción de células T de la célula endotelial

El objetivo del protocolo es presentar un procedimiento optimizado para el establecimiento de un modelo de barrera blood - brain (BBB) en vitro basado en las células endoteliales de cerebro porcino primario (pBECs). El modelo muestra alta reproducibilidad, alta tensión y es adecuado para estudios de transporte y tráfico intracelular en el descubrimiento de medicamentos.

Mejor método para el establecimiento de un In Vitro Barrera Blood - Brain modelo basado en las células endoteliales de cerebro porcino

Aquí presentamos un protocolo que describe la configuración de un cellulo en BBB (barrera hematoencefálica)-cultura de membrana porosa poliester Minibrain insertar sistema para evaluar el transporte de biomoléculas o agentes infecciosos a través de una BBB humana y sus impacto fisiológico en las células cerebrales vecinas.

Un modelo de interfaz de sangre-cerebro humano estudiar cruces de barrera por patógenos o medicamentos y sus interacciones con el cerebro

La barrera hematoencefálica (BBB) es una unidad neurovascular multicelular que regula estrechamente la homeostasis cerebral. Mediante la combinación de iPSC shumanos y tecnologías de órgano en chip, hemos generado un chip BBB personalizado, adecuado para el modelado de enfermedades y predicciones de penetrabilidad de fármacos del SNC. Se describe un protocolo detallado para la generación y el funcionamiento del chip BBB.

Generación de un chip de barrera hematoencefálica basada en iPSC humana

Este protocolo describe un método para establecer un modelo in vitro de barrera hematoencefálica humana (BHE). Las células endoteliales y los pericitos se siembran a cada lado de un filtro de inserción (compartimento sanguíneo), y los astrocitos se siembran en el pozo inferior (compartimento cerebral). El modelo caracterizado se utilizó para experimentos de transporte de nanopartículas.

Un sistema celular de triple cultivo que modela la barrera hematoencefálica humana

La barrera hematoencefálica (BHE) desempeña un papel crucial en el mantenimiento de un entorno cerebral estable y saludable. La disfunción de la barrera hematoencefálica se asocia con muchas enfermedades neurológicas. Hemos desarrollado un modelo 3D derivado de células madre de la BHE para investigar la patología cerebrovascular, la integridad de la BHE y cómo la BHE se ve alterada por la genética y la enfermedad.

Reconstrucción de la barrera hematoencefálica in vitro para modelar y atacar terapéuticamente la enfermedad neurológica

Este protocolo describe una plataforma de cultivo celular basada en membranas reconfigurable que integra el formato de pozo abierto con capacidades de flujo de fluidos. Esta plataforma es compatible con los protocolos estándar y permite transiciones reversibles entre los modos de cultivo microfluídico y de pozo abierto, adaptándose a las necesidades de los laboratorios de ingeniería y biociencias.

Transformación de modelos tisulares de barrera estática en sistemas microfisiológicos dinámicos

Se presenta un enfoque de microfluidos para la expresión de matrices de proteínas. El dispositivo consiste en miles de cámaras de reacción controladas por micro-mecánicos válvulas. El dispositivo microfluídico está acoplado a una biblioteca de genes de microarrays-impreso. Estos genes se transcribe y se traduce en un chip, lo que resulta en una matriz de proteína listo para su uso experimental.

Proteínas de alto rendimiento del generador de expresiones utilizando una plataforma de microfluidos

Aprende a usar la plataforma MicroSiM para modelar la barrera hematoencefálica in vitro con células madre pluripotentes humanas. Este método permite estudiar cómo la inflamación sistémica afecta la integridad de la barrera cerebral.

Uso de la plataforma de tejido de barrera MicroSiM (μSiM) para modelar la barrera hematoencefálica

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